基因工程復(fù)習(xí)

1、基因工程原理與應(yīng)用期末復(fù)習(xí)資料 提供者：友哥第一章 緒論1、基因工程的核心內(nèi)容是基因體外重組(DNA體外重組) 。2、基因工程的四大要素(或基本條件)：目的基因、載體、工具酶、受體。3、基因工程誕生技術(shù)基礎(chǔ)：限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割； DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接；基因工程載體的構(gòu)建與應(yīng)用。 4、1973年，斯坦福大學(xué)的S.Cohen研究小組的DNA體外重組和大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。這一實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著基因工程的誕生，因此，1973年被定為基因工程誕生的元年。 5、1982年首次通過(guò)顯微注射培育出世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠。 1983年采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基

2、因植物轉(zhuǎn)基因煙草。 6、基因工程的基本操作程序（基本操作內(nèi)容）：分離獲得帶有目的基因的DNA片段及載體選擇與構(gòu)建。限制性核酸內(nèi)切酶分別切割外源DNA和載體。通過(guò)DNA連接酶將外源基因DNA片段連接到載體上，形成重組DNA分子。將重組 DNA分子引入到受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化)。帶有重組體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)的擴(kuò)增及選擇培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化體的鑒定，獲得外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。目的基因的進(jìn)一步研究分析，并設(shè)法使之實(shí)現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)(基因功能研究或基因改造研究)。 7、轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體的定義第二章 基因工程的工具酶1、工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶類(lèi)。根據(jù)其用途分為四類(lèi)：限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶、修

3、飾酶。2、限制作用(restriction)：指一定類(lèi)型的細(xì)菌可以通過(guò)限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。這是維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。 修飾作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過(guò)甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。這是宿主細(xì)胞識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的作用機(jī)制。3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名：限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母(大寫(xiě)，斜體)代表該酶的宿主菌屬名(genus)第一個(gè)字母；第二、三個(gè)字母(小寫(xiě)，斜體)代表宿主菌種名(species)前兩個(gè)字母。第四個(gè)字母代表宿主菌的菌株名的第一個(gè)字母(

4、小寫(xiě)，正體)或染色體外成分(質(zhì)?；蚴删w，大寫(xiě)，正體)。若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示(正體)。 Haemophilus influenzae d 流感嗜血桿菌d株 Hind Hind 4、II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列：一般為46bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，稱為稀有切割限制酶。有些為反向重復(fù)序列(間斷回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶的識(shí)別序列中，某一位或二位堿基并非嚴(yán)格專(zhuān)一，如Hind II可識(shí)別4種核苷酸序列。 酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列BamH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal

5、IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAG5、II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式：大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶均在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3位的酯鍵，產(chǎn)生3端為羥基、5端為磷酸基團(tuán)的片段。有三種切割方式：在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的5末端切割，產(chǎn)生5黏性末端，如 EcoRI。在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的3端切割，則產(chǎn)生3黏性末端， 如PstI。在識(shí)

6、別序列的對(duì)稱軸上切割，產(chǎn)生平頭末端，如 PvuII。有些識(shí)別序列為間斷型回文序列的II限制酶，其切點(diǎn)位于不確定核苷酸中，如：Bgl I ：GCCNNNNNGGC Sfi I ：GGCCN NNNNNGGCC Xmn I ：GAANNNNTTC 有極少數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別序列，如 Mbo II識(shí)別 GAAGA序列，切割位點(diǎn)則是：5 GAAGANNNNNNNN N 3 3 CT TC TNNNNNNNN N56、同裂酶是指識(shí)別序列相同、切割方式相同或不同、來(lái)源不同的II限制性核酸內(nèi)切酶。同尾酶是指來(lái)源各異、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的黏性末端的II限制性核酸內(nèi)切酶。7、II型限

7、制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)（1）標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立：反應(yīng)體積一般為20l(根據(jù)DNA量可適當(dāng)擴(kuò)大)。 10酶切緩沖液 2l(大部分酶反應(yīng)緩沖液基本相似：50mmol/LTris-HCl pH7.07.5、0100mmol/L NaCl、 10mmol/L MgCl2、 1mmol/L DTT)；酶(根據(jù)酶活力大小及工作性質(zhì)確定酶量，不超過(guò)反應(yīng)總體積10 ；DNA樣品( gmg)；無(wú)菌水。 限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)活力單位(U)為：在合適的溫度和緩沖液中，在 20 L反應(yīng)體系中，1h完全降解 1ug 標(biāo)準(zhǔn)DNA所需要的酶量。 （2）限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的不完全酶解（應(yīng)用在哪些方面）：不完全酶解對(duì)

