《生物工業(yè)下游技術(shù)》全冊配套完整教學(xué)課件

1、生物工業(yè)下游技術(shù)全冊生物工業(yè)下游技術(shù)全冊配套完整教學(xué)課件配套完整教學(xué)課件生物工業(yè)下游加工技術(shù)“意志、工作、成功，是人生的三大要素。意志、工作、成功，是人生的三大要素。意志將為你打開事業(yè)的大門；工作是入室意志將為你打開事業(yè)的大門；工作是入室的路徑；這條路徑的盡頭，有個成功來慶的路徑；這條路徑的盡頭，有個成功來慶賀你努力的結(jié)果賀你努力的結(jié)果巴斯德（微生物工程巴斯德（微生物工程學(xué)之父）學(xué)之父） 關(guān)于本門課程的幾點說明（1） 李剛，主要研究酶在生物修復(fù)和生物能源中的應(yīng)用。 碩士生招生方向：分子酶學(xué)與酶工程，宏基因組與宏轉(zhuǎn)錄組。 聯(lián)系方式： Tel:（o）84110296； Email: 南校區(qū)生命科學(xué)

2、學(xué)院北院310室 講課內(nèi)容安排： 講授16次課程，復(fù)習答疑1次，第18周考試（閉卷考試）。關(guān)于本門課程的幾點說明（2） 希望達到的特點： 1、內(nèi)容講解盡可能生動、通俗； 2、幻燈片中盡可能多增加一些圖片和故事，便于同學(xué)們理 解課程內(nèi)容和增加興趣； 3、傳道、授業(yè)、解惑； 4、加強和同學(xué)之間的互動加強和同學(xué)之間的互動；（思考題,課后交流，郵件交 流） 5、音樂教學(xué)方式。每周上課前會用每周上課前會用3-53-5分鐘左右的時間播放分鐘左右的時間播放 一首音樂一首音樂，主要是使同學(xué)們充分放松、調(diào)整好自己的聽 課狀態(tài)，提高上課效果。 個人關(guān)于本科教學(xué)的看法 心有多大，舞臺就有多大！ 沒有最好，只有更好！

3、 每年對教學(xué)課件都要進行更新，以反映生物工業(yè)下游技術(shù)的最新進展！對同學(xué)們的幾點要求 1、希望同學(xué)們多提好的建議； 2、勤學(xué)好問； 3、不要缺席，營造一種良好的課堂氣氛。 4、我不會每次課都點名，但可能會隨機點 名。如果累積點名不到3次，平時成績會 受到很大影響； 5、No Pains, No Gains!你怎么對待本門課程的，考試成績就會怎么對待你！一位往屆同學(xué)的學(xué)習經(jīng)驗 她成功的一個重要經(jīng)驗就是：每次課后都把老每次課后都把老師講過的內(nèi)容總結(jié)到一張紙上，融會貫通。師講過的內(nèi)容總結(jié)到一張紙上，融會貫通。 其實她的成功經(jīng)驗是很簡單的，但又是很難復(fù)制的，因為真正有毅力的同學(xué)太少了！主要參考書 （1）

4、生物工業(yè)下游技術(shù)，毛忠貴主編，中國輕工業(yè)出版社。 （2）生物工程下游技術(shù)實驗手冊，柯德森主編，科學(xué)出版社。考試形式 閉卷考試。 平時成績占20，考試成績占80。 平時成績：取決于點名情況、課堂表現(xiàn)和課后作業(yè)。第一章 緒 論 生物工業(yè)生物工業(yè)：也稱生物煉制和生物制造，以生物活體作為反應(yīng)器進行物質(zhì)和能源等生產(chǎn)，也可擴展到工業(yè)化的生物設(shè)計與繁殖等。 生物工程生物工程：一般認為是以生物學(xué)生物學(xué)(特別是其中的微生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)和細胞學(xué))的理論理論和技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合化工、機械、電子計算機等現(xiàn)結(jié)合化工、機械、電子計算機等現(xiàn)代工程技術(shù)代工程技術(shù)，充分運用分子生物學(xué)的最新成就，自覺地操縱遺傳物質(zhì)，定向地

5、改造生物或其功能，短期內(nèi)創(chuàng)造出創(chuàng)造出具有超遠緣性狀的新物種新物種，再通過合適的生物反應(yīng)器對這類“工程菌工程菌”或“工程細工程細胞株胞株”進行大規(guī)模的培養(yǎng)，以生產(chǎn)大量有用代謝代謝產(chǎn)物產(chǎn)物或發(fā)揮它們獨特生理功能一門新興技術(shù)。生物工程研究內(nèi)容 生物工程包括五大工程，即遺傳工程遺傳工程(基因工程）基因工程）、細胞工程細胞工程、微生物工程微生物工程(發(fā)酵工程發(fā)酵工程)、酶工程酶工程(生生化工程化工程)和生物反應(yīng)器工程生物反應(yīng)器工程。在這五大領(lǐng)域中，前兩者作用是將常規(guī)菌(或動植物細胞株)作為特定遺傳物質(zhì)受體，使它們獲得外來基因，成為能表達超遠緣性狀的新物種“工程菌”或“工程細胞株”。后三者的作用則是這一有

6、巨大潛在價值的新物種創(chuàng)造良好的生長與繁殖條件，進行大規(guī)模新物種創(chuàng)造良好的生長與繁殖條件，進行大規(guī)模的培養(yǎng)的培養(yǎng)，以充分發(fā)揮其內(nèi)在潛力，為人們提供巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。 生物工程分為上游技術(shù)上游技術(shù)和下游技術(shù)下游技術(shù)兩部分。生物工程中的上下游技術(shù) 上游技術(shù)上游技術(shù)（ Upstream Processing ）： 指的是目的基因獲得、載體建立、連接、轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞、篩選、克隆表達和優(yōu)良生物物種的選育、基因工程、細胞工程、生物反應(yīng)過程（酶反應(yīng)、微生物發(fā)酵、動植物細胞培養(yǎng)）等。 簡而言之，上游技術(shù)就是創(chuàng)造工程菌并且大規(guī)模繁殖工程菌。生物工程中的上下游技術(shù) 下游技術(shù)下游技術(shù)（Downstream

7、 Processing）：對于由生物界自然產(chǎn)生的或由微生物菌體發(fā)酵的、動植物細胞組織培養(yǎng)的、酶反應(yīng)等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的生物原料，經(jīng)提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術(shù)，通常稱為下游技術(shù)，也稱下游工程或下游加工過程。簡單說簡單說，下游技術(shù)就是目標產(chǎn)物的分離純化過程，下游技術(shù)就是目標產(chǎn)物的分離純化過程。 生物工程下游技術(shù)的操作對象 操作對象一般指包含目標產(chǎn)物的人工培養(yǎng)包含目標產(chǎn)物的人工培養(yǎng)的動植物細胞或菌體的動植物細胞或菌體，也包括天然的動植物及微生物材料。 目標產(chǎn)物是指具有一定功能的生物分子目標產(chǎn)物是指具有一定功能的生物分子，主要是蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、糖類及其衍生物、脂

