植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

1、植植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥物細(xì)胞培養(yǎng)制藥意義意義藥用植物是天然藥物的寶庫藥用植物是天然藥物的寶庫植物細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)藥物的可能途徑植物細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)藥物的可能途徑目前采用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括目前采用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括 （1 1）苷（甙）類：包括皂苷（人參皂苷、三七皂）苷（甙）類：包括皂苷（人參皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、強(qiáng)心苷（強(qiáng)心醇苷、苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、強(qiáng)心苷（強(qiáng)心醇苷、毛地黃毒配質(zhì)衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。毛地黃毒配質(zhì)衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。 （2 2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽甾）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽甾醇、

2、異巖藻甾醇等。醇、異巖藻甾醇等。 20R 原人參二醇 R=H20R 原人參三醇 R=-OH20S 原人參三醇 R=-OH20S 原人參二醇 R=HHOHOHO2017141310HHHHHOHOR8H2017141310HHHHOR8HRHO173強(qiáng)心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇甾醇（3 3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。（4 4）醌類：包括蒽醌、萘醌等。）醌類：包括蒽醌、萘醌等。（5 5）蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑）蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑。植物病毒抑制劑、植物抗生素等。制劑。植物病毒抑制劑、植物抗生素等。（6 6）黃酮類：具有）黃酮類

3、：具有C6-C3-C6C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，生物合成結(jié)構(gòu)，生物合成前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A A。多為。多為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。OOOOOOOHNOCH3OCH3OOOH+-小檗堿小檗堿蒽醌蒽醌黃酮黃酮植植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥進(jìn)展物細(xì)胞培養(yǎng)制藥進(jìn)展 第一個(gè)專利：第一個(gè)專利： 19561956年年RoutinRoutin和和NickellNickell首次數(shù)提出首次數(shù)提出利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的第一個(gè)專利利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的第一個(gè)專利 工業(yè)植物生物技術(shù)工業(yè)植物生物技術(shù) ：2020世紀(jì)世紀(jì)9090

4、年代明確提出年代明確提出 已經(jīng)從已經(jīng)從 200200余種藥用植物獲得了愈傷組織或細(xì)胞懸余種藥用植物獲得了愈傷組織或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物（傅經(jīng)國等，浮培養(yǎng)物（傅經(jīng)國等，20042004） 國際國際 日本日本 ：紫草：紫草 人參人參 紅豆杉紅豆杉 歐美歐美 ：美國紅豆杉；：美國紅豆杉； 德國德國紫錐菊紫錐菊 國內(nèi)：羅士韋國內(nèi)：羅士韋 葉和春葉和春 鄭光植鄭光植 侯嵩生侯嵩生 丁家宜丁家宜 利用途徑生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn) 不受季節(jié)、環(huán)境、病蟲害影響不受季節(jié)、環(huán)境、病蟲害影響. 不占耕地，適用于貧瘠的地方不占耕地，適用于貧瘠的地方 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)可以在可控條件下進(jìn)行代謝產(chǎn)物生產(chǎn)可以在可控條件下進(jìn)行,可以可以通

5、過細(xì)胞株篩選、特定生物轉(zhuǎn)化途徑與代通過細(xì)胞株篩選、特定生物轉(zhuǎn)化途徑與代謝調(diào)控提高目標(biāo)產(chǎn)物含量謝調(diào)控提高目標(biāo)產(chǎn)物含量.技術(shù)路線技術(shù)路線 目標(biāo)植物選擇目標(biāo)植物選擇愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)培養(yǎng)條培養(yǎng)條件的優(yōu)化件的優(yōu)化反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)固體、液體培養(yǎng)固體、液體培養(yǎng)高產(chǎn)細(xì)胞系篩選高產(chǎn)細(xì)胞系篩選生物合成途徑的研究生物合成途徑的研究器官分化（發(fā)狀根）器官分化（發(fā)狀根）固體液體培養(yǎng)固體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化條件的優(yōu)化反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)有效有效成分提取、分離成分提取、分離植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 是在離體條件下，是在離體條件下，將分離的植物細(xì)將分離的植物細(xì)