8、于構(gòu)建物理圖譜和基因組文庫(kù)是非常必要的。其方法有減少酶量、增加反應(yīng)體積、縮短反應(yīng)時(shí)間和降低反應(yīng)溫度等。 8、星號(hào)活性是指在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列相似的序列的特性。引起星號(hào)活性的原因有：高甘油含量，大于5%；酶用量過(guò)大，大于100U/微克DNA；低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L； 高pH，大于8.0；含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等；Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子的存在。常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 9、DNA連接酶是指能催化雙鏈DNA分子內(nèi)或分子間的5-

9、磷酸基和3-羥基生成磷酸二酯鍵而使DNA鏈連接的一類(lèi)酶。DNA連接酶的種類(lèi)：（1）T4 噬菌體DNA 連接酶(T4 DNA 連接酶)（重點(diǎn)） 平頭末端的Km比黏性末端的Km高約1000倍。提高平頭末端連接效率的方法：加大酶濃度(10100倍于粘性末端)； 加大底物濃度； 加入適量的一價(jià)陽(yáng)離子(150-200 mmol/L NaCl)； 加入低濃度的PEG(10%PEG8000)。ATP的最適終濃度為 0.5 mmol/L。（2）大腸桿菌DNA連接酶（3）T4噬菌體RNA連接酶 10、DNA連接酶的反應(yīng)體系：10L或20L，DNA片段，連接酶，Buffer，溫度(1216或30)，時(shí)間(416h

10、) Buffer：50mmol/LTris-HCl pH7.6，10mmol/L MgCl2， 0.5mmol/L ATP，5mmol/L DTT11、影響連接反應(yīng)的因素：DNA末端的濃度 連接產(chǎn)物的分子構(gòu)型(線形或環(huán)狀)與DNA濃度及DNA分子長(zhǎng)度存在密切關(guān)系。在一定濃度下，小分子DNA片段進(jìn)行分子內(nèi)連接，有利于形成環(huán)化分子。對(duì)于長(zhǎng)度一定的DNA分子，其濃度增加有利于分子間連接。此外，分子間連接還與兩種片段的末端濃度的比例有關(guān)。原則上一種片段的濃度大于另一一種片段的濃，如：在克隆中，插入片段:載體片段=2:1。12、切口平移作用（P26） 主要用途：切口平移法制備DNA探針13、對(duì)天然的T7

11、DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之降低或完全失去35的外切酶活性，而聚合酶活性增加了3倍。因此，修飾的T7 DNA聚合酶主要用于雙脫氧測(cè)序，又稱作為測(cè)序酶。14、Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶具有53聚合酶活性和53 外切酶活性，缺少35外切酶活性。其最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定(95以上高溫半小時(shí)不失活)，最適反應(yīng)溫度高(70 75)。因此，其主要用途是PCR及DNA測(cè)序(具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA)。 保真的PCR 酶有Tma DNA聚合酶(Thermotoa maritima 海棲熱袍菌)、Tli DNA聚合酶(Thermococcus litoralis 海棲熱球菌)、Pfu DNA聚合酶(Pyro

12、coccus furiosus 激烈火球菌)、 Pwo DNA聚合酶(Pyrococcus woesi 沃氏火球菌)。 15、商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶主要是鳥(niǎo)類(lèi)骨髓母細(xì)胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和Moloney鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，Mo-MLV) 逆轉(zhuǎn)錄酶。其用途有：合成cDNA第一鏈，構(gòu)建cDNA文庫(kù)；RT-PCR；以RNA為模板制備DNA探針；補(bǔ)平和標(biāo)記5-末端突出的DNA片段；代替Klenow酶用于DNA序列分析。16、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶) 用途：給載體和外源DNA (如cDN