8、類及其衍生物等。 目標產(chǎn)物的存在形式可為菌體菌體、胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物三種形式。常見的生物工程目標產(chǎn)物 （1）氨基酸及其衍生物）氨基酸及其衍生物，如谷氨酸、賴氨酸、精氨酸等。 （2）活性多肽類）活性多肽類，如谷胱甘肽、催產(chǎn)素、促腎上腺皮質(zhì)激素、腦肽、抗菌肽等。 抗菌肽抗菌肽： 抗菌肽原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類分子量在4KD左右，具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。后來，從其他昆蟲以及兩棲類動物、哺乳動物中，也分離到結(jié)構(gòu)相似的抗菌多肽?？咕牡母拍畹玫搅藰O大的擴展?？咕牡墓πШ涂咕鷻C制 抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用某些耐藥性病原

9、菌的殺滅作用更引起了人們的重視。 除此之外，人們還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細胞等有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合過程。 作用機制：目前一般認為,Cecropin類抗菌肽作用類抗菌肽作用于細胞膜，在膜上形成跨膜的離子通道于細胞膜，在膜上形成跨膜的離子通道，破壞了膜的完整性，造成細胞內(nèi)容物泄漏，從而殺死細胞。常見的生物工程目標產(chǎn)物 （3）蛋白質(zhì)類）蛋白質(zhì)類，是最重要的生物工程產(chǎn)品，也是下游技術(shù)最主要的分離對象。如生長素、胰島素、干擾素等。 （4）酶類酶類：酶是具有催化功能的蛋白質(zhì)或核酸類生物，在醫(yī)療、環(huán)保、能源、食品和飼料等領(lǐng)域具有重要的作業(yè)，是生物工程的主要研究對象和

10、主要應(yīng)用產(chǎn)品。 2008年世界酶制劑的銷售額已經(jīng)達到30億美元。世界上最大的8 家酶制劑生產(chǎn)廠商全世界各種酶制劑的銷售比例不同工業(yè)用酶的銷售情況中國各類酶制劑的產(chǎn)量和銷售情況常見的生物工程目標產(chǎn)物 （5）核酸及其降解物質(zhì)）核酸及其降解物質(zhì)，主要包括堿基、核苷酸及其衍生物等。 （6）糖類）糖類。主要包括常規(guī)的單糖、寡糖（低聚寡糖）、多糖及其衍生物等。 （7）脂質(zhì)類）脂質(zhì)類。主要包括磷脂類、多價不飽和脂肪酸、固醇、卟啉以及膽酸類等。 （8）小動物制劑小動物制劑，包括蜂王漿、蜂膠、水蛭素等。（9）微生物制劑微生物制劑，包括活菌體、滅活菌體及其提取物制成的藥物，如微生物肥料制劑、畜牧業(yè)飼料、污水處理用

11、微生物制劑等。生物工程之父巴斯德路易巴斯德（Louis Pasteur，1822.12.27-1895.9.25) ，法國微生物學(xué)家、化學(xué)家，近代微生物學(xué)的奠基人。巴斯德把微生物發(fā)酵原理廣泛應(yīng)用于指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)，開創(chuàng)了“微生物工程”，被人們尊稱為“微生物工程學(xué)之父”。主要貢獻：（1）每一種發(fā)酵作用都是由于一種微菌的發(fā)展， “巴氏殺菌法”已成功應(yīng)用在各種食物和飲料上。（2）每一種傳染病都是一種微菌在生物體內(nèi)的發(fā)展，由于發(fā)現(xiàn)并根除了一種侵害蠶卵的細菌，巴斯德拯救了法國的絲綢工業(yè)。（3）傳染病的微菌，在特殊的培養(yǎng)之下可以減輕毒力，使他們從病菌變成防病的疫苗。生物工程之父巴斯德科學(xué)雖然沒有國界，科學(xué)家卻

12、科學(xué)雖然沒有國界，科學(xué)家卻有自己的祖國。有自己的祖國。巴斯德巴斯德普法戰(zhàn)爭爆發(fā)后，巴斯德把自己從德國伯恩大學(xué)獲得的名譽證書退還給伯恩大學(xué)。巴斯德與巴氏滅菌法 巴氏滅菌法巴氏滅菌法(pasteurize）又稱低溫滅菌法，先將）又稱低溫滅菌法，先將要求滅菌的物質(zhì)加熱到要求滅菌的物質(zhì)加熱到6530分鐘或分鐘或7215分鐘分鐘，隨后迅速冷卻到，隨后迅速冷卻到10以下。以下。這樣既不破壞營養(yǎng)成分，又能殺死細菌的營養(yǎng)體。 巴氏滅菌法的產(chǎn)生來源于巴斯德解決啤酒變酸問題的努力。當時，法國釀酒業(yè)面臨著一個令人頭疼的問題，那就是啤酒在釀出后會變酸，根本無法飲用。巴斯德發(fā)現(xiàn)啤酒變酸的罪魁禍首是乳酸桿菌。以5060攝

13、氏度的溫度加熱啤酒半小時，就可以殺死啤酒里的乳酸桿菌和芽孢，而不必煮沸。這一方法挽救了法國的釀酒業(yè)。巴氏滅菌法的原理 巴氏殺菌法將原料加熱至6070，并保持此溫度30min，以后急速冷卻到4-5。因為一般細菌的致死點均為溫度68與時間30min以下，所以將混合原料經(jīng)此法處理后，可殺滅其中的致病性細菌和絕大多數(shù)非致病性細菌；原料加熱后突然冷卻，急劇的熱與冷變化也可以促使細菌的死亡。巴氏滅菌法在牛奶中的應(yīng)用巴氏滅菌法是一種濕熱滅菌法。通常有兩種做法，一是在巴氏滅菌法是一種濕熱滅菌法。通常有兩種做法，一是在61.762.8下加熱下加熱30分鐘（低溫長時間處理），二是在分鐘（低溫長時間處理），二是在7

14、1.6或或更高溫度下加熱更高溫度下加熱15分鐘（高溫短時間處理）分鐘（高溫短時間處理）。如果加壓，一般效果會更好。通常，我們喝的袋裝牛奶(燕塘牛奶)就是采用巴氏滅菌法生產(chǎn)的。工廠采來鮮牛奶，先進行低溫處理，然后用巴氏消毒法進行滅菌。用這用這種方法生產(chǎn)的袋裝牛奶通?？梢员４娣N方法生產(chǎn)的袋裝牛奶通常可以保存310天，最多天，最多16天。天。因為經(jīng)巴氏消毒后，仍保留了小部分無害或有益、較耐熱的細菌或細菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4左右的溫度下保存。需要指出的是，喝新鮮牛奶（指剛剛擠出的牛奶）反而是不安全的，因為它可能包含對人身體有害的細菌。另一點是，巴氏消毒法也不是萬能的，經(jīng)過巴氏消毒法處理的牛奶仍

