腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(簡(jiǎn))

1、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤（tumor），是機(jī)體在各種致病因素的作用下，局部組織的細(xì)胞異常增生而形成的新生物（neoplasm），常表現(xiàn)為局部腫塊。（白血病非局部腫塊）（白血病非局部腫塊）細(xì)胞毒類藥物 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑 分化誘導(dǎo)劑 化學(xué)預(yù)防藥 逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物 抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物 放療及化療增敏劑 抗腫瘤藥物 細(xì)胞毒類藥物： 體外實(shí)驗(yàn)方法； 動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法； 抗癌藥作用機(jī)理研究方法 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：體內(nèi)抗癌試驗(yàn)的方法；免疫功能的研究方法 分化誘導(dǎo)劑： 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)研究方法；細(xì)胞功能的研 究方法；與分化有關(guān)的基因及其表達(dá)的研究方法化學(xué)預(yù)防藥：體外誘

2、導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法；體內(nèi)誘癌試驗(yàn)； 化學(xué)預(yù)防劑作用機(jī)理的研究逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物：腫瘤細(xì)胞耐藥表型和機(jī)制； 腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立及鑒定； 尋找腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的方法抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物：腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與實(shí)驗(yàn)方法概述； 腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型； 腫瘤侵襲的體外模型及相關(guān)生物學(xué)特性研究 新血管生成的研究方法 放療及化療增敏劑：放療增敏劑的正名、定義及其研究特點(diǎn)； 離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)；整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù) 各類抗腫瘤藥物所涉及到的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞毒類藥物： 體外實(shí)驗(yàn)方法； 動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法； 抗癌藥作用機(jī)理研究方法 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：體內(nèi)抗癌試驗(yàn)的方法；免疫功能的研究方法免疫功能的研究方法。分

3、化誘導(dǎo)劑： 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)研究方法；細(xì)胞功能的研 究方法；與分化有關(guān)的基因及其表達(dá)的研究方法化學(xué)預(yù)防藥：體外誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法；體內(nèi)誘癌試驗(yàn)； 化學(xué)預(yù)防劑作用機(jī)理的研究(附：胃癌變動(dòng)物模型 )逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物：腫瘤細(xì)胞耐藥表型和機(jī)制； 腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立及鑒定； 尋找腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的方法抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物：腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與實(shí)驗(yàn)方法概述 腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 腫瘤侵襲的體外模型及相關(guān)生物學(xué)特性研究 心血管生成的研究方法 附：LALA795795自發(fā)肺癌實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型放療及化療增敏劑：放療增敏劑的正名、定義及其研究特點(diǎn) 離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)；整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù) 各類抗腫瘤藥物所

4、涉及到的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法 （動(dòng)物的，人的動(dòng)物的，人的）動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法 移植性、誘發(fā)性移植性、誘發(fā)性（也可在體外誘發(fā)也可在體外誘發(fā)）、自發(fā)性、自發(fā)性 腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍[瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤免疫藥理研究方法 （體外、體內(nèi)體外、體內(nèi)）腫瘤藥理學(xué)基本的實(shí)驗(yàn)方法腫瘤藥理學(xué)基本的實(shí)驗(yàn)方法一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件基本條件二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)與傳代三、腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)活性檢測(cè) 形態(tài)觀察 細(xì)胞排染試驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 抗癌作用測(cè)定 克隆形成試驗(yàn) 半數(shù)抑制濃度的計(jì)算腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法(

5、In Vitro) 無(wú)菌室 超凈工作臺(tái) 消毒器 CO2孵箱 倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶 營(yíng)養(yǎng)液，等等腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)所需要的腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)所需要的基基 本本 條條 件件 原代原代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 與與傳代傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)貼壁貼壁細(xì)胞傳代與細(xì)胞傳代與懸浮懸浮細(xì)胞傳代細(xì)胞傳代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 原原 代代 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（Primary CulturePrimary Culture）也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織、接種細(xì)胞培養(yǎng)到第一次傳代之前(一般可持續(xù)1-41-4周)。 此期細(xì)胞可見(jiàn)到細(xì)胞分裂，但不旺盛。 原代培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞

6、克隆形成率（Cloning Cloning EfficiencyEfficiency）很低。 克隆形成率克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。 初代培養(yǎng)細(xì)胞也可用于檢測(cè)藥物的生物活性。 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（Passage culture ）：將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比例轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。 為什么要進(jìn)行傳代？ 體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞密度過(guò)大，生存空間不足，可引起營(yíng)養(yǎng)枯竭從而停止生長(zhǎng)。因此，要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞用于研究，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 傳傳

7、 代代 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng) 細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種在培養(yǎng)器皿到分離再培養(yǎng)的一段期間。 細(xì)胞倍增時(shí)間：指此次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所需的時(shí)間。 “一代”與“倍增”的概念不同。在一代中，細(xì)胞可培增2-3次甚至5-6次。 腫瘤腫瘤 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng) 傳代代數(shù)與細(xì)胞倍增時(shí)間傳代代數(shù)與細(xì)胞倍增時(shí)間 細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過(guò)游離期、指數(shù)增生期指數(shù)增生期、坪臺(tái)期三個(gè)階段 游離期：細(xì)胞接種后從懸浮狀態(tài)到細(xì)胞貼瓶； 指數(shù)增生期指數(shù)增生期：細(xì)胞接種23天分裂增殖比較旺盛，是活力最好時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)；坪臺(tái)期（停止期）：細(xì)胞密度已飽和，細(xì)胞停止增殖，但代謝活動(dòng)仍在進(jìn)

8、行 。腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng) 指數(shù)增生期 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)可分為單層貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。 懸浮懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞懸浮懸浮于培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)或維持。 單層貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在培養(yǎng)器皿表面生長(zhǎng)的方法。將細(xì)胞消化后分散成單個(gè)細(xì)胞后種入器 皿，細(xì)胞置含37、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，一般經(jīng)過(guò)3-6 h，細(xì)胞沉于器皿底部，附著于玻璃或塑料層的培養(yǎng)面，分裂，向四周生長(zhǎng)，逐漸融合形成細(xì)胞單層。 正常二倍體細(xì)胞在兩個(gè)細(xì)胞集落生長(zhǎng)到相互接觸時(shí)，由于細(xì)胞信息的傳遞，生長(zhǎng)即停止，即生長(zhǎng)接觸抑制。 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞由于具有失去接觸抑制的特性，在生長(zhǎng)到細(xì)胞相互接觸時(shí)，還能繼續(xù)生長(zhǎng)，形成重疊層。細(xì)胞生長(zhǎng)到旺

9、盛期，即可進(jìn)行傳代。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞傳代 懸浮細(xì)胞的傳代 懸浮細(xì)胞是指細(xì)胞呈單個(gè)或細(xì)胞團(tuán)懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度時(shí)，進(jìn)入坪臺(tái)期，即需傳代。 傳代方法：取少量細(xì)胞懸液移入新培養(yǎng)器皿，加入新鮮培養(yǎng)液即可。 1.打開(kāi)瓶口，過(guò)火后，輕輕倒去培養(yǎng)液。2.用PBS或用Hanks液2ml洗12次，加入0.05%0.25%胰蛋白酶適量，消化13min。3.在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓球狀時(shí)（或肉眼觀察培養(yǎng)瓶細(xì)胞面出現(xiàn)布紋孔狀），表示細(xì)胞已從壁上消化下來(lái)，倒去胰蛋白酶，可用Hanks液輕輕洗12次。4.加入新鮮培養(yǎng)液后，用滴管輕輕吹打，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表

