基因工程原理復習資料

1、0、基因工程的技術基礎和理論基礎1）理論基礎：40年代確定遺傳信息攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，明確了物質基礎50年代確定DNA的雙螺旋模型和半保留復制機理，明確自我復制和傳遞60年代提出中心法則和操縱子學說，破譯遺傳密碼，闡明信息流向和表達。2）技術基礎：60年代的瓊脂糖凝膠和Southern轉移雜交技術，用于DNA分離和檢測60年代初70年代末，發(fā)現(xiàn)限制性內切酶和DNA連接酶，實現(xiàn)體外切割70年代中期，實現(xiàn)DNA分子的核苷酸序列分析技術80年代實現(xiàn)體外重組DNA并進入宿主細胞1、基因工程研究的主要內容或步驟 從生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目

2、的基因的DNA片段； 在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制載體分子上，形成重組DNA分子； 將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞（寄主細胞），并與之一起增殖； 從大量細胞繁殖群體中，篩選出獲得了細胞重組DNA分子的受體細胞克??； 從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用； 將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產生出人類所需要物質。2、三位一體的基因概念 基因既是攜帶生物體遺傳信息的結構單位，又是控制一個特定性狀的功能單位。 基因是染色體上的實體 基因象鏈珠(bead)一樣，孤立地呈線狀地排列在染

3、色體上基因是功能、突變、交換“三位一體”的最小的、不可分割的、基本的遺傳單位。3、一位一體的基因概念基因是一個具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遺傳單位?；騼瓤梢暂^低頻率發(fā)生基因內的重組和交換。4、順反子假說1個順反子決定1條多肽鏈。能產生1條多肽鏈的是1個順反子，Cistron是基因的同義詞。在一個順反子內，有若干個突變單位：突變子(muton)。在一個順反子內，有若干個交換單位：交換子（recon）。5、全同等位基因在同一基因座位(locus)中，同一突變位點（site）向不同方向發(fā)生突變所形成的等位基因(homoallele)。6、非全同等位基因在同一基因座位（locus）中，不

4、同突變位點（site）發(fā)生突變所形成的等位基因(heteroallele)。7、重疊基因的概念及其生物學意義概念：大多數(shù)由一條DNA序列組成的基因，僅有編碼一種蛋白質的功能(盡管基因在兩端有非編碼區(qū)，并且在編碼區(qū)內有內含子)。但是，有些情況下，一條序列編碼不止一種蛋白質。生物學意義：a)原核生物進化的經(jīng)濟原則(較小的C值編碼較多的基因信息)；b)提高蛋白質的疏水性,以增強生物體自然選擇的適應性。8、重復基因的概念及其生物學意義概念：在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復基因往往是生命活動中最基本、最重要的功能相關的基因。生物學意義：a)含有遺傳調控信息:一些基因呈高度重復排列，如核糖體基因。這些

5、基因的重復排列方式可以快速、大量地表達出蛋白產物，從而滿足機體的需要；調控基因復制、轉錄、翻譯。核酸堿基的錯配更正，損傷修復，也受重復序列的影響。重復序列還可以形成核酸的高級構象，進而進行各種表觀遺傳修飾。b)促使核酸包裝成各種高級結構:重復序列能夠特異性地結合一些蛋白質，從而使核酸序列形成二級、三級甚至更高級結構。c)通過染色體的異染色質化而關閉基因的表達d)維持重要基因的正常結構，保證生命活動的正常進行：大量的重復序列保持重要的編碼基因相對穩(wěn)定，這才能維持正常的生命活動；e)為遺傳變異和新基因的生成提供了空間，產生進化的動力：新變異或者新基因經(jīng)常出現(xiàn)在容易發(fā)生突變與重組的重復區(qū)域，既不會破

6、壞原來的遺傳信息，又可以提供突變進行的場所，產生新性狀。9、斷裂基因的概念及其生物學意義概念：真核生物的結構基因是由若干exon和intron相間隔排列的序列組成的間隔基因（斷裂基因）。a)Intron并非“含而不露”；b)Exon并非“表里如一”；c)并非真核生物所有的結構基因均為splittinggene。生物學意義：a) 有利于遺傳的相對穩(wěn)定:即使錯誤剪接留下的intron部分,被mRNA監(jiān)測系統(tǒng)降解,避免病變和死亡；b) 增加變異機率，有利于生物的進化：內含子增加了基因的長度，增加了基因內的重組交換幾率，有利于形成變異和生物多樣性；c) 擴大生物體的遺傳信息儲量：對Exon和intro