6、胞通過繼代培養(yǎng)胞通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量增殖，獲得大量細(xì)胞群體的一種細(xì)胞群體的一種技術(shù)。技術(shù)。 是人工種子、原是人工種子、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等的支撐藥培養(yǎng)等的支撐技術(shù)。技術(shù)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn): 大小大小; 細(xì)胞團(tuán)的形式存在細(xì)胞團(tuán)的形式存在; 纖維素細(xì)胞壁和大液泡纖維素細(xì)胞壁和大液泡,易被剪切力損傷易被剪切力損傷; 生長緩慢生長緩慢 培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜,易被微生物污染易被微生物污染; 需光、氧、二氧化碳需光、氧、二氧化碳培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型 按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)； 按培養(yǎng)基類型可分為

7、固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)； 按培養(yǎng)方式可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)按培養(yǎng)方式可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)胞培養(yǎng) 。植物單細(xì)胞分離和初步培養(yǎng) 單細(xì)胞獲得：單細(xì)胞獲得： 機(jī)械法；酶解法；愈傷組織法機(jī)械法；酶解法；愈傷組織法 單細(xì)胞培養(yǎng)：單細(xì)胞培養(yǎng)：平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)(plating culture)看護(hù)培養(yǎng)法（看護(hù)培養(yǎng)法（nursing culture)飼養(yǎng)層培養(yǎng)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(feeding layer culture)單細(xì)胞分離方法單細(xì)胞分離方法 機(jī)械法機(jī)械法 具體做法：具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松

8、易碎的愈傷組織，通過從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)搖床振蕩獲得分散的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞不受酶傷害；細(xì)胞不受酶傷害；有利于進(jìn)行細(xì)胞的生理和生化研究。有利于進(jìn)行細(xì)胞的生理和生化研究。單細(xì)胞分離方法單細(xì)胞分離方法 酶解法酶解法酶對細(xì)胞壁有一定的軟化作用，所以采酶對細(xì)胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時(shí)，必須加入甘露醇等滲透壓保用酶法時(shí)，必須加入甘露醇等滲透壓保護(hù)劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高護(hù)劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量。游離細(xì)胞的產(chǎn)量。 酶解法的優(yōu)點(diǎn)酶解法的優(yōu)點(diǎn)可獲得較多的葉肉游離細(xì)胞（但對禾本可獲得較多的葉肉游離細(xì)胞（但對

9、禾本科植物葉片效果不好）?？浦参锶~片效果不好）。細(xì)胞平板培養(yǎng)（細(xì)胞平板培養(yǎng)（plating culture) 指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首首創(chuàng)創(chuàng)單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過團(tuán)不能超過6個(gè)細(xì)胞。個(gè)細(xì)胞。單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌基洗滌2次以后，調(diào)整密度為次以后，調(diào)整密度為5103個(gè)個(gè)/毫升毫升植板：將植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸

10、浮液與與4份份35的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。左右。細(xì)胞平板培養(yǎng)（細(xì)胞平板培養(yǎng)（plating culture) 平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)板率是能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞總和中所占的比例。胞總和中所占的比例。 每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)植板率植板率 每個(gè)平板接種的細(xì)胞總數(shù)每個(gè)平板接種的細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞平板培養(yǎng)（細(xì)胞平板培養(yǎng)（plating culture) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：單細(xì)胞在培養(yǎng)基中分布

11、均勻，便于在顯單細(xì)胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察，是單細(xì)胞株微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察，是單細(xì)胞株篩選和突變體篩選的常用方法。篩選和突變體篩選的常用方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分裂、作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。物合成等。 缺點(diǎn)：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造缺點(diǎn)：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。成毒害或影響組織吸收。細(xì)胞懸浮細(xì)胞懸浮過濾過濾與培養(yǎng)基與培養(yǎng)基混合混合植板植板培養(yǎng)培養(yǎng)克隆愈克隆