10、面脫落，混合成細(xì)胞懸液，以適量接種入新培養(yǎng)器皿中。腫瘤細(xì)胞傳代 貼壁細(xì)胞的傳代貼壁細(xì)胞的傳代 1.培養(yǎng)液中可加入適量青霉素、鏈霉素；2.用于調(diào)pH值的7%NaHCO3用0.1-0.22m 濾膜過(guò)濾滅菌，勿高壓滅菌。 3.洗去胰蛋白酶時(shí)應(yīng)該用D-Hanks液，而 不是Hanks液。4.傳代時(shí)細(xì)胞分散密度要適當(dāng)，不能太 低，因腫瘤細(xì)胞的自泌促生長(zhǎng)因子會(huì) 因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生 長(zhǎng)的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與傳代注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)分離純化外科腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的方法1.1.取材取材：材料主要來(lái)源于外科手術(shù)或活檢腫瘤組織。取材時(shí)避免用壞死組織，要挑選瘤細(xì)胞

11、集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)培養(yǎng)者，可凍存。 2.2.成纖維細(xì)胞排除成纖維細(xì)胞排除：在腫瘤組織中?；祀s有一些成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)能與瘤細(xì)胞同時(shí)生長(zhǎng)，并常壓過(guò)癌細(xì)胞，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，應(yīng)仔細(xì)排除。排除方法常有：機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。 成纖維細(xì)胞排除 機(jī)械刮除法機(jī)械刮除法是用不銹鋼鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用。刮除程序?yàn)椋?（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位； （2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把

12、無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間； （3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞； （4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止 根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。 （1）待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液； （2）取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)

13、液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)； （3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞520分鐘后，按處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。 當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深惣?xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。 成纖維細(xì)胞排除 反復(fù)貼壁法消化排除法： 根據(jù)成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落的特點(diǎn)。此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是： （1）先用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下觀察和

14、不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。 膠原酶消化法： 利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。 （1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； （2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。 如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。 其它方法： 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.0251

15、.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23中800g離心 10分種。在比重1.0251.050層為成纖維細(xì)胞，在比重1.0501.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。 選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)活性檢測(cè) 形態(tài)觀察 細(xì)胞排染試驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 MTT試驗(yàn) 克隆形成試驗(yàn) 半數(shù)抑制濃度的計(jì)算腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞的活性檢測(cè) 形態(tài)觀察 細(xì)胞排染試驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 MT

16、T試驗(yàn) 克隆形成試驗(yàn) 半數(shù)抑制濃度的計(jì)算腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè) 形態(tài)觀察n 主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞損傷或死亡后細(xì)胞膜完整性破壞。正常的活細(xì)胞拒染，而死亡的細(xì)胞則染成藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)方法 取100l細(xì)胞懸液加等量0.4臺(tái)盼藍(lán)染色液，攪動(dòng)細(xì)胞使之與染料混合均勻，滴入血球計(jì)數(shù)板，穩(wěn)定2min后進(jìn)行觀察，在l5min內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。未染色的是活細(xì)胞，死細(xì)胞呈藍(lán)色。分別計(jì)數(shù)染色細(xì)胞與不染色細(xì)胞，求得細(xì)胞存活率。腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè) 細(xì)胞排染試驗(yàn) 細(xì)胞排染試驗(yàn) 細(xì)胞數(shù)胞數(shù)未細(xì)胞數(shù)染色染色數(shù)未染色細(xì)胞存活

17、率100% 未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞存活率應(yīng)達(dá)95%以上。 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 觀察藥物的作用，可對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) (即末染色細(xì)胞數(shù))，再根據(jù)下列公式求得細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)組活細(xì)胞數(shù)對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)100% 細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染色液混勻后，應(yīng)在5min內(nèi)計(jì)數(shù)完畢，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于細(xì)胞活度下降而通透性增加，從而影響拒染細(xì)胞數(shù)，因而影響實(shí)驗(yàn)的真實(shí)結(jié)果。 細(xì)胞排染試驗(yàn)注意事項(xiàng) 在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈指數(shù)生長(zhǎng)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，可得一條直線，故稱此時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營(yíng)養(yǎng)物的消耗，細(xì)