13、A或隨機(jī)切割DNA)接上同聚物尾，以便連接；末端標(biāo)記17、核糖核酸酶H（作用底物） RNase H特異地降解DNA/RNA雜交雙鏈中的RNA鏈，產(chǎn)生具有3-OH和5-磷酸末端的寡核苷酸和單核苷酸，不能降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。其用途是產(chǎn)生cDNA第二鏈合成的引物。18、S1核酸酶的作用底物（P32）19、堿性磷酸酶的用途5末端標(biāo)記前的處理 ；去除載體片段的5磷酸基因，防止載體自身連接。 第三章 基因工程載體1、載體(vector)是指基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的“運(yùn)載工具”，其本質(zhì)是DNA復(fù)制子。必備基本條件：能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自主復(fù)制；具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；

14、具有合適的選擇標(biāo)記基因。2、質(zhì)粒載體的3個(gè)共同組分（P41）3、質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型 嚴(yán)緊型：嚴(yán)格受宿主控制，13拷貝 ；松弛型：不嚴(yán)格受宿主控制，10200拷貝 （P42） 4、理想質(zhì)粒載體的必備條件：具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) ；具有若干限制性酶的單一酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)，multiple cloning sites，MCS)；具有兩種以上的選擇標(biāo)記基因； 缺失mob基因或nic位點(diǎn)； 插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。 5、多克隆位點(diǎn)(多接頭，polylinker，或限制性酶切位點(diǎn)庫(kù)）是指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的DNA片段。6、載體構(gòu)

15、建的基本原則：根據(jù)基因操作的工作需要；符合理想載體的必備條件； 選擇適合的親本質(zhì)粒提供載體元件；盡量簡(jiǎn)化構(gòu)建程序7、pBR322的構(gòu)建的3個(gè)親本質(zhì)粒（P45）8、pUC系列載體（P48）、T載體9、分泌型表達(dá)載體與非分泌型表達(dá)載體的差異（P50）10、穿梭質(zhì)粒載體是指一類(lèi)由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。11、插入型載體：只具有一個(gè)克隆位點(diǎn)可供外源DNA插入的噬菌體載體?？寺∪萘枯^小，一般在10kb以內(nèi)，用于cDNA及小片段DNA的克隆。 取代型載體：具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)以使兩個(gè)位點(diǎn)之間的 DNA區(qū)段可以被外源DNA片段取代的噬菌體載體?？?/p>

16、隆容量較大，20kb左右，常用來(lái)構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)。 12、野生型噬菌體不能在在P2噬菌體的溶源菌中生長(zhǎng)，即為Spi+表型。當(dāng)其缺失red、gam基因，就能在P2溶源菌中能生長(zhǎng)并形成噬菌斑，便獲得Spi-表型。 這類(lèi)載體的中間填充片段上都具有red、gam基因，當(dāng)中間填充片段被外源DNA取代后，重組體便能在P2溶源菌中生長(zhǎng)并形成噬菌斑，而非重組體則不能在P2溶源菌中生長(zhǎng)，這種篩選重組體的方法稱為Spi-選擇。13、M13噬菌體載體的主要用途：DNA 測(cè)序；基因定點(diǎn)突變；探針制備。14、噬菌粒載體是一類(lèi)含有單鏈?zhǔn)删w(M13)復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體。15、黏粒載體是一類(lèi)含有噬菌體cos序列

17、的質(zhì)粒載體。又稱柯斯質(zhì)粒載體。黏粒載體的最大克隆容量為48kb(如pHS262)，最低為14kb(如pJC720)。 16、黏?？寺〈嬖诘膯?wèn)題及解決方案在連接反應(yīng)中，黏粒載體片段彼此首尾相連形成多聚體分子。解決方案：一是用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；二是使用Ish-Horowicz-Burke黏?？寺》桨?見(jiàn)下圖)；三是使用Bates-Swift黏粒克隆方案(雙cos序列的黏粒載體，見(jiàn)下圖)。 在連接反應(yīng)中，酶切的基因組DNA片段(特別是較小的DNA 片段)往往會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)或數(shù)個(gè)片段隨機(jī)再連接，串聯(lián)地插入到載體上，其連接順序并不符合基因組中排列順序。因此，DNA序列分析結(jié)果往往會(huì)出現(xiàn)