7、n不同方式的剪接（選擇性剪接），形成不同的基因產物；d) 通過改變讀碼框架，利用intron編碼基因。10、跳躍基因的概念及其生物學意義概念：跳躍基因也叫做轉座子，是一些能夠從一個染色體位置轉移到另外的位置的DNA序列。跳躍基因在生物體中廣泛存在。生物學意義：轉座子對基因而言是一個不穩(wěn)定因素，他可導致宿主序列刪除、倒位或易位，并且在基因組中成為可移動的同源區(qū)。產生新的變異，有利于進化。目前轉座子元件是植物分子生物學操作和植物基因工程中分離克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大類反轉錄轉座子具有分布廣、異源轉座高和受組織培養(yǎng)誘導激活等優(yōu)勢，因此它的發(fā)現(xiàn)和利用又為轉座子標簽的應用提供了

8、更廣闊的前景。此外通過對現(xiàn)有轉座元件的改造以及轉座元件作為載體改造的工具，也將大大加速植物基因和功能序列的分離與研究，如利用轉座子元件構建啟動子捕捉載體，效率比T-DNA標簽高11、假基因在演化過程中，很多基因經(jīng)過了復制，其中的一個版本積累了使其失去功能的突變。 與正?；蚪Y構相似但喪失正常功能的DNA序列； 假基因都是在真核生物的基因組中發(fā)現(xiàn)的，在原核生物中未見報道; 假基因由活化的原始基因突變而來，這是因為存在著在某個階段傷及基因表達的一種或多種缺陷（如啟動子錯誤、有缺陷的剪接信號、框架中有終止信號等）之故; 大多數(shù)基因家族都有一些成員是假基因。12、模糊基因RNA編輯造成了mRNA的密碼

9、子的大部分，使它們從無意義信使成為有意義的信使,它們原來的基因的A序列只不過是一串簡略的意義模糊的序列(abreviateorcrypticgene)，這一串簡略的意義模糊的序列稱為隱秘基因或模糊基因(cryptogene)。模糊基因在病毒、原生動物、哺乳動物與植物中廣泛存在。13、表觀遺傳修飾的方式DNA分子的特定堿基的結構修飾(如胞嘧啶的甲基化)；染色質構型重塑(chromatinremodeling)(如組蛋白的構型變化)：組成核小體的組蛋白可以被多種化學加合物所修飾，如磷酸化、乙?；图谆?，組蛋白的這類結構修飾可使染色質的構型發(fā)生改變，稱為染色質構型重塑。a)組蛋白不同氨基酸殘基的

10、乙?；话闩c活化的染色質構型常染色質和有表達活性的基因相關聯(lián)；b)組蛋白甲基化可以與基因抑制有關，也可以與基因的激活相關，這往往取決于被修飾的賴氨酸處于什么位置；基因組印記:生物體中約有1%的基因并不按照孟德爾規(guī)律遺傳，而是只表達來源于雙親中的某一單親的基因,這種現(xiàn)象稱為基因組印跡，那個被掩蓋了的基因叫做被印跡的基因。DNA甲基化是“imprint”的重要機制；PTGS(RNAi)。14、從基因概念的發(fā)展說明C值矛盾形成的原因一個物種的單倍體的染色體的數(shù)目稱為該物種的基因組。單倍體基因組總DNA的含量的稱為最大C值；編碼基因信息的總DNA含量稱為最小C值。C值悖論: 生物體進化程度高低與大C值

11、不成明顯正相關。一些植物和兩棲類動物，它們的DNA含量高達10101011bp，而人類DNA含量僅為109bp； 親緣關系相近的生物大C值相差較大； 一種生物內大C值與小C值相差極大。原因：真核生物基因組中存在大量的不編碼基因產物的DNA序列，一般而言，越是簡單的生物基因組不編碼蛋白質的DNA序列越少，它們的結構基因的數(shù)目越接近DNA含量所估計的基因數(shù)。15、限制修飾系統(tǒng)限制修飾系統(tǒng)（Restrictionmodificationsystem或R-M系統(tǒng)）是一種存在于細菌（可能還有其他原核生物），可保護個體免于外來DNA（如噬菌體）侵入的系統(tǒng)，主要由限制內切酶和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。16、限

12、制性內切酶的命名原則宿主：屬名第一字母、種名頭兩個字母；菌株或型號；序號：羅馬字。例如Hind限制性內切酶：Hin指來源于流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)，d表示來自菌株Rd，表示序號。以前在限制性內切酶和修飾酶前加R或M，且菌株號和序號小寫；現(xiàn)在限制性內切酶名稱中的R省略不寫；Escherichiacoli。17、限制與修飾系統(tǒng)的種類根據(jù)酶的亞單位組成,識別序列的種類,是否需要輔助因子，分三類(I,II,III)也有分四類，IIs類，即II亞類。18、限制性內切酶識別的序列的特點1）識別序列長度：一般4-8，最常見為6；當識別序列為4個和6個堿基時，在可識別序列完全