12、愈傷組織傷組織看護(hù)培養(yǎng)（nurse culture） Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細(xì)胞體系。首創(chuàng)此法獲得煙草單細(xì)胞體系。 優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，效果好。優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，效果好。 缺點(diǎn)：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長缺點(diǎn)：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長過程。過程。微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)(microchamber culture) 在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。由形成細(xì)胞團(tuán)的方法。由Jones等在等在1960年年設(shè)計(jì)的。設(shè)計(jì)的。 優(yōu)點(diǎn)：可對培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，

13、優(yōu)點(diǎn)：可對培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個(gè)細(xì)胞的生長、分裂、分化等過程了解一個(gè)細(xì)胞的生長、分裂、分化等過程 缺點(diǎn)：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，缺點(diǎn)：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。變動幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。 細(xì)胞起始密度：細(xì)胞起始密度：3080個(gè)個(gè)/室。室。雙層濾紙植板培養(yǎng) Horsch等（等（1980）建立）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿培養(yǎng)基培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞層飼養(yǎng)細(xì)胞層培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞 看護(hù)濾紙看護(hù)濾紙轉(zhuǎn)移濾紙轉(zhuǎn)移濾紙固體培養(yǎng)固體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容劑，經(jīng)加熱溶解后

14、，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) 簡便易行、所占空間小簡便易行、所占空間小 生長的不平衡，易出現(xiàn)極化現(xiàn)象生長的不平衡，易出現(xiàn)極化現(xiàn)象 易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì)易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì) 有些生理生化指標(biāo)測定不方便有些生理生化指標(biāo)測定不方便 常用的固化劑常用的固化劑 瓊脂、明膠（瓊脂、明膠（10%10%）等）等液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 1 1成批培養(yǎng)法成批培養(yǎng)法 batch culturebatch culture細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng), ,在培養(yǎng)

15、過程中培養(yǎng)液體在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變積不變, ,不添加營養(yǎng)成分不添加營養(yǎng)成分, ,待細(xì)胞增長和產(chǎn)物待細(xì)胞增長和產(chǎn)物積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間, ,一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法. .液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 1 1成批培養(yǎng)法成批培養(yǎng)法 batch culturebatch culture 特點(diǎn)：特點(diǎn)：操作簡單，培養(yǎng)周期短操作簡單，培養(yǎng)周期短. . 直接反映細(xì)胞生長代謝過程直接反映細(xì)胞生長代謝過程. .可直接放大可直接放大不能控制底物濃度、細(xì)胞易老化、生長周期不能控制底物濃度、細(xì)胞易老化、生長周期短、效率低短、效率低. . 兩步兩步成批培養(yǎng)法成批培

16、養(yǎng)法即使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器用于即使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器用于細(xì)胞生物量的累積，第二個(gè)反應(yīng)器用于次級細(xì)胞生物量的累積，第二個(gè)反應(yīng)器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。2. 2. 半連續(xù)培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法 semi-continuous culturesemi-continuous culture 重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng). .在細(xì)胞增長和產(chǎn)在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中物形成過程中, ,每間隔一段時(shí)間從中取出部分每間隔一段時(shí)間從中取出部分培養(yǎng)液或細(xì)胞培養(yǎng)液或細(xì)胞, ,剩余的細(xì)胞作為種子剩余的細(xì)胞作為種子, ,再用新的再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原體積培養(yǎng)液補(bǔ)足

17、到原體積, ,使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變積不變. . 特點(diǎn)特點(diǎn): : 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長, ,并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平一較高的濃度水平, ,培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時(shí)培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時(shí)間間. . 可進(jìn)行多次收獲可進(jìn)行多次收獲. . 操作簡便操作簡便, ,生產(chǎn)效率高生產(chǎn)效率高. .3 3連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)(continuous culture) 連續(xù)培養(yǎng)法是在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速連續(xù)培養(yǎng)法是在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)含有度向生物反應(yīng)器連