18、胞生長(zhǎng)逐漸減慢以致停止，此時(shí)稱高坪期或穩(wěn)定期。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過(guò)生長(zhǎng)曲線反映出來(lái)。實(shí)驗(yàn)原理腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè) 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成細(xì)胞濃度為1104/ml的細(xì)胞懸液分裝在培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的被測(cè)樣品，對(duì)照組加入等體積的溶劑。細(xì)胞置含37、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)后ld、2d、3d、4d、5d、7d各取樣，置血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，以每毫升細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線（計(jì)數(shù)法） 。 注意：懸浮細(xì)胞同一培養(yǎng)物可連續(xù)取樣，而貼壁細(xì)胞每個(gè)培養(yǎng)瓶只能作一次計(jì)數(shù)，故要計(jì)算好需要的細(xì)胞瓶數(shù)。 實(shí)驗(yàn)方

19、法 腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè) 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷率 100% 000NNN也可用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線N0:對(duì)照組生長(zhǎng)曲線線性部分外推至y軸的截距，代表接種后對(duì)照組具有增殖力的細(xì)胞數(shù)；N0:實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線線性部分外推至y軸的截距，代表接種后實(shí)驗(yàn)組具有增殖力的細(xì)胞數(shù)。 MTT比色法： 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT（噻唑藍(lán),Thiazolyl blue）還原為藍(lán)紫色結(jié)晶，并沉淀在細(xì)胞里，而死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原 。DMSO能夠溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 (formazan)，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(OD值)，OD值的大小可間接反映

20、活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物的形成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。由吸光度值，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算抑制率。 MTT實(shí)驗(yàn)實(shí) 驗(yàn) 原 理 實(shí) 驗(yàn) 方 法1.將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消 化后，用含10小牛血清的培養(yǎng)基配成 濃度約為5000個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。2.接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200l。3.經(jīng)37、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)24h。4.實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液， 對(duì)照組則用等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3 個(gè)以上的平行孔，37、5%CO2，培養(yǎng)所 設(shè)定的時(shí)間。 MTT實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法 5.棄去上清液，用培養(yǎng)液洗3次，以去除藥液。 然后，每孔加入200l含0.2mg/ml MTT

21、的無(wú) 血清培養(yǎng)基，在37培養(yǎng)4h。 6.小心棄去上清，并加入200l 酸化異丙醇 （或DMSO）溶解MTT甲臜沉淀，用振蕩器混勻 后，在酶標(biāo)儀上用波長(zhǎng)為570 nm，參比波為 450 nm測(cè)定光密度 (OD)值。 MTT實(shí)驗(yàn)n按公式計(jì)算按公式計(jì)算IC50舉例：舉例：n各組藥物濃度：0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001（稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1）n抑制率分別為：0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。n將上述數(shù)據(jù)代入下列計(jì)算公式：nlgIClgIC5050=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)=Xm-I(P-(3-Pm-Pn

22、)/4)nXm:最大劑量的對(duì)數(shù)=lg0.1= =-1 1 nI:（最大劑量/相鄰劑量)的對(duì)數(shù)=lg0.1/0.01=lg10=1 nP:陽(yáng)性反應(yīng)率之和=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1nPm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率=0.95， nPn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率=0.06nlgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025nICIC5050=0.00025=0.00025 腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行抗癌藥物篩選檢測(cè)、研究癌變機(jī)理以及惡性腫瘤分子生物學(xué)研究的重要手段。主要優(yōu)點(diǎn) 如下： 1.1.不需要用動(dòng)物，能很方便、很經(jīng)濟(jì)的進(jìn)行很多種藥物的篩選； 2.2