13、隨機的情況下，平均256和4096個堿基出現(xiàn)一個識別位點。2）識別序列的結構：多數(shù)為回文對稱：切割位點在DNA兩條鏈相對稱的位置；少數(shù)限制酶的識別序列非對稱；多識別序列(簡并序列):可識別多種序列；間斷對稱:有一些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意堿基。3）切割位置:大多數(shù)內部；一部分在兩端；還有一部分在兩側。19、限制性內切酶產生的末端類型1）匹配粘端(粘性末端）:識別位點為回文對稱結構的序列經(jīng)限制酶切割后，產生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），這樣形成的兩個末端相同，也是互補的；2）平端(Bluntend):在回文對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈；

14、3）非對稱突出端:來自非對稱識別序列，切割的DNA末端是不同的；簡并序列；間隔序列：間隔區(qū)域序列是任意的；4）同裂酶(isoschizomer):識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可能不同。同序同切，識別位點和切割位置相同；同序異切：識別位點相同，但切割位點不同；“同功多位”：識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。5）同尾酶:許多不同的限制酶切割DNA產生的末端是相同且對稱，既可以產生相同的粘性末端。同尾酶切割DNA產生的末端可以進行互補連接。20、位點偏愛產生的原因某些限制酶對同一介質中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。原因：(

15、1)Nar，Nae和Sac三種酶在切割DNA之前需要同時與兩個識別位點作用的一類酶；(2)BspMI、EcoRII、HpaII它們對要求作用的DNA序列上有兩個明顯不同的結合位點，其中一個是激活另一個的變構位點(allosteric)。由順式方式提供（cis）：它們相互靠近或可形成環(huán)（loop），或由反式作用提供：其變構位點由含識別序列的寡核苷酸提供；BspMI難以切割DNA：在pBR322和pUC18/19中有一個BspMI位點，100倍的過量切割時/一半DNA未切割。21、星星活性產生的原因在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。星星活性是限制內切

16、酶的一般性質，任何一種限制酶在極端非標準條件下都能切割非典型位點。限制酶的特異性變化方式與酶的種類和所應用的條件有關。最普遍的活性變化是1個堿基的變化；識別位點外層堿基的隨意性以及單鏈缺口引起星星活性的因素:高濃度甘油（5%）；酶過量（100U/g）；低離子強度（pH8.0)；有機溶劑（如DMSO，乙醇，乙二醇等）；用其它二價陽離子（Mn+，Cu+，Co+,Zn+）代替Mg+。抑制星星活性的條件（措施）減少酶的用量，避免過量酶切,減少甘油濃度；保證反應體系中無有機溶濟或乙醇；提高離子強度到100150mM(如果不會抑制的話)； 降低反應pH至pH7.0；使用Mg+作為二價陽離子。22、酶切反應

17、條件（緩沖液、雙酶切策略、反應溫度等）1）緩沖液：常規(guī)緩沖液：pH：通常7.0-7.9(at25)，用Tris-HCl或乙酸調節(jié)；Mg+：作為酶的活性中心，由10mMMgCl2或MgAc調節(jié)，一般為10mmol/L；DTT(二硫蘇糖醇)1mM：有抗氧化作用（強于巰基乙醇），保護酶分子上的還原性基團，穩(wěn)定酶的活性；BSA（bovineserumalbumin）（100mg/ml）：少數(shù)需要（BSA是酶的穩(wěn)定劑，防止酶分解和非特異性吸附；BSA能減輕有些酶的變性，能減輕有些環(huán)境因素如加熱,表面張力及化學因素引起的變性；BSA能防止酶吸附到管壁而損失）。離子強度：不同酶對離子強度的要求差異大，一般用

18、NaCl來調節(jié)。通用緩沖體系:one-Phor-Allbufferplus,OPA+(通用緩沖液):可以適用所有的限制酶，緩沖液包括100mmol/LTris-HCl,500mmol/L乙酸鎂和100mmol/L乙酸鉀；不同酶使用的最佳濃度不同；常用濃度有0.5X，1X，1.5X，2X等。雙酶切策略:a）選用都合適的Buffer或通用緩沖液；b)若找不到共用的緩沖液，可先用低濃度的，再加適量NaCl和第二種酶；c)或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液。2)反應溫度:大多數(shù)為37，一部分為50-65，少數(shù)25-30；高溫作用酶在37時活性會下降，一般為最適條件的10-50%；一般銷售產品說明中都會表明