18、續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)含有細(xì)胞的培養(yǎng)液以相同的速度連續(xù)從生物反應(yīng)器流細(xì)胞的培養(yǎng)液以相同的速度連續(xù)從生物反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積恒定的培養(yǎng)方式。出，以保持培養(yǎng)體積恒定的培養(yǎng)方式。 該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù)該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù)MonodMonod公式，即生長速度取公式，即生長速度取決于基質(zhì)的濃度。決于基質(zhì)的濃度。 maxmaxS/(Ks+S)S/(Ks+S) = =特定生長速度；特定生長速度； maxmax= =特定最大生長速度；特定最大生長速度；Ks=Ks=飽和系數(shù)；飽和系數(shù)；S=S=基質(zhì)濃度基質(zhì)濃度 兩階段連續(xù)培養(yǎng)法兩階段連續(xù)培養(yǎng)法于第一反應(yīng)器中投入生長培養(yǎng)基并連續(xù)加入該于第一反應(yīng)器中投入生長培

19、養(yǎng)基并連續(xù)加入該培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。 3 3連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)(continuous culture) 特點(diǎn)特點(diǎn): : 細(xì)胞能在近似恒定狀態(tài)下生長、營養(yǎng)細(xì)胞能在近似恒定狀態(tài)下生長、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pHpH基本保持恒基本保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長速率可定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長速率可基本維持不變，細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增基本維持不變，細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長。長。 穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。對數(shù)生長期。3 3連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)

20、培養(yǎng)法(continuous culture)(continuous culture) 問題問題: : 一直有細(xì)胞收獲，濃度一般不高一直有細(xì)胞收獲，濃度一般不高 細(xì)胞分裂快、易變異；細(xì)胞分裂快、易變異； 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染長，容易造成污染 對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)（Suspension culture） 懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。養(yǎng)增殖的技

21、術(shù)。 特點(diǎn)特點(diǎn) 1. 培養(yǎng)細(xì)胞可不斷增殖，且生長速度快。培養(yǎng)細(xì)胞可不斷增殖，且生長速度快。 2. 液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對保持一致。觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對保持一致。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的生長動態(tài)懸浮細(xì)胞的生長動態(tài)懸浮細(xì)胞同步化懸浮細(xì)胞同步化愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo) 選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。 選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的

22、附加物質(zhì)。附加物質(zhì)。 要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎狀，疏松易碎懸浮系的建立與培養(yǎng)懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150250ml flaskcentrifuge isolationsubculture1g/10ml medium100120 rmp culture transfer 1 time/3d80 rpm成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系特征 懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在在3050個(gè)細(xì)胞以下。個(gè)細(xì)胞以下。

23、 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。淡黃色。 細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般23天便可增加一倍。天便可增加一倍。懸浮細(xì)胞的生長動態(tài)懸浮細(xì)胞生長的衡量 根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)變化，或細(xì)胞根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)變化，或細(xì)胞質(zhì)量變化。質(zhì)量變化。 生長速率生長速率(p)：不同時(shí)間細(xì)胞密度：不同時(shí)間細(xì)胞密度(x)的自然的自然對數(shù)與起始密度對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與

24、培養(yǎng)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時(shí)間時(shí)間(t)的比值的比值p(lnx-lnx0)/t 鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細(xì)胞生鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細(xì)胞生長情況長情況 干重：鮮細(xì)胞烘干至衡重，反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量干重：鮮細(xì)胞烘干至衡重，反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量影響懸浮細(xì)胞生長的因素 起始愈傷組織的質(zhì)量起始愈傷組織的質(zhì)量 接種細(xì)胞密度：懸浮細(xì)胞的起始密度一般接種細(xì)胞密度：懸浮細(xì)胞的起始密度一般在在0.52.5105個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞/毫升。接種初期的毫升。接種初期的細(xì)胞密度過低往往使延遲期加長。細(xì)胞密度過低往往使延遲期加長。最低有最低有效密度效密度：即能使細(xì)胞分裂、增殖的最低接：即能使細(xì)胞分裂、增殖的最低接種量。種量。 培養(yǎng)