23、.可比較準(zhǔn)確的控制藥物作用的時(shí)間、劑量和條件，并可準(zhǔn)確的選擇藥物作用的靶位； 3.3.將藥物直接加入到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中，使藥物直接與細(xì)胞接觸，可提示藥物的直接作用或體內(nèi)的間接作用。腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法主要優(yōu)點(diǎn)主要優(yōu)點(diǎn) 1.1.與體外實(shí)驗(yàn)相比，體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境極為復(fù)雜，因此體外的藥效作用在體內(nèi)并不一定都能相對(duì)應(yīng)； 2.2.對(duì)復(fù)方藥和中藥研究較為困難，尤其是藥物的顏色，可因?yàn)橛绊懕壬Y(jié)果而影響對(duì)藥物的評(píng)價(jià)； 3.3.水溶性的藥物較易研究，而非水溶性的藥物則較難。（可進(jìn)行血清藥理學(xué)研究） 因此，要將體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)的結(jié)合起來(lái) 才能較為全面而科學(xué)地評(píng)價(jià)藥效。腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法

24、腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法主要缺點(diǎn)主要缺點(diǎn) 初代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系（Cell LineCell Line）。 從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株（Cell strainCell strain）。 與的概念腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法 （動(dòng)物的，人的動(dòng)物的，人的）動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法 （移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性） 腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍[瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤藥理學(xué)基本的實(shí)驗(yàn)方法腫瘤藥理學(xué)基本的實(shí)驗(yàn)方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體

25、內(nèi)實(shí)驗(yàn) In vivo 腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(In Vitro) 腫瘤藥理學(xué)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法腫瘤藥理學(xué)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法 整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法是評(píng)價(jià)一個(gè)藥物是否有效的最主要的方法，即使在體外有一個(gè)很好的療 效，最終也一定要在體內(nèi)進(jìn)行觀察。因此，用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法來(lái)觀察藥物的作用顯得很重要。 研究藥物的體內(nèi)抗腫瘤作用，就必須建立各種腫瘤的動(dòng)物模型，模型越接近于人體其意義越大。 動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 動(dòng)動(dòng) 物物 的的 選選 擇擇移植性移植性動(dòng)物腫瘤模型動(dòng)物腫瘤模型誘發(fā)性誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型動(dòng)物腫瘤模型自發(fā)性自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型動(dòng)物腫瘤模型 不同種類的動(dòng)物對(duì)致癌物質(zhì)的敏感性

26、不同，其癌自發(fā)率也不同。常用于自發(fā)、誘發(fā)或移植的動(dòng)物有： 小鼠、裸 鼠、金黃地鼠、大鼠 豚鼠、兩棲類動(dòng)物如蛙、鳥類。 其它許多家畜如豬馬牛羊犬貓家兔等都可發(fā)生各種腫瘤。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)動(dòng) 物物 的的 選選 擇擇小 鼠 小鼠腫瘤自發(fā)率高，其自發(fā)性腫瘤無(wú)論是從組織發(fā)生、臨床過(guò)程以及組織形態(tài)學(xué)上都與人類的腫瘤接近。所以小鼠目前廣泛用于癌、肉瘤、白血病以及其它惡性腫瘤的研究。進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選，小鼠自發(fā)性腫瘤自發(fā)性腫瘤模型模型優(yōu)于移植性腫瘤模型模型。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇裸 鼠 裸鼠是一種獨(dú)特的純系動(dòng)物，全身無(wú)毛，先天性無(wú)胸腺，T淋巴細(xì)胞

27、缺乏，細(xì)胞免疫功能缺乏，對(duì)異體移植幾乎無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可接受異系、異種腫瘤腫瘤移植等，有“活試管 ”之稱。 自 從 1969 年Rygaard 、Povlesev 二氏將人類腫瘤異種移植于裸鼠首次獲得成功后，它在腫瘤研究中已被廣泛利用。 目前移植于裸鼠較為成功的人類腫瘤有：結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、白血病等。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇 裸小鼠的費(fèi)用昂貴，飼養(yǎng)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件要求高，小鼠不易大量繁殖。因而一般不用于藥物的初篩選研究。由于先天性免疫缺乏，因而在一般情況下也不用于免疫藥物的研究。 裸鼠的缺點(diǎn)裸鼠的缺點(diǎn)動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇C57BL/6小鼠