19、最佳溫度。3）反應時間:1hrormore，許多酶延長其反應時間可減少酶的用量。4）反應終止:EDTA（通過螯合鎂離子），終10mM；加熱:37酶65或80處理；80處理20min仍失活的酶，可以用苯酚去除蛋白。23、酶切位點的引入方法1）產生的5突出端補平后連接:將產生的5突出端補平后，再連接可產生新的酶切位點。2）同尾末端的連接:不同的同尾酶切割DNA產生的末端在相互連接時，可以產生新的酶切位點，同時原先的酶切位點消失。3）平端連接。24、甲基化酶概念和類型原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。在E.coli中，大多數(shù)都有三個位點特異性的D

20、NA甲基化酶。在真核和原核生物中存在大量甲基化酶。1）Dam甲基化酶：GATC腺嘌呤N6位置引入甲基；有些限制酶對Dam甲基化敏感，不能切割相應的序列，如BclI,ClaI,MboI,XbaI等；不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等。一般哺乳動物DNA不會在A-N6上甲基化；當需要在敏感位點上完全切割DNA時，必須從dam-E.coli中提取DNA。2）Dcm甲基化酶：識別CCAGG或CCTGG序列，在第二個C上C5位置上引入甲基。3）EcoKI甲基化酶：識別AAC(N)6GTGC；TTG(N)6CACG序列中AN6位置；但識別位點少(1/8kb)研究較少。4）SssI甲

21、基化酶：來自原核生物Spiroplasma，CG序列中的C在C5位置上甲基化，可在未甲基化或半甲基化鏈上起作用。許多酶對此甲基化敏感。25、甲基化對限制酶切的影響1）修飾酶切位點：HincII：GTCGAC，GTCAAC，GTTGAC，GTTAAC；BamHIGGATCC；M.MspI：m5CCGG；如果BamHI前面為CC或后面為GG，那么M.MspI處理的DNA抵抗BamHI的切割。構建DNA文庫時用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因組DNA；用M.EcoRI甲基化酶處理，然后加上合成的EcoRI接頭，當再用EcoRI來切割時只有接頭上的位點可被切割。2）產生新酶切

22、位點；3）用于研究細胞DNA中位點特異性甲基化的水平及分布；4）對基因組作圖的影響:在哺乳動物DNA中：CpG序列出現(xiàn)的頻率大約只有預計的1/5；含CpG序列的識別序列極其稀少；大多數(shù)CpG都發(fā)生甲基化；含CpG的所有識別序列的酶不能切割。26、常見DNA聚合酶類型及特點真核細胞有4種DNApoly：位于細胞核內，催化細胞增生；：小分子蛋白質（4.4kDa）曾從小牛胸腺中提取，與細胞增生無關；：100kDa，利用RNA為模板的效率比利用DNA為模板的效率高；其它：線粒體DNA聚合酶、催化線粒體DNA合成。原核細胞三種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關I單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長I

23、I與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關III在細胞中存在的數(shù)目不多，是促進DNA鏈延長的主要酶1）大腸桿菌DNA聚合酶I(EcoliDNApolymeraseI)：活性：單鏈多肽(109kDa)，有三種活性。a)53DNA聚合酶活性。底物:模板(ssDNA),引物（帶3OH基）或5突出DsDNA；b)53外切核酸酶活性。底物:dsDNAorDNA:RNA雜交體；從5端降解dsDNA，也降解RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性)；c)35外切酶活性(proofreading):底物：3-OHdsDNAorssDNA;從3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封閉。用途：a)切口平移法標記DNA：（

24、所有DNApoly中只有此有此活性）產生切口，外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移；若有放射性dNTP,則可標記成探針。b)用于cDNA克隆中的第二鏈，即單純的DNA聚合活性，但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反轉錄酶。c)末端標記（交換或置換反應）：T4DNApoly、T7DNApoly更好。2）Klenow酶：Klenowfragment：將大腸桿菌DNApolyI在蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解,從全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影響。活性，共兩種,同DNApolyI。作用：a)補平3凹端，注意要用dNTP，如果使用帶標記的dNT

25、P，可對末端進行標記；b)抹平3凸端，注意必須加足量dNTP；T4和T7具更強3-5外切活性，被取代c)末端標記：A置換反應同前,同樣被T4poly代替；B補平3-凹端的過程進行標記。d)cDNA克隆中合成第二鏈e)隨機引物標記f)DNA測序（Sanger雙脫氧鏈末端終止法）被T7取代，Taq等PCR酶。g)PCR反應被Taq等取代h)在體外誘變中，用于從單鏈模板合成dsDNA3)T4噬菌體DNA聚合酶:活性與Klenow酶相似，但35外切活性強200倍；用途：a)補平或標記3凹端，必須有高濃度dNTP（末端標記）b)置換反應:必須有高濃度dNTP(一種)末端標記c)標記DNA片段：即利用外切