18、錯(cuò)誤。解決方案是將局部消化產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分級(jí)分離，獲得長(zhǎng)度為3145kbDNA片段。 17、酵母人工染色體(YAC) 酵母自主復(fù)制序列；酵母著絲粒；四膜蟲(chóng)端粒；酵母選擇性標(biāo)記(Trp1、Ura3、Sup4抑制宿主細(xì)胞ade2的琥珀突變)?？寺∪萘浚?002000kb 細(xì)菌人工染色體 (BAC) 來(lái)源于F質(zhì)粒?？寺∪萘浚?00kb；優(yōu)點(diǎn)：拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，比YAC易分離。 18、表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則：（1）閱讀框架與外源基因高效表達(dá) 表達(dá)載體一般都有三種變體，以適用于具不同閱讀框架酶切位點(diǎn)的基因表達(dá)。用人工接頭可以調(diào)節(jié)閱讀框架。（2）啟動(dòng)子與外源基因高效表達(dá) 轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要的限

19、速步驟。選擇強(qiáng)啟動(dòng)子增強(qiáng)子是構(gòu)建高效表達(dá)載體的首要問(wèn)題。（3）轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達(dá) 除去衰減子；插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列； 強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列；原核生物一般用rrnB。真核生物poly(A) 位點(diǎn)。（4）有效的翻譯起始與外源基因高效表達(dá)（5）終止密碼與外源基因高效表達(dá) 原核生物表達(dá)載體：UAA，或幾個(gè)終止密碼串聯(lián)。（6）密碼子選擇與外源基因高效表達(dá) 消除基因中的限制密碼，以其他同義密碼替代。（7）外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達(dá) 構(gòu)建融合表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白；構(gòu)建分泌表達(dá)載體，表達(dá)分泌蛋白。（8）減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷 特別是毒性蛋白。使用誘導(dǎo)啟動(dòng)子合理地調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源

20、基因高效表達(dá)的關(guān)系。 19、常用的組成型啟動(dòng)子 花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、胭脂堿合成酶基因(Nos)啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合成酶基因(Ocs)啟動(dòng)子20、報(bào)告基因是指用于檢測(cè)與其組裝在一起的外源基因在導(dǎo)入細(xì)胞后是否表達(dá)的一種指示基因。常用的有：冠癭堿合成酶基因；-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)熒光素酶基因或GFP基因 第四章 核酸操作的基本技術(shù)1、核酸提取純化的基本程序：細(xì)胞破碎； 抽提(除去蛋白質(zhì)、多糖、脂、其他核酸等雜質(zhì))； 核酸沉淀(乙醇、異丙醇)；核酸溶解與保存。 2、核酸的凝膠電泳原理：在一定條件下，核酸分子的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，當(dāng)被放在電場(chǎng)中，它們就會(huì)向正極方向遷移。在無(wú)反應(yīng)活

21、性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)中，其遷移速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的磨擦系數(shù)成反比(分子大小、介質(zhì)粘度系數(shù))。因此，在同一凝膠中、一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，核酸分子的遷移速度取決于核酸分子大小和構(gòu)型。3、染色（P102、103）4、將具有核酸印跡的膜與帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交。故也稱印跡雜交。5、探針(probe)是指分子雜交中經(jīng)放射性或非放射性等物質(zhì)標(biāo)記的已知或特定的DNA或RNA片段。探針：（1）DNA探針 雙鏈DNA探針，單鏈DNA探針（2）RNA探針 單鏈RNA探針 或放射性標(biāo)記探針(同位素標(biāo)記探針)和非放射性標(biāo)記探針(非同位素標(biāo)記探針)6、同位素標(biāo)

22、記探針 酶促標(biāo)記法：切口平移標(biāo)記法；制備雙鏈DNA探針。隨機(jī)引物標(biāo)記法；制備雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA探針。操作簡(jiǎn)單方便，標(biāo)記活性高，可達(dá)108cpm/gDNA。PCR標(biāo)記法。探針純化：乙醇沉淀法、葡聚糖凝膠柱層析法。雜交檢測(cè)：放射自顯影。 7、核酸分子雜交的類(lèi)型：Southern DNA 印跡雜交(Southern 印跡雜交、Southern blotting)；Northern RNA印跡雜交(Northern 印跡雜交，Northern blotting)；斑點(diǎn)印跡雜交(dot blotting)；原位雜交(hybridization in situ)。8、SouthernDNA 印