15、然要儲存在較低的溫度下（一般10%）的懸浮液的分離，廣泛用于霉菌、放線菌和酵母菌發(fā)酵液或細胞懸浮液的過濾分離。 由于受推動力（真空度）的限制，一般不一般不適合菌體較小、粘度較大的細菌發(fā)酵液的適合菌體較小、粘度較大的細菌發(fā)酵液的過濾。另外固相的干度不如加壓過濾。過濾。另外固相的干度不如加壓過濾。原理：在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)維持一定的真空度，施加于轉(zhuǎn)鼓外邊的大氣壓力即為過濾的推動力。過濾時，轉(zhuǎn)鼓下部浸沒于待過濾的懸浮液中，當轉(zhuǎn)鼓以低速旋轉(zhuǎn)時，濾液就透過濾布被吸入轉(zhuǎn)鼓內(nèi)腔，濾渣則滯留于轉(zhuǎn)鼓表面的過濾介質(zhì)上形成濾餅。當轉(zhuǎn)鼓繼續(xù)轉(zhuǎn)動，生成的濾餅依次被洗滌、吸干（洗滌吸干區(qū)）和刮下卸除（卸渣區(qū)）。最后，用壓縮空氣吹落濾

16、布孔隙中的細微顆粒，使濾布再生。真空轉(zhuǎn)鼓過濾機硅藻土過濾機 硅藻土是一種較純的二氧化硅礦石，它既是優(yōu)良的過濾介硅藻土是一種較純的二氧化硅礦石，它既是優(yōu)良的過濾介質(zhì)，也是優(yōu)良的助濾劑。質(zhì)，也是優(yōu)良的助濾劑。 （1）作為深層過濾介質(zhì)，過濾含少量懸浮固形物的液體。 （2）在支持介質(zhì)（濾布）的表面上預(yù)先涂上硅藻土薄層，以保護介質(zhì)的毛細孔道不被固體粒子堵塞，提高和穩(wěn)定過濾速率。 （3）將適當?shù)墓柙逋练稚⒃诖^濾的懸浮液中，使形成的濾餅具有多孔隙性，降低濾餅的可壓縮性，以提高過濾速率和延長過濾操作的周期。 按支撐單元的不同，硅藻土過濾機可分為板框式過濾機、葉片式過濾機和柱式過濾機三種。其他固液分離方法 1

17、、切向流過濾：、切向流過濾： 在一般過濾中，濾液的流動方向與濾餅基本垂直，稱為封頭過濾。這種方法由于濾餅的阻力，隨著過濾的進行，過濾速度迅速下降。 切向流過濾是一種維持恒壓下高速過濾的切向流過濾是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)，其操作特點是使懸浮液在過濾介質(zhì)技術(shù)，其操作特點是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。切向流過濾 （1）用泵循環(huán)使懸浮液流經(jīng)過濾介質(zhì)。此法適合大規(guī)模生產(chǎn)，缺點是懸浮液在流動缺點是懸浮液在流動過程中有壓力損失，流路中固體積累程度過程中有壓力損失，流路中固體積累

18、程度不一，且能耗較大。不一，且能耗較大。 （2）在過濾介質(zhì)表面加以攪拌造成流動，產(chǎn)生切向流。這種方式適合于實驗室規(guī)模，處理量較小，過濾面積小，剪切力不均勻。切向流過濾的缺點 （1）切向流產(chǎn)生的剪切力使濾液中的目標蛋白失活。 （2）能耗比一般過濾高。 （3）固相的含水量較高，主要起濃縮作用。 （4）不能避免過濾介質(zhì)的污染和堵塞。雙水相萃取 是向水中加入溶于水的某種高分子化合物是向水中加入溶于水的某種高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另一種高分子化合物，重相

19、中富含鹽類或另一種高分子化合物，物，從而達到分離和提純某種高分子化合物的目的。 優(yōu)點：投資小、能耗低，沒有膜過濾中的堵塞問題。吸附法 向細胞碎片懸浮液中加入某種固體吸附劑向細胞碎片懸浮液中加入某種固體吸附劑，或者用細胞碎片懸浮液通過裝有吸附劑，或者用細胞碎片懸浮液通過裝有吸附劑的固定床，即可達到除去細胞碎片的目的的固定床，即可達到除去細胞碎片的目的。 優(yōu)點：設(shè)備簡單、能耗低。 缺點：難以選擇合適的吸附劑，以保證目的產(chǎn)物不被吸附而損失。思考題 1、改變發(fā)酵液過濾特性的主要方法有哪些？其簡要機理如何？ 2、除去發(fā)酵液中雜蛋白質(zhì)的常用方法有哪些？ 3、試述生物工業(yè)中常用固液分離設(shè)備的原理、特點及適用

20、范圍。生物工業(yè)下游加工技術(shù)生物工業(yè)下游加工技術(shù)李剛 副教授第四章第四章 微生物細胞破碎微生物細胞破碎 第一節(jié)第一節(jié) 細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)細胞壁的組成與結(jié)構(gòu) 第二節(jié)第二節(jié) 常用破碎方法常用破碎方法 第三節(jié)第三節(jié) 破碎率的測定與破碎技術(shù)的研究方向破碎率的測定與破碎技術(shù)的研究方向 第一節(jié)第一節(jié) 細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)細胞壁（cellwall）是細胞的外層，在細胞膜的外面，細胞壁之厚薄常因組織、功能不同而異。植物、植物、真菌、藻類和原核生物（除了支真菌、藻類和原核生物（除了支原體與原體與L形細菌（缺壁細菌）形細菌（缺壁細菌）都具有細胞壁，而動物細胞不具都具有細胞壁，而動物細胞不具有細胞壁有

21、細胞壁。細胞壁本身結(jié)構(gòu)疏松，外界可通過細胞壁進入細胞中，細胞壁具有全透性。細胞壁分為細胞壁分為3層，即胞間層（中層）、初生層，即胞間層（中層）、初生壁和次生壁。壁和次生壁。胞間層把相鄰細胞粘在一起形成組織。細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)圖 根據(jù)細菌細胞壁的構(gòu)造和化學(xué)組成不同，可將其分為G+細菌與G-細菌。G+細菌的細胞壁較厚（2080nm），但化學(xué)組成比較單一，只含有90的肽聚糖和10的磷壁酸；但G-細菌的細胞壁較?。?015nm），卻有多層構(gòu)造（肽聚糖和脂多糖層等），其化學(xué)成分中除含有肽聚糖以外，還含有一定量的類脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分。此外，兩者在表面結(jié)構(gòu)上也有顯著不同。革蘭氏陽性菌和陰性菌細胞壁的比較細菌破