26、活性產生了3凹端，再補平（用標記的dNTP）4)T7噬菌體DNA聚合酶:來源于T7phage感染的E.coli，為兩種緊密結合的蛋白質復合體(基因5蛋白和宿主的硫氧還蛋白)活性：T7DNApoly為持續(xù)合成能力最強的一個，平均長度要大得多,在測序時具有優(yōu)勢；活性/功能與T4DNApoly、Klenow類似，但35外切活性是Klenow的1000倍用途:a)替代T4的功能b)長模板的引物延伸c)修飾的T7DNApolymerase用于測序反應（測序酶）SequenaseUSBBiochemical.99%35外切活性被除去.5)耐熱DNA聚合酶6)反轉錄酶Reversetranscriptase

27、:依賴于RNA的DNA聚合酶,具有53合成DNA活性；無35外切酶活性。種類a)來自AMV（禽成髓細胞瘤病毒）。二鏈多肽(62kDa/94kDa)；具53DNA聚合活性；具很強的RNA酶H活性(降解與DNA雜交的RNA)；在反應開始時，引物和mRNA模板雜交體可成為RNaseH的底物,此時模板的降解和cDNA的合成相競爭；終止時，RNaseH可在正在增長的DNA鏈近3端切割模板，趨向于抑制cDNA的產量并限制其長度；b)Mo-MLV(M-MuLV)：Moloney鼠白血病病毒。單肽84kDaRNaseH活性弱，利于合成較長cDNA；純度高、工程產品，42失活。用途a)cDNA克隆中第一鏈的合成

28、b)測轉錄起始點（引物延伸法）c)5突出DNA的補平d)測序反應(當用DNApolyI,Klenow或測序酶不理想時)e)其它RT-PCRRNA二級結構活性a)53DNA聚合活性（Mg+）:RNAorDNA模板及帶3OH的RNA或DNA引物b)RNaseH活性注意事項a)無35外切校正作用，在高dNTP和Mn2+時，每500個bases會有一個誤摻入。b)為防止新合成的DNA提前終止，需高濃度dNTP。c)單鏈拷貝，也可雙鏈合成（自身序列為引物，但效率低）,50mg/ml放線菌毒D，抑制第二鏈合成。7)末端轉移酶:來源于小牛胸腺,存在于前淋巴細胞及分化早期的類淋巴樣細胞內的一種不尋常的DNAp

29、oly,是不依賴模板的DNA聚合酶;在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加于DNA分子的3羥基端。底物DNA,可短至3個核苷酸,對3突出的末端底物效率最高；低離子強度時,平端或3凹出端DNA亦可，但效率低；用途a)在3端加同聚尾，cDNA或載體，用于克隆，或標記b)末端標記ddNTP(標記的)27、Weiss單位和NEB單位Weiss單位：在37下20min催化1nmol32p從焦磷酸根置換到,-32PATP所需的酶量。NEB單位(NewEnglandBiolabs):通過粘性末端的連接效率來表示。即，在20l反應體系中于16，使Hind切過的DNA（300g/ml，0.12M5末端）在

30、30分鐘內連接50%所需的酶量為1個NEB單位。1Weiss=67粘端連接單位(NEB單位)。1NEB單位=0.015Weiss單位。28、載體由在細胞中能夠自主復制的DNA分子構成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的DNA片段連接在它的上面，而進行復制。29、作為基因克隆載體的條件1）容量：分子較小，可攜帶比較大的DNA片段；2）（復制：能獨立于染色體而進行自主高效的復制；3）酶切位點：有盡可能多的多種限制酶切位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點multiplecloningsites，MCS）；4）標記：有適合的標記，易于選擇；5）安全性：要求載體不能隨便轉移，僅限于在某些

31、實驗室內特殊菌種內才可復制等等。6）表達：有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，并且盡可能是高效的表達；30、質粒載體必須具備的基本條件并列舉2-3種質粒載體特點質粒載體必須具備的基本條件1）具有復制起點：自我增殖的基本條件，一般具一個復制子。2）具有抗菌素抗性：理想的質粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。3）具有若干限制酶切單一位點多克隆位點（multiplecloningsite，MCS）；4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。低分子量的質粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的轉化給受體細胞，同時低分子量的質粒對限制酶具有多重識別位點的幾率也較低。pSC101質粒載體:嚴謹型復制控制的低拷貝