28、 小鼠類的一種，黑毛，體型小，性情較溫順，易于飼養(yǎng)管理，對(duì)藥物敏感性好，為研究Lewis肺癌所選小鼠。費(fèi)用適中，飼養(yǎng)條件不太高，易大量繁殖，因而一般可用于藥物的體內(nèi)初篩選研究。（LewisLewis肺癌為C57BL/6小鼠來(lái)源的腫瘤） 動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇大鼠 大鼠也廣泛用于腫瘤研究。與小鼠相比，大鼠的體型較大，供給的組織較多，便于進(jìn)行手術(shù)等實(shí)驗(yàn)操作。大鼠的肝臟對(duì)致癌物質(zhì)很敏感，可用二乙基亞硝胺，二甲基偶氮苯（DAB）復(fù)制大鼠肝癌動(dòng)物模型，還可用甲基芐基亞硝胺誘發(fā)大鼠食管癌動(dòng)物模型。 大鼠的自發(fā)性癌變的發(fā)生率較低。動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇金黃地鼠：金黃地鼠：金黃地鼠是腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中最常用的動(dòng)物，

29、她廣泛用于研究腫瘤的增殖、致癌、抗癌、腫瘤轉(zhuǎn)移、康癌藥物的篩選等。豚鼠：豚鼠：曾被認(rèn)為是很少發(fā)生腫瘤的動(dòng)物，近年發(fā)現(xiàn)豚鼠也可發(fā)生自發(fā)性腫瘤，例如支氣管乳頭腺瘤、白血病等。兩棲類動(dòng)物：兩棲類動(dòng)物：蛙類無(wú)毛，光滑的皮膚與人類接近，可為皮膚癌的研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。鳥類：鳥類：雞和其它鳥類對(duì)腫瘤病毒的研究具有極高的實(shí)用價(jià)值尤其是對(duì)于造血系統(tǒng)和間葉組織腫瘤病毒株具有易感性。魚類：魚類：魚類也可發(fā)生不少自發(fā)腫瘤，它們對(duì)化學(xué)致癌物十分敏感，例如用黃曲霉素、二乙基亞硝胺等可誘發(fā)魚類肝臟腫瘤和腎母細(xì)胞瘤。其它：其它：許多家畜如馬牛羊豬犬貓家兔馬牛羊豬犬貓家兔等都可發(fā)生各種腫瘤。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

30、方法動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇 動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 動(dòng)動(dòng) 物物 的的 選選 擇擇移植性動(dòng)物腫瘤模型移植性動(dòng)物腫瘤模型自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法移植性動(dòng)物腫瘤模型移植性動(dòng)物腫瘤模型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 非實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立非實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 移移 植植 性性 動(dòng)動(dòng) 物物 腫腫 瘤瘤 模模 型型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 用人的腫瘤細(xì)胞通

31、過(guò)移植的方法移植到適合的動(dòng)物宿主體內(nèi)，建立一個(gè)移植宿主的體內(nèi)模型，通過(guò)該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)行藥理藥效學(xué)觀察。 人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植可觀察癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)，藥物對(duì)癌細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，藥物對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡等作用。移移 植植 性性 動(dòng)動(dòng) 物物 腫腫 瘤瘤 模模 型型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 動(dòng)物要求腫瘤細(xì)胞來(lái)源腫瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇腫瘤腫瘤細(xì)胞體內(nèi)接種人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 由于人和動(dòng)物不同種，存在移植排斥反應(yīng)，故要用免疫缺陷動(dòng)物免疫缺陷動(dòng)物，如裸鼠。 裸小鼠裸小鼠是一種獨(dú)特的純系動(dòng)物，全身無(wú)毛，先天性

32、T細(xì)胞缺乏，對(duì)異種腫瘤移植幾乎無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可接受人類腫瘤移植。 裸大鼠裸大鼠無(wú)胸腺，缺少T細(xì)胞，故能