25、條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。期。影響懸浮細(xì)胞生長的因素 培養(yǎng)基培養(yǎng)基應(yīng)用應(yīng)用條件培養(yǎng)基條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸（生長過愈傷組織或懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基）提供單細(xì)胞生長浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基）提供單細(xì)胞生長和分裂所需的特殊代謝物。和分裂所需的特殊代謝物?；九囵B(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目基本培養(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定的而定 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí),一般均以誘導(dǎo)愈傷一般均以誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)整。常組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS 、N6等。等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。植物激素和

26、其他附加成分的應(yīng)用。影響懸浮細(xì)胞生長的因素 培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) 溫度溫度 25 繼代周期繼代周期指具有一定起始密度的細(xì)胞指具有一定起始密度的細(xì)胞, ,從開始培養(yǎng)到從開始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長停止的一個(gè)過程。細(xì)胞數(shù)目和總重量增長停止的一個(gè)過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細(xì)胞密度、延遲期培養(yǎng)周期的長短是由起始細(xì)胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)（SubcultureSubculture）：繼初代培養(yǎng)之：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的

27、擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過程。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化 細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。 植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中容易團(tuán)聚并進(jìn)入不植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中容易團(tuán)聚并進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同步化是十分困難的。步化是十分困難的。 同一培養(yǎng)體系的植物細(xì)胞經(jīng)常不能處于同同一培養(yǎng)體系的植物細(xì)胞經(jīng)常不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞分裂、一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。

28、 通過一定的理化措施可以使同一體系中的通過一定的理化措施可以使同一體系中的細(xì)胞達(dá)到相對同步化。細(xì)胞達(dá)到相對同步化。 什么措施？什么措施？細(xì)胞周期細(xì)胞周期 饑餓法 饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成能合成DNA，即不能進(jìn)入，即不能進(jìn)入S期，或細(xì)胞分裂期，或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入M期。因此，通過饑期。因此，通過饑餓法可以獲得處于餓法可以獲得處于G1和和G2期的同步化細(xì)胞。期的同步化細(xì)胞。氮饑餓時(shí)，通常獲得氮饑餓時(shí)，通常獲得G1期的同步化細(xì)胞期的同步化細(xì)胞磷和碳饑餓時(shí)，獲得磷和碳饑餓時(shí)，獲得G1和和G2期的同步化期的同步化細(xì)胞。細(xì)

29、胞。 將饑餓細(xì)胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時(shí)，將饑餓細(xì)胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞分裂又可重新恢復(fù)。細(xì)胞分裂又可重新恢復(fù)。抑制劑法 通過一些通過一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期獲得處于同一細(xì)胞周期(G1)的同步化細(xì)胞。的同步化細(xì)胞。常用抑制劑主要有常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷氟脫氧尿苷(FudR)和羥基和羥基尿尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細(xì)胞的方法在小麥、用羥基尿處理獲得同步化細(xì)胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細(xì)胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。玉米、西芹等植物細(xì)胞培養(yǎng)中

30、已有成功應(yīng)用。 利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在中期，常用利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。小。分選法 依據(jù)：細(xì)胞體積大小依據(jù)：細(xì)胞體積大小 方法方法常規(guī)分選方法是梯度離心常規(guī)分選方法是梯度離心精細(xì)的分選可采用流式細(xì)胞儀精細(xì)的分選可采用流式細(xì)胞儀 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)操作簡單操作簡單分選細(xì)胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它分選細(xì)胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用處理帶來的副作用 缺點(diǎn)缺點(diǎn)分選精細(xì)度較差分選精細(xì)度較差低溫處理 可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細(xì)等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細(xì)胞較好地同步化。胞較好地同步化。梅興國等（梅興國