32、數(shù)大腸桿菌質粒載體，每個寄主細胞有12個拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr）；有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7種核酸內切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma3個位點克隆外源DNA，都會導致tetr基因失活；是第一個真核生物的克隆載體。pBR322質粒載體：具有較小的分子量：4363bp，克隆載體的分子量大小不要超過10kb；具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號；有24種核酸內切酶的單一酶切識別位點。其中7種內切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導致tet

33、r基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點。31、pUC質粒載體的特點和優(yōu)點應用多克隆位點技術，在pBR322的基礎上，加入了一個在其5-端帶有一段多克隆位點的lacZ基因。1）典型pUC系列質粒載體特征：來自pBR322質粒的復制起點；氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的識別位點。大腸桿菌-半乳糖基因（lacZ）的啟動子及編碼-肽鏈的DNA序列；位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段。2）pUC質粒載體的優(yōu)點：具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù)：僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復制

34、起點；復制起點內部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個細胞500700個拷貝。適用于組織化學檢測重組體：具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與互補作用，用Xgal顯色對重組子進行鑒定。具有多克隆位點MCS區(qū)段：方便具有不同粘性末端的外源片段的插入。32、穿梭質粒載體的概念人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質粒載體。早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質粒載體；大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體；大腸桿菌-牛乳頭瘤病毒。33、噬菌體載體的主要類型和特點1）插入式載體:只具有一個可供

35、外源DNA插入的克隆位點的派生載體；通過特定的酶切位點允許外源DNA片段插入的載體稱為插入型載體。由于噬菌體對所包裝的DNA有大小的限制，因此一般插入型載體設計為可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。cI基因插入失活：如gt10，基因cI內有一個EcoR位點。其他EcoR位點都去除掉了，基因cI內的EcoR位點作為唯一位點，可用于外源DNA片段的插入。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶源化，產生清晰噬菌斑。LacZ基因插入失活：如lgt11載體該載體最大特點是在最左側可替代區(qū)置換了一段lacZ基因，可編碼b-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上形成蘭色

36、噬菌斑。lacZ基因編碼區(qū)終止密碼子之前有一個EcoRI位點，可用于外源DNA片段的插入。篩選時，在lac-宿主菌中非重組噬菌斑為蘭色。當外源DNA片段與lacZ的閱讀框相吻合時，可表達出融合蛋白，可用免疫學方法篩選陽性重組子。2）替換型載體（取代型載體）：具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。通過特定酶切位點允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體，稱為置換型載體。如：EMBL3和EMBL4EMBL3和EMBL4載體為43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為20kb、9kb和14kb?？寺NA片段大小為9-23kb，在填充片段兩端帶有對稱

37、的多克隆位點，這兩個載體的差別是多克隆位點的排列位置相反。3）凱倫噬菌體載體：既有插入型，又有替換型，在基因工程實驗中的用途十分廣泛;承受外源DNA的能力：幾個kb到23kb。34、單鏈DNA噬菌體載體類型和特點單鏈DNA噬菌體的復制，以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介，這種復制形式的DNA（replicativeformDNA）簡稱RFDNA；不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的大小制約的，不存在包裝限制問題；容易測定外源DNA片段的插入取向；M13：一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，基因組大小為6.4kb；成熟噬菌體顆粒僅

38、能感染E.coli的F+細胞，其感染位點在性纖毛上；噬菌體顆粒大小受其DNA大小制約，這一點正好與噬菌體相反。所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。M13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質復制蛋白（基因，和）；形態(tài)發(fā)生蛋白（基因，和）；結構蛋白（基因、和），所有結構蛋白在形態(tài)發(fā)生之前都插入在宿主細胞的質膜中；基因組DNA為正鏈，按基因至基因方向合成，與噬菌體的mRNA序列同義。單鏈DNA的酶切和連接比較困難，因此M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA。RFDNA容易從感染細胞中純化出來，可象質粒一樣進行操作，并可通過轉化方法再次導入細胞。35、常用噬菌粒載體pUC118和pUC119

39、的特點常用噬菌粒載體pUC118和pUC1191）具有較小分子量的共價、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，易于進行分離與操作；2）ampr基因作為選擇記號，只有攜帶pUC118或pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉化子才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長；3）拷貝數(shù)含量高，每個寄主可高達500個，只要用少量的大腸桿菌細胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA；4）存在著一個多克隆位點區(qū)，不同類型的外源DNA片段不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；5）由于多克隆位點區(qū)阻斷了大腸桿菌lacZ基因的5-端編碼區(qū)，可按照IPTG組織化學顯色反應試驗，篩選重組子；6）含有質粒復制起點，在無