23、跡雜交操作步驟：DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分離；凝膠預(yù)處理；包括酸脫嘌呤、堿變性等；凝膠中DNA印跡到雜交膜上；毛細(xì)管虹吸印跡法、電印跡法、真空印跡法。DNA固定；80烤膜、紫外交聯(lián)。 雜交；包括預(yù)雜交(封閉劑)、探針雜交、洗脫。雜交信號(hào)檢測(cè)；放射自顯影(2ng DNA/帶)或顯色反應(yīng)。結(jié)果分析。 第五章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1、PCR原理：遵循DNA體內(nèi)復(fù)制原理，半保留式擴(kuò)增；擴(kuò)增序列取決于設(shè)計(jì)一對(duì)引物(正向引物、反向引物)，有效擴(kuò)增長(zhǎng)度為2kb左右；擴(kuò)增循環(huán)包含變性、退火、延伸3個(gè)階段；3035個(gè)循環(huán)后，目標(biāo)序列呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增(2n-2)。2、平臺(tái)效應(yīng)是指PCR反應(yīng)后期擴(kuò)增產(chǎn)物不再隨循環(huán)次數(shù)而明顯

24、上升、反應(yīng)曲線變得平坦的現(xiàn)象。引起平臺(tái)效應(yīng)的因素：dNTP或引物等消耗殆盡； 酶活性逐漸降低； 最終產(chǎn)物的阻化作用(焦磷酸鹽、雙鏈DNA)； 非特異性產(chǎn)物與模板的競(jìng)爭(zhēng)作用； 在高產(chǎn)物濃度下產(chǎn)物變性不完全； 低濃度的非特異產(chǎn)物開(kāi)始大量擴(kuò)增。3、引物設(shè)計(jì)的一般原則（P116）4、逆轉(zhuǎn)錄PCR( RT-PCR)是指先以mRNA，以oligo(dT)n為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，然后用已知一對(duì)引物擴(kuò)增cDNA片段的技術(shù)。5、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE，錨定PCR)（P121）6、反向PCR的定義、鍋柄PCR的原理（P123） 7、熒光定量PCR (實(shí)時(shí)定量PCR) 熒光染料(EB)：

25、結(jié)合雙鏈DNA會(huì)使熒光增強(qiáng)，但結(jié)合無(wú)特異性。 熒光標(biāo)記探針(見(jiàn)圖)：利用Taq酶的外切酶活性，擴(kuò)增時(shí)切斷探針釋放出熒光基團(tuán)，使熒光增強(qiáng)。特異性強(qiáng)。用途：檢測(cè)病原菌、基因表達(dá)。 第六章 基因文庫(kù)的構(gòu)建與目的基因的獲得1、基因組文庫(kù)構(gòu)建的程序：（1）基因組DNA克隆片段的制備 高分子量基因組DNA的提??；DNA克隆片段的制備 （2）載體DNA片段的制備 酶切；一般用BamHI，產(chǎn)生與基因組DNA克隆片段相匹配的黏性末端。堿性磷酸酶處理； 載體DNA片段純化。有機(jī)溶劑抽提乙醇沉淀法、蔗糖密度梯度離心法。（3）基因組DNA片段與載體的連接(重組DNA分子的構(gòu)建) 連接效率主要受插入片段與載體的摩爾數(shù)比

26、以及DNA片段總濃度的影響。因此，應(yīng)通過(guò)連接預(yù)試驗(yàn)確定連接反應(yīng)中載體臂和插入片段的用量。（4）重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 對(duì)于噬菌體載體、黏粒載體，重組DNA分子在體外包裝成噬菌體顆粒，以噬菌體感染的方式將重組的DNA分子導(dǎo)入到大腸桿菌中。效率高，達(dá)1.8108pfu/g DNA。對(duì)于YAC載體，采用電激法導(dǎo)入重組DNA分子。（5）轉(zhuǎn)化體的篩選培養(yǎng)及基因組文庫(kù)的獲得。（6）基因組文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存。2、cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建：cDNA文庫(kù)是指某生物、組織或細(xì)胞所有cDNA的的克隆群體。包括組織特異性cDNA文庫(kù)、區(qū)域特異性cDNA文庫(kù)。（1）用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的載體及載體片段制備；（2）