22、碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于多糖鏈上所存在的肽健數(shù)量和其交聯(lián)的程度。交聯(lián)程度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就越致密，破碎的難度也就越大。各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成微生物微生物革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1%-4%）肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖（11%-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30%-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)(6%-8%)脂類（8.5%-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質(zhì)酵母菌

23、細胞酵母菌形態(tài)酵母菌形態(tài)酵母菌細胞結(jié)構(gòu)酵母菌細胞結(jié)構(gòu)周質(zhì)空間原生質(zhì)膜多糖甘露糖蛋白周質(zhì)蛋白酵母細胞壁破碎的阻力主要取決于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。霉菌霉菌的細胞壁結(jié)構(gòu)霉菌的細胞壁主要由多糖組成，其次含有少量的蛋白質(zhì)和脂類。其中絕大多數(shù)的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成的，幾丁質(zhì)與纖維素結(jié)構(gòu)很類似。由于由于霉菌細胞壁中含有纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細菌和酵母菌的細胞壁有所提高。霉菌細胞壁中含有纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細菌和酵母菌的細胞壁有所提高。細胞壁結(jié)構(gòu)與細胞破碎 為了破碎細胞，必須克服的主要阻力是連為了破碎細胞，必須克服的主要阻力是連接細胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵。接細胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵。 了解細胞壁的

24、組成和結(jié)構(gòu)，就可以用合適的溶菌酶和化學(xué)試劑，以及在使用多種酶活化學(xué)試劑相結(jié)合時確定其使用的順序。第二節(jié) 常用破碎方法 分類分類 作用機理作用機理 適應(yīng)性適應(yīng)性機珠磨法固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難。械高壓勻漿法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作法X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感的目的產(chǎn)物不適應(yīng)非酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差機 化學(xué)滲透法改變細胞膜的滲透性械 滲透壓法

25、反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用法 凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感的目的產(chǎn)物 干燥法改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活珠磨法 珠磨法是一種有效的細胞破碎法。其工作原理是：進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑Al3+Ca2+Mg2+Na+ 陰離子順序為： 檸檬酸根硫酸根硝酸根 2. 溶液濃度的影響：溶液濃度的影響： 樹脂對離子交換吸附的選擇性，在稀溶液中比較大。樹脂對離子交換吸附的選擇性，在稀溶液中比較大。因此可將溶液稀釋，樹脂選擇吸附高價離子。 3. 離子的水化半徑：離子的水化半徑： 水化半徑較小的離子優(yōu)先吸附

26、。水化半徑較小的離子優(yōu)先吸附。影響離子交換樹脂的選擇性因素 4. 樹脂物理結(jié)構(gòu)的影響： 通常，交聯(lián)度高的樹脂對離子的選擇性較強。通常，交聯(lián)度高的樹脂對離子的選擇性較強。大孔型樹脂的選擇性低于凝膠型樹脂。 5. 有機溶劑的影響： 當有機溶劑存在時，常會使樹脂對有機離子的選擇性降低當有機溶劑存在時，常會使樹脂對有機離子的選擇性降低，而容易吸附無機離子。，而容易吸附無機離子?；谶@個性質(zhì)，可利用有機溶劑從樹脂上洗脫難洗脫的有機物質(zhì)。 6. 樹脂與交換離子間的輔助力： 凡是能與樹脂間形成輔助力，如氫鍵、范德華力等輔助力的離子，樹脂對其吸附力就大；反之，能破壞這些輔助力的溶液就能容易地將離子從樹脂上洗脫

27、下來。三、離子交換過程和速度（1）溶液中的谷氨酸離子從溶液通過液膜擴散到樹脂表面；（2）穿過樹脂表面向樹脂孔內(nèi)部擴散，到達有效交換位置；（3）谷氨酸離子與樹脂中的H+進行離子交換；（4）H+從樹脂內(nèi)部向樹脂表面擴散。（5）H+穿過樹脂表面的液膜進入水溶液。影響離子交換速度的因素 1.樹脂顆粒樹脂顆粒：樹脂粒度減小，交換速度加快。 2. 樹脂的交聯(lián)度樹脂的交聯(lián)度：降低交聯(lián)度，能提高交換速度。 3. 溶液流速溶液流速：外擴散隨溶液過柱流速的增加而增加，內(nèi)擴散基本不受流速的影響。 4. 溶液濃度溶液濃度：當溶液中的離子濃度較低時，對外擴散速度影響較大；當溶液中的離子濃度較高時，對內(nèi)擴散影響較大。 5

28、. 溫度溫度：溶液的溫度提高，擴散速度加快，因而交換速度也增加。 6. 離子的大小離子的大?。?小離子的交換速度比較快。大分子由于在擴散過程中受到空間的阻礙，在樹脂內(nèi)的擴散速度特別慢。 7. 離子的化合價：離子的化合價越高，擴散速度越小。第四節(jié) 離子交換的應(yīng)用 一、離子交換裝置： 離子交換法按操作方式可分為間歇式分批間歇式分批操作及柱式操作兩種操作及柱式操作兩種。 間歇操作：又叫靜態(tài)處理，將離子交換劑浸泡于工作液中，達到平衡后，濾出介質(zhì)進行洗脫。 柱式操作：又稱動態(tài)法，交換、洗脫、再生等步驟均在柱內(nèi)進行。工業(yè)生產(chǎn)中一般工業(yè)生產(chǎn)中一般采用柱式操作。采用柱式操作。離子交換柱結(jié)構(gòu)圖 離子交換的主要裝

29、置是離子交換柱。它是圓柱形，上下封頭球形或錐形。 離子交換柱有開放式和密離子交換柱有開放式和密閉式兩種。閉式兩種。 開放式便于樹脂的裝入和吸出，柱子的反洗河清除樹脂層表面的污垢。但容易混入外界雜質(zhì)。 密閉式上下全封閉，能克服開放式的缺點，但清污和裝柱較麻煩。離子交換的操作方法 （1）樹脂預(yù)處理及裝柱 （2）離子交換吸附 （3）洗脫 （4）樹脂再生1. 樹脂的預(yù)處理應(yīng)用最多的為強酸性陽離子交換樹脂和強堿性陰離子交換樹脂。應(yīng)用最多的為強酸性陽離子交換樹脂和強堿性陰離子交換樹脂。生產(chǎn)上出廠的交換樹脂顆粒大小往往不夠均勻，故使用時應(yīng)當先過篩以除去太大和太小的顆粒，也可以用水泡脹后用篩子在水中選取大小一