40、輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質粒一樣按常規(guī)方式，復制形成大量的雙鏈DNA分子；7）帶有M13噬菌體的復制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細胞中，可合成單鏈DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆粒分泌到培養(yǎng)基中；8）pUC118和pUC119：多克隆位點區(qū)的核苷酸序列取向彼此相反，于是它們當中的一個可轉錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉錄出負鏈DNA。36、柯斯質粒載體特點以及粘粒載體的工作原理cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。用于克隆大片段DNA的載體，由噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及噬菌體用于包

41、裝的cos末端等。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內?？滤官|粒載體的特點：具有噬菌體的特性；具有質粒載體的特性；具有較高容量的克隆能力；具有與同源性序列質粒進行重組的能力。粘粒載體的工作原理類似噬菌體載體，在外源片段與載體連接時，粘粒載體相當于噬菌體載體的左右臂，cos位點通過粘端退火后與外源片段相間連接成多聯(lián)體。多聯(lián)體與噬菌體包裝蛋白混合，噬菌體A基因蛋白的末端酶切割兩個cos位點，并將兩個同方向cos位點之間的片段包裝到噬菌體顆粒中去。噬菌體顆粒感染大腸桿菌時，

42、線狀重組DNA就象l 噬菌體DNA一樣被注入細胞并通過cos位點環(huán)化，這樣形成的環(huán)化分子含有完整的粘粒載體，可象質粒一樣復制并使其宿主獲得抗藥性。帶有重組粘粒的細菌可用含適當抗生素的培養(yǎng)基挑選。37、大腸桿菌表達載體組成和特點表達載體組成：大腸桿菌表達載體都是質粒載體。作為表達載體首先必須滿足克隆載體的基本要求，即能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中。在基本骨架的基礎上增加表達元件，就構成了表達載體。各種表達載體的不同之處在于其表達元件的差異。組成部分1）啟動子強啟動子、抑制型、誘導型與組成型強啟動子：目的基因在啟動子指導下轉錄出大量mRNA，使克隆基因的蛋白質產物的表達量占細胞總蛋白的10%-3

43、0%以上；抑制型啟動子：啟動子呈現(xiàn)出一種低的基礎轉錄水平，在表達毒性蛋白質或是有損于寄主細胞生長的蛋白質的情況下，使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件；誘導型啟動子：能通過簡單的方式使用廉價的誘導物而得以誘導，如IPTG；PL、PR、lac、trp、tac；T7噬菌體啟動子則屬于組成型啟動子2）轉錄終止子外源基因在強啟動子控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉錄質粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物；終止信號存在于聚合酶已轉錄過的序列之中，這種提供終止信號的結構就稱為終止子。終止子分為兩類：一類不依賴于蛋白質輔因子就能實現(xiàn)終止作用；另一類則依賴

44、蛋白輔因子（因子）才能實現(xiàn)終止作用。兩類終止子有共同的序列特征：在轉錄終止點前有一段回文序列。轉錄終止子能增強mRNA分子穩(wěn)定性，從而提高蛋白質產物的水平。啟動子封堵作用：由一個上游啟動子驅動的轉錄作用，當其通讀過下游啟動子時，便會使該啟動子的功能受到抑制，將這種由一個啟動子的功能活性抑制另一個啟動子轉錄的現(xiàn)象，叫做啟動子封堵作用。3）轉錄起始序列5-末端結構特征，決定mRNA的轉譯起始效率。在核糖體結合位點（RBS）的序列結構中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)堿基發(fā)生定點突變；或使用轉譯偶聯(lián)系統(tǒng)進行克隆基因表達；4）轉錄增強子:顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達效率。5）

45、轉譯終止子mRNA轉譯終止必須存在終止密碼子。大腸桿菌偏愛終止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉譯終止的效率將進一步的增強。38、T7噬菌體啟動子的表達載體作用機制T7噬菌體啟動子PET系列表達載體是目前使用最廣泛的表達載體；表達能力強；可控性好。其組成是在載體的基本結構的基礎上加入T7噬菌體啟動子序列及其下游的幾個酶切位點；當外源基因插入到這些酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。作用機制：T7啟動子只能有T7噬菌體RNA聚合酶識別并啟動轉錄，大腸桿菌RNA聚合酶不能作用T7啟動子；宿主細胞必須能表達T7RNA聚合酶；大腸桿菌BL21（DE3）：大腸桿菌染色

46、體BL21區(qū)整合有噬菌體DNA，在DE3區(qū)有T7RNA聚合酶基因，該基因受到lacUV5啟動子控制；當PET載體進入BL21（DE3），宿主細胞的lacI基因產生阻遏物，抑制T7RNA聚合酶基因的表達，載體上的目標基因無法表達；IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，乳糖類似物）誘導后，和lacI產物結合，使其構象改變離開lacO，從而激活轉錄阻遏物失去作用，T7RNA聚合酶基因表達，產生T7RNA聚合酶，啟動T7啟動子控制的外源基因的表達。39、外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位以及特點40、PCR擴增的技術原理以及PCR反應程序原理:PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法；優(yōu)點：模板