27、mRNA的提取及其完整性的確定；（3）cDNA克隆片段的制備；（4）cDNA克隆片段與載體片段的連接及檢測(cè)；（5）重組cDNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；（6）轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)及cDNA文庫(kù)生成；（7）cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存。值得注意的是：在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，如果用人工接頭法，在酶切之前要用甲基化酶保護(hù)cDNA中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)。一般情況下無(wú)需構(gòu)建原核細(xì)菌的cDNA文庫(kù)。 3、獲得目的基因的主要途徑：序列已知的基因篩選基因組文庫(kù)；篩選cDNA文庫(kù)；PCR擴(kuò)增目的基因；人工合成法；未知序列的基因差異克隆法；圖位克隆法；轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法；T-DNA標(biāo)簽法；基因組計(jì)劃。第七章 DNA 體外重組與重組分子導(dǎo)入

28、受體細(xì)胞1、連接子(linker)：人工合成的含有一種或幾種限制內(nèi)切酶位點(diǎn)的平頭末端雙鏈DNA片段，812bp長(zhǎng)。2、外源基因片段與載體的連接方式：（1）黏性末端連接法(黏性末端法)；（2）平頭末端連接法(平頭末端法)；（3）同聚物加尾連接法(同聚物加尾法、同聚物接尾法)；（4）人工接頭連接法(人工接頭法)。第八章 重組子(轉(zhuǎn)化子或克隆)的篩選與鑒定 1、重組子是指目的DNA片段與載體連接形成重組DNA分子。 轉(zhuǎn)化子(轉(zhuǎn)化體、克隆)是指導(dǎo)入外源DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的受體細(xì)胞或由此而來(lái)的組織、生物體。 第九章 外源基因的表達(dá)1、真核基因在大腸桿菌中正確表達(dá)的基本條件： 外源基因必須是其cD

29、NA；置于原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列控制之下；外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的閱讀框架；修飾密碼子為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子；聯(lián)同分子伴侶一起表達(dá)或以細(xì)菌融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。2、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的特點(diǎn)：真核細(xì)胞具有RNA剪接功能，可以直接使用從基因組中分離克隆的基因；真核細(xì)胞的翻譯起始不同于原核生物，不需要在表達(dá)載體的克隆位點(diǎn)上游設(shè)置SD序列；真核細(xì)胞具有翻譯后修飾加工，表達(dá)的外源蛋白具有生物活性；外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的效率較低，其在染色體DNA上的整合是隨機(jī)的和自發(fā)的，目前還無(wú)法控制整合的位置和適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；真核細(xì)胞的培養(yǎng)要求較高，大量生產(chǎn)比較困難，成本也高。 第十章 植

30、物基因工程1、T-DNA是指農(nóng)桿菌質(zhì)粒上一段能轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的DNA片段。 2、邊界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右邊界序列是完全保守的，對(duì)T-DNA轉(zhuǎn)移是必須的。3、T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的機(jī)理(農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的機(jī)理) 植物創(chuàng)傷反應(yīng)與農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的識(shí)別和附著；信號(hào)分子的釋放積累與VirA蛋白的感應(yīng)； VirG蛋白激活與vir基因的誘導(dǎo)表達(dá)； T-鏈復(fù)合體的形成；T-鏈復(fù)合體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；T-DNA整合到植物染色體上。 4、T-鏈?zhǔn)侵竩ir基因被誘導(dǎo)表達(dá)后加工T-DNA而產(chǎn)生的單鏈T-DNA。 T-鏈復(fù)合體是指結(jié)合了VirD2、VirE2蛋白的T-鏈。 5、三親交配法中的三親指含有中間載體質(zhì)粒的大腸桿菌、含有遷移質(zhì)粒的大腸桿菌、含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 6、植物轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，主要有共整合載體系統(tǒng)（由卸甲Ti質(zhì)粒載體、中間表達(dá)載體組成）、雙元載體系統(tǒng)（由微型質(zhì)粒、輔助 Ti質(zhì)粒組成）、隔端載體系統(tǒng)（由卸甲Ti質(zhì)粒載體和中間表達(dá)載體通過(guò)同源重組共整合成轉(zhuǎn)化載體，但與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的T-DNA左右邊界序列分別位于兩個(gè)載體上）。7、植物基因轉(zhuǎn)移的方法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法一般程序：制備工程農(nóng)桿菌侵染液 農(nóng)