30、定的顆粒備用。一般商品樹脂都含有一定量的雜質(zhì)，所以在使用前必須進行凈化處理一般商品樹脂都含有一定量的雜質(zhì)，所以在使用前必須進行凈化處理。對強堿性和強酸性陰離子交換樹脂，通常用。對強堿性和強酸性陰離子交換樹脂，通常用4M HCl溶液浸泡溶液浸泡1-2天天，以溶解各種雜質(zhì)，然后用蒸餾水洗滌至中性。這樣就得到在活性基，以溶解各種雜質(zhì)，然后用蒸餾水洗滌至中性。這樣就得到在活性基團上含有可被交換的團上含有可被交換的H+或或Cl-的氫型陽離子交換樹脂或氯型陰離子交的氫型陽離子交換樹脂或氯型陰離子交換樹脂。換樹脂。如果需要鈉型陽離子交換樹脂，則用NaCl處理氫型陽離子交換樹脂。物理處理：水洗、過篩、去雜，以

31、獲得粒度均勻的樹脂顆粒；化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型（氫型或鈉型）：陽離子樹脂：酸堿酸；陰離子樹脂：堿酸堿；最后以去離子水或緩沖液平衡。2. 上柱交換 上柱交換是離子交換的關(guān)鍵，要求將所需上柱交換是離子交換的關(guān)鍵，要求將所需要吸附的離子吸附完全，且比較集中。要吸附的離子吸附完全，且比較集中。 交換可以采用順流進行（原液自上向下流過樹脂層）或逆流（原液自下向上流過樹脂層）進行。2. 上柱交換 隨著含離子（隨著含離子（B）溶液不）溶液不斷流入，交換帶逐漸向下斷流入，交換帶逐漸向下移動，最后到達底部，使移動，最后到達底部，使B離子漏出，這點稱為漏離子漏出，這點稱為漏出點（目標產(chǎn)物掛不上柱出點（目標產(chǎn)物掛不上柱子了

32、）。子了）。 交換至漏出點時，應(yīng)停止交換，進行洗脫或者再生。 實際應(yīng)用中要求交換帶寬實際應(yīng)用中要求交換帶寬度越窄越好，這樣樹脂的度越窄越好，這樣樹脂的有效交換容量大，柱子的有效交換容量大，柱子的利用率高。利用率高。3. 洗脫 對生物大分子進行分離純化可采用兩種方式：一是將目的一是將目的產(chǎn)物離子化，被交換到介質(zhì)上，雜質(zhì)不被吸附，從柱子中產(chǎn)物離子化，被交換到介質(zhì)上，雜質(zhì)不被吸附，從柱子中流出，目的產(chǎn)物經(jīng)洗脫收集，稱為正吸附。流出，目的產(chǎn)物經(jīng)洗脫收集，稱為正吸附。 這種方法的優(yōu)點是目的產(chǎn)物純度高，而且可達到濃縮目的，適宜處理目的產(chǎn)物濃度低且工作液量大的溶液。 另一方法是將雜質(zhì)離子化后被交換，而目的產(chǎn)

33、物不被交換另一方法是將雜質(zhì)離子化后被交換，而目的產(chǎn)物不被交換直接流出收集，這種方式稱為負吸附。直接流出收集，這種方式稱為負吸附。采用這種方法可除去大部分的雜質(zhì)，適用于目的產(chǎn)物濃度高的工作液，但此方法的產(chǎn)物純度不高。 洗脫：就是用親和力更強的同性離子取代樹脂上吸附的目洗脫：就是用親和力更強的同性離子取代樹脂上吸附的目的產(chǎn)物。的產(chǎn)物。4. 樹脂的再生 離子交換樹脂在工作過程中逐漸吸附被處理液中的雜質(zhì)，經(jīng)過一段時間后就接近“飽和”狀態(tài)，離子交換能力降低，需要進行再生處理。 再生反應(yīng)是交換吸附的逆反應(yīng)。再生反應(yīng)是交換吸附的逆反應(yīng)。樹脂使用失效之后，要先用清水洗滌，然后用再生劑再生，最后用清水洗至所需p

34、H值。 再生劑的種類應(yīng)根據(jù)樹脂的離子類型來選擇。例如鈉型強再生劑的種類應(yīng)根據(jù)樹脂的離子類型來選擇。例如鈉型強酸性樹脂用酸性樹脂用NaCl溶液再生。溶液再生。 在實際生產(chǎn)中，樹脂的恢復(fù)程度通常為70-80%，再要提高，再生劑的消耗量大大增加，很不經(jīng)濟。 離子交換樹脂使用一段時間后，性能逐漸下降，知道不符合要求，此時就需要更新。三、樹脂和操作條件的選擇 樹脂的選擇： 對于離子型產(chǎn)品（或雜質(zhì)），可以采用離子交換法來提取或脫除。首先是要選擇合適的樹脂，一般來說，對強堿性離子宜采一般來說，對強堿性離子宜采用弱酸性樹脂，這樣吸附比較容易。吸附用弱酸性樹脂，這樣吸附比較容易。吸附大分子離子，應(yīng)選擇交聯(lián)度較低

35、的樹脂，大分子離子，應(yīng)選擇交聯(lián)度較低的樹脂，便于大分子擴散到樹脂內(nèi)部。但交聯(lián)度也不能過低，否則會影響樹脂的選擇性和機械強度。操作條件的選擇 （1）交換時的）交換時的pH：pH值應(yīng)在產(chǎn)物穩(wěn)定范圍內(nèi)，使產(chǎn)物離子化，使樹脂能解離。 （2）樹脂的型式：）樹脂的型式：一般來說，對弱酸性和弱堿性樹脂，應(yīng)采用鈉型或氯型，而對強酸性和強堿性樹脂，可以采用任何形式。 （3）溶液中產(chǎn)物濃度）溶液中產(chǎn)物濃度：低價離子增加濃度有利于交換上樹脂，高價離子在稀釋時容易被吸附。 （4）洗脫條件）洗脫條件：洗脫條件一般應(yīng)和吸附條件相反。如吸附在堿性下進行，解吸應(yīng)在酸性下進行。另外，為使在解吸過程中，pH變化不致過大，有時宜選

36、用緩沖液作洗脫變化不致過大，有時宜選用緩沖液作洗脫劑。劑。軟水和無鹽水的制備 天然水中都不同程度含有硬度離子（Ca2+、Mg2+），這些硬度離子是鍋爐結(jié)垢的主要成分。利用鈉型離子交換樹脂利用鈉型離子交換樹脂去除鈣鎂離子后的水稱為軟水。去除鈣鎂離子后的水稱為軟水。軟水主要是給鍋爐給水。 無鹽水是將原水中的所有溶解性鹽類、游離的酸、堿離子無鹽水是將原水中的所有溶解性鹽類、游離的酸、堿離子除去。除去。 無鹽水的用途十分廣泛，如高壓鍋爐的補給水、實驗室用實驗室用的去離子水，的去離子水，制藥、食品行業(yè)的無鹽純水等。 離子交換法制備無鹽水是將原水通過氫型陽離子交換樹脂和羥型陰離子交換樹脂，經(jīng)過離子交換反應(yīng)

37、，將水中的陰、陽離子除去，從而制得純度很高的無鹽純水。 陽離子交換樹脂失效后，一般用一定濃度的鹽酸或硫酸再生。陰離子交換樹脂失效后，一般采用5%-8%的氫氧化鈉再生。軟水和無鹽水的制備原水經(jīng)過陰、陽樹脂一次交換，稱為一級交換。原水經(jīng)過陰、陽樹脂一次交換，稱為一級交換。交換過程是由一個陽離子交換樹脂床和一個陰離子交換樹脂床來完成，所以這種系統(tǒng)稱為一級復(fù)床系統(tǒng)。為了制備純度較高的無鹽純水，常常把幾個陽離子交換器和幾個陰離幾個陽離子交換器和幾個陰離子交換器串聯(lián)起來，組成多床多塔除鹽系統(tǒng)子交換器串聯(lián)起來，組成多床多塔除鹽系統(tǒng)，但再多的復(fù)床也是有限的，因此發(fā)展了混合床離子交換系統(tǒng)。將陰、陽離子交換樹脂裝

38、在同一個交換器內(nèi)直接進行離子交換除鹽的將陰、陽離子交換樹脂裝在同一個交換器內(nèi)直接進行離子交換除鹽的系統(tǒng)稱為混合床離子交換系統(tǒng)。系統(tǒng)稱為混合床離子交換系統(tǒng)。在混合床中的陰陽離子交換樹脂均勻地混合在一起，好像無數(shù)對陽、在混合床中的陰陽離子交換樹脂均勻地混合在一起，好像無數(shù)對陽、陰離子樹脂串聯(lián)一樣。陰離子樹脂串聯(lián)一樣。此時，H+型陽樹脂交換反應(yīng)游離出的H+和OH-型陰離子樹脂交換反應(yīng)游離出來的OH-在交換器內(nèi)立即得到中和，所以混合床的反應(yīng)完全，脫鹽效果很好?；旌洗驳姆磻?yīng)完全，脫鹽效果很好。離子交換技術(shù)在生物工程的應(yīng)用 使用離子交換樹脂可以從發(fā)酵液中富集和純化產(chǎn)物。 氨基酸是一類含有氨基和羧基的兩性化

39、合物，在不同的pH條件下能以正離子、負離子或兩性離子的形式存在。因此，應(yīng)用陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂可以富集分離氨基酸。離子交換技術(shù)在生物工程的應(yīng)用 利用離子交換樹脂可以選擇性地吸附分離多種離子型抗生素，不僅回收率較高，而且得到的產(chǎn)品純度較好。 一些抗生素具有酸性基團，如芐基青霉素和新生霉素等，在中性或弱堿條件下以負離子的形式存在，故能以陰離子交換樹脂提取分離。 應(yīng)用陰離子交換樹脂，可從動物、植物和微生物發(fā)酵液中提取分離天然有機酸、核苷酸和脫氧核苷酸、維生素、酶、輔酶等。第五節(jié) 生化用離子交換劑的特點和種類 一、生化用離子交換劑的特點：一、生化用離子交換劑的特點： 1.親水性及生物相容性：

40、親水性及生物相容性： 親水性樹脂在水中充分溶脹后成為水溶膠類物質(zhì)，為活性大分子提供適宜的為緩解，這類離子交換劑與生物大分子具有良好的生物相容性。 2. 孔結(jié)構(gòu)：孔結(jié)構(gòu)：生化用離子交換劑在分離中兼有分子篩與離子交換的雙重作用，要求孔徑分布更加均勻。 3. 電荷密度：電荷密度：電荷密度應(yīng)該適當，這樣才有利于生物大分子的分離純化。 4. 粒度：粒度：粒徑小，一般在20-30微米范圍內(nèi)。生物大分子擴散速率小，運動阻力大，要提高交換速度只能減少粒徑。第五節(jié) 生化用離子交換劑的特點和種類 5. 純度。純度。生化用介質(zhì)分以下幾個等級（1）工業(yè)級；（2）分析級；（3）生物技術(shù)級；（4）分子生物級。 最高的是分

41、子生物級最高的是分子生物級。這類介質(zhì)的物化性能與一般離子交換劑無明顯差異，但要求介質(zhì)中無核酸內(nèi)切酶、外切酶，也無連接酶抑制劑，也叫DNA級。二、生化用離子交換劑的種類 常用的有兩大類：常用的有兩大類： （1）纖維素類）纖維素類：離子交換纖維是最早用于生物大分子分離的介質(zhì)，具有松散的親水網(wǎng)絡(luò)、大孔、大的表面積等優(yōu)點。 （2）葡聚糖系）葡聚糖系Sephadex離子交換劑離子交換劑。這種離子交換劑不溶于水及各種溶劑。使用時要避免強酸強堿溶液。中性pH值時可用。有兩種孔度，具有較高的容量。 另外，還有瓊脂糖系離子交換劑，Momo beads系離子交換劑，聚丙烯酸羥乙基酯系離子交換劑等。不是很常用。思考

42、題 1、簡述離子交換原理。 2、對有實用意義的離子交換樹脂有什么要求？ 3、有哪些因素影響離子交換反應(yīng)速度？ 4、如何制備軟水和無鹽水？生物工業(yè)下游加工技術(shù)生物工業(yè)下游加工技術(shù)李剛 副教授第十二章第十二章 色譜分離色譜分離 第一節(jié)第一節(jié) 概論概論 第二節(jié)第二節(jié) 色譜分離的分類色譜分離的分類 第三節(jié)第三節(jié) 生物工業(yè)中的色譜分離生物工業(yè)中的色譜分離 第四節(jié)第四節(jié) 色譜分離的基本原理色譜分離的基本原理 第五節(jié)第五節(jié) 柱色譜分離法柱色譜分離法 第六節(jié)第六節(jié) 親和色譜親和色譜知識要點 （1）掌握各種色譜分離技術(shù)的特點特點及適應(yīng)適應(yīng)范圍范圍。 （2）理解色譜分離方法的基本原理基本原理。 （3）了解色譜分離

43、方法的分類分類。第一節(jié) 概述 色譜分離色譜分離（Chromatographic Resolution， CR）：也稱色層分離或?qū)游龇蛛x（蛋白質(zhì)層析儀）層析分離（蛋白質(zhì)層析儀），在分析檢測中常稱為色譜分析。它是一種物理的分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)性質(zhì)（吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相（固定相和流動相）中。當同程度分布在兩個相（固定相和流動相）中。當多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移

44、動，使之分化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動，使之分離。離。色譜分離法的發(fā)展歷史 1903年俄國植物學(xué)家茨維特用菊根粉研究植物色素的提取植物色素的提取物物，以石油醚作為洗脫劑，得到分離的黃色、綠色區(qū)帶，得到分離的黃色、綠色區(qū)帶，故稱為色譜分離法。故稱為色譜分離法。 1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體，顯示了本方法具有極高的分辨率。 50年代氣象色譜的出現(xiàn)，為色譜分離儀器化奠定了雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)。 60年度高效液相色譜的發(fā)展，使高效固定相填料獲得了突破性的進展。 在此后的20多年中，氣相色譜和液相色譜在分析化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，尤其是對多組分復(fù)雜體系的分析占了絕對的統(tǒng)治地位。色譜分離法的

45、發(fā)展歷史 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對生物產(chǎn)品的分離往往達不到所需的純度要求，色譜分離成色譜分離成為分離技術(shù)的研究重點，并在理論上從線為分離技術(shù)的研究重點，并在理論上從線性色譜發(fā)展到非線性色譜性色譜發(fā)展到非線性色譜。 近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了全色譜分離和純化治全色譜分離和純化治療蛋白的工藝療蛋白的工藝，使人們對加寬色譜分離應(yīng)用范圍的研究更趨活躍。色譜分離的基本特點 （1）分離效率高：色譜分離的效率是所有分離純化技術(shù)分離效率高：色譜分離的效率是所有分離純化技術(shù)中最高的。中最高的。由于分離效率高，通常使用的色譜柱長只有幾厘米到幾十厘米。這種高效的分離尤其適合于極復(fù)雜混合這種高效的分離尤其適合于極復(fù)雜混合物的分

46、離。物的分離。 （2）應(yīng)用范圍廣：色譜分離的應(yīng)用范圍之廣也是其他分色譜分離的應(yīng)用范圍之廣也是其他分離技術(shù)無法相比的，離技術(shù)無法相比的，從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子等都可用色譜方法分離，尤其對生物大尤其對生物大分子樣品的分離，是其他方法無法取代的。分子樣品的分離，是其他方法無法取代的。 （3）選擇性強。選擇性強。色譜分離技術(shù)的可變參數(shù)之多可變參數(shù)之多也是其他分離技術(shù)無法相比的。因而具有很強的選擇性。在色譜分離中，可通過多種途徑選擇不同的操作參數(shù)，以適應(yīng)各種適應(yīng)各種不同樣品的分離要求不同樣品的分離要求。色譜分離的基本特點 （4）高靈敏度的在線檢測高靈敏度的在線檢測：與其他分離方

47、法相比，色譜分離具有高靈敏度在線檢測的特性。在分離與純化過程中，可根據(jù)不同的物理與化學(xué)原理，采用不同的高靈敏度檢采用不同的高靈敏度檢測器進行連續(xù)的在線檢測測器進行連續(xù)的在線檢測，以保證在要求的純度下得到最高的產(chǎn)率。 （5）快速分離快速分離：高效細顆粒層析劑和高壓液相色譜分離技術(shù)的采用，保證了在高分離效率前提下的高分離速率，從而可以提高單位時間的產(chǎn)量。 （6）過程自動化操作過程自動化操作。計算機的應(yīng)用計算機的應(yīng)用使色譜分離過程自分離過程自動化動化，可按預(yù)先設(shè)置的程序進行完全自動化的操作，保證保證了產(chǎn)品的質(zhì)量，提高了產(chǎn)率，節(jié)省了勞動力，降低了生產(chǎn)了產(chǎn)品的質(zhì)量，提高了產(chǎn)率，節(jié)省了勞動力，降低了生產(chǎn)成

48、本。成本。色譜分離的缺點 （1）儀器設(shè)備昂貴儀器設(shè)備昂貴，一次性投入比較大。 （2）要消耗溶劑用于分離，有時消耗的溶消耗的溶劑量比較大。劑量比較大。 （3）有些能與分離介質(zhì)反應(yīng)的物質(zhì)不能用色譜法分離。第二節(jié) 色譜分離的分類 一、按分離機理分離機理分類： （1）吸附色譜分離； （2）分配色譜分離； （3）離子交換色譜； （4）凝膠色譜； （5）親和色譜；吸附色譜 吸附色譜（Adsorption Chromatography, AC）是指混合物隨流動相通過固定相（吸是指混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。力

49、不同而使混合物分離的方法。 吸附色譜是各種色譜分離技術(shù)中應(yīng)用最早的一類，所用吸附劑一般為有機基質(zhì)并通過化學(xué)修飾后制成。它們都有比較明確的作用機理作用機理，即疏水作用疏水作用，螯合作用螯合作用和共價共價作用作用。分配色譜 分配色譜（Distribution Chromatography, DC）:因流動相和固定相都是液體，因此又稱為液液色譜。其原理是利用其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離?；旌衔镏懈魑镔|(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。 根據(jù)分配原理進行色譜分離的操作方法有兩種：一種是柱一種是柱（紙或板）色譜分離法，（紙或板）色譜分離法，其固定相是將與流動相互不相溶的液體涂漬

50、到載體上形成的；另一種是逆流分配法另一種是逆流分配法，其固定相和流動相都放在一組特別的分配管中，用來完成這種操作的儀器稱為逆流分配儀。 根據(jù)固定相和流動相的極性與非極性的差別，分配色譜又根據(jù)固定相和流動相的極性與非極性的差別，分配色譜又可分為正向色譜和反相色譜?？煞譃檎蛏V和反相色譜。正向色譜的固定相與極性，流動相為非極性。而反相色譜則相反。離子交換色譜 離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography, IEC）:是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，由

51、于混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和由于混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。力而將它們分離。 該法適合于離子和在溶劑中可發(fā)生電離的物質(zhì)的分離。特別是在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)特別是在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)的分離純化中，離子交換色譜分離占主導(dǎo)地位。的分離純化中，離子交換色譜分離占主導(dǎo)地位。凝膠色譜凝膠色譜（Gel Chromatography，GC）：以凝膠為固定相，是一種以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜色譜（Molecular Sieve Chrom

52、atography，MSC）、空間排阻色譜或尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography, SEC）。凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個顆粒的細微結(jié)構(gòu)就如一個篩子。當混合物隨流動相流經(jīng)凝膠時，較大的分當混合物隨流動相流經(jīng)凝膠時，較大的分子不能進入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，它們將與流動相一起首先流子不能進入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，它們將與流動相一起首先流出；較小的分子能進入部分凝膠網(wǎng)孔，流出的速率較慢；更小的分子出；較小的分子能進入部分凝膠網(wǎng)孔，流出的速率較慢；更小的分子能進入全部凝膠網(wǎng)孔，而最后從凝膠柱中流出。能進入全部凝膠網(wǎng)孔，而最

53、后從凝膠柱中流出。凝膠色譜按其流動相的不同分為兩大類：一類是水相系統(tǒng)一類是水相系統(tǒng)，稱為凝膠稱為凝膠過濾色譜，其所用凝膠是親水性的過濾色譜，其所用凝膠是親水性的，用來分離水溶性大分子化合物；另一類是有機相系統(tǒng)，稱為凝膠滲透色譜，其所用凝膠是疏水性的，另一類是有機相系統(tǒng)，稱為凝膠滲透色譜，其所用凝膠是疏水性的，用來分離油溶性的高分子化合物。親和色譜 親和力：生物體中許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)親和力：生物體中許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如抗原與抗體。生物分子間的專一分子可逆結(jié)合的特性，如抗原與抗體。生物分子間的這種專一結(jié)合能力稱為親和力。的這種專一結(jié)合能力稱

54、為親和力。 親和色譜：利用與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固利用與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相定化后作為固定相，則當含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相時，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來）流經(jīng)此固定相時，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。這種技術(shù)稱為親和色譜。這種技術(shù)稱為親和色譜。 離子交換作用和親和作用也可看作特殊的吸附作用離子交換作用和親和作用也可看作特殊的吸附作用，因此因此也可把離子交換色譜和親和色譜歸類于吸附色譜。也可把離子交換色譜和親和色譜歸類于吸附色譜。親和色譜作為色譜分離技術(shù)的一個分支，對于生物大分子化合物的分離純

55、化具有特別重要的意義。二、按固定相形狀不同分類 1、柱色譜分離柱色譜分離：各種不同的色譜分離都可在柱子中進行在柱子中進行。柱色譜就有進行量大和回收容易等優(yōu)點，但其分辨率不如紙上色譜和薄層色譜高。 、紙上色譜分離（紙層析）紙上色譜分離（紙層析）：是以濾紙是以濾紙為載體為載體，以濾紙纖維及其結(jié)合水作為固定相，以有機溶劑作為流動相的分配色譜分離。紙上色譜分離具有設(shè)備簡單、操作方設(shè)備簡單、操作方便、分離效率高、所需樣品量少便、分離效率高、所需樣品量少等優(yōu)點，被廣泛用于定性與定量分析。二、按固定相形狀不同分類 3、薄層色譜分離（薄層層析薄層層析）：是將固定是將固定相在玻璃平板上鋪成薄層而進行分離的一相在

56、玻璃平板上鋪成薄層而進行分離的一種分離技術(shù)。種分離技術(shù)。 根據(jù)玻璃平板上所涂固定相的不同，薄層薄層色譜又分為薄層吸附色譜、薄層分配色譜色譜又分為薄層吸附色譜、薄層分配色譜、薄層離子交換色譜和薄層凝膠色譜等。、薄層離子交換色譜和薄層凝膠色譜等。 薄層色譜是柱色譜和紙上色譜兩者的結(jié)合，兼有兩者的優(yōu)點，如操作簡便、分離效操作簡便、分離效率高、分離速度快和適合不同分離機理的率高、分離速度快和適合不同分離機理的色譜分離等。色譜分離等。三、其他分類方法 （1）根據(jù)流動相的物態(tài)不同，可分為氣相色譜分氣相色譜分離、液相色譜分離和超臨界色譜分離離、液相色譜分離和超臨界色譜分離。在生物制備和工業(yè)分離中應(yīng)用最廣泛的

57、是液相色譜（Liquid Phase Chromatography，LPC）。 （2）根據(jù)操作壓力不同，可分為低壓色譜分離、中壓色譜分離和高壓色譜分離。高壓液相色譜分高壓液相色譜分析就是大家經(jīng)常接觸到的析就是大家經(jīng)常接觸到的HPLC。 （3）根據(jù)洗脫操作時展開方式的不同，可分為洗洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法三種脫展開法、前沿分析法和置換展開法三種。第三節(jié) 生物工業(yè)中的色譜分離 從理論分析得出，色譜和電泳是目前所知色譜和電泳是目前所知最好的兩種分離方法。最好的兩種分離方法。但因為種種原因，電泳法目前尚不能用于生產(chǎn)規(guī)模的生物大分子的分離與純化。 所以目前分離和純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、目前分離和

58、純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等生物大分子主要用色譜技術(shù)。多糖等生物大分子主要用色譜技術(shù)。特別是在基因工程產(chǎn)品中，色譜分離占有核心地位。一、色譜分離的規(guī)模 與一般分離技術(shù)相比，色譜分離技術(shù)的規(guī)模是相當小的，可分為以下四類： 1、色譜分析色譜分析：20g/d 雖然看上去產(chǎn)量很小，但其實產(chǎn)值相當高。比如干擾素的售價為干擾素的售價為1萬元萬元/mg,只要采用只要采用半制備規(guī)模，年產(chǎn)值可到半制備規(guī)模，年產(chǎn)值可到1億元以上。億元以上。二、色譜分離方法的選擇 （1）目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、及分子量的大小； （2）主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)的成分與含量； （3）目的產(chǎn)

59、物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。二、色譜分離方法的選擇 對于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子對于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，由于它們分子量大，具有活性和生物專一親和性，經(jīng)常采經(jīng)常采用離子交換色譜、疏水作用色譜、凝膠色譜和親用離子交換色譜、疏水作用色譜、凝膠色譜和親和色譜等。和色譜等。 對于生物小分子的代謝物對于生物小分子的代謝物，由于它們分子量小，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較穩(wěn)定，操作條件不太苛刻，常采常采用吸附、分配和離子交換色譜。用吸附、分配和離子交換色譜。其中，氨基酸、有機酸、核苷酸等一些離子型化合物的生產(chǎn)多用離子交換色譜分離；而抗生素、生物堿、萜類、色素等次級代謝產(chǎn)物多用吸附色譜或反相分配色譜分離

60、。三、分析色譜與制備色譜及工業(yè)色譜的比較 1、應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同：、應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同： 分析色譜的流動相包括氣相和液相氣相和液相，固定相包括柱子、紙柱子、紙和薄板和薄板，而制備和工業(yè)色譜主要采用液相液相為流動相的柱上柱上色譜色譜。 2、操作上的不同：、操作上的不同： 在分析色譜中，進樣量越小越好，檢測靈敏度越高越佳進樣量越小越好，檢測靈敏度越高越佳。在制備和工業(yè)色譜中，則要求進樣量越多越好進樣量越多越好，色譜柱也應(yīng)適當大些，以便分離和純化較多的產(chǎn)品。三、分析色譜與制備色譜及工業(yè)色譜的比較 3、色譜分離理論上的不同：、色譜分離理論上的不同： 分析色譜分離的好壞與理論塔板數(shù)有明顯的關(guān)系，