47、量少、無需純化、快速特異、自動化。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈；成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；DNA模板-引物結合物在72、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。PCR反應體

48、系:緩沖液、dNTP、引物、模板、DNA聚合酶。PCR反應程序1)常規(guī)程序將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)2535次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72保持3-7min，使產物延伸完整，4保存。2)復性（退火）和延伸溫度復性溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60之

49、間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設定為72；如果復性溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。3)反應時間變性步驟一般使用30秒鐘；如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長，復性時間有30秒種一般是足夠的；延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。4）循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關，在模板拷貝數(shù)為104105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為2535次；平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象；原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和

50、DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產物抑制作用，非特異性產物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不徹底。5）PCR反應液的配制PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)；對使用具3-5外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產物；遇到這個問題時，若將反應成分分開配制，A管含模板、引物和dNTP及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題；按照常規(guī)方法配制

51、反應體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。41、長片段的PCR擴增方法常規(guī)PCR反應產物一般在2kb以下。在PCR反應中，隨著擴增片段的延長，擴增效率隨之降低。在長片段的PCR擴增過程中存在如下問題：高溫會降低緩沖液緩沖能力，從而損害模板DNA和PCR產物；高溫下其它二價離子的存在會促進D

52、NA的裂解；長片段DNA分子的變性比短片段困難；DNA聚合酶與模板DNA的趨近和結合變得困難；錯配堿基的摻入導致DNA聚合酶的作用不能正常發(fā)揮，從而限制產物的長度。提高擴增產物的長度采取措施：改進緩沖體系，適當升高鎂離子濃度（10X長片段PCR緩沖溶液組成為：500mmol/LTris-Cl(pH=9.0),160mmol/L硫酸銨，25mmol/LMgCl2,1.5mmol/LBSA）；采用混合DNA聚合酶，即主體使用擴增效率高、延伸能力強的TaqDNA聚合酶，少量使用具有3-5外切活性的高溫DNA聚合酶（如Pfu或PwoDNA聚合酶），及時切除不匹配堿基的摻入，這樣可使擴增長片段DNA有效

53、實施；當需要擴增的片段大于20kb時，需加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)來提高PCR的效率，但甜茶堿加入后，要將擴增反應的溫度降低2-3度；Roche公司的長片段PCR擴增試劑盒將TaqDNA聚合酶和PwoDNA聚合酶接合起來，可擴增長達40kb的DNA片段。42、PCR擴增未知DNA片段方法1）反向PCR：當獲得一段DNA后，若要得到與其相鄰的未知DNA片段，可通過反向PCR來實現(xiàn)；反向PCR主要解決側翼未知序列沒有引物可用的問題；首先用已知片段內部沒有的限制性內切酶切割模板DNA，再將酶切后的DNA片段連接成環(huán)狀分子，其中至少有一個環(huán)狀分子含有完整的已知片段。根據(jù)已知

54、片段兩端的序列設計引物，可將鄰近的DNA片段擴增出來。反向PCR技術主要用于克隆已知DNA片段周邊的未知DNA片段以及從總RNA中克隆未知cDNA序列，研究病毒序列、轉基因和轉座子等的整合位點區(qū)域的序列。2）利用接頭的PCR將基因組DNA用限制性酶切酶進行酶切，然后將序列已知的接頭片段連接到酶切片段的兩側，以提供PCR需要的另一端引物；根據(jù)已知序列設計的引物和根據(jù)接頭序列設計的引物，可以將已知序列側翼的未知序列擴增出來。3）TAIL-PCR（thermalasymmetricinterlacedPCR）:交錯式熱不對稱PCR，是一種染色體步移技術（GenomeWalking）；TAIL-PCR

55、通過3個嵌套的特異性引物分別和簡并引物組合進行連續(xù)的PCR循環(huán)，利用不同的退火溫度選擇性地擴增目標片段；在利用特異引物和隨機引物進行PCR中一般有3種產物生成：由特異性引物和簡并引物擴增出的產物；由同一特異性引物擴增出的產物；由同一簡并引物擴增出的產物。43、Southern雜交的基本流程和原理根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。步驟：(1)酶切DNA,凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。(2)將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。(3)預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。(4)讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結合的探針。(5)通過顯影檢查目的DNA所在的位置。44、化學測序法和雙脫氧法測序原理1）化學測序法：G系統(tǒng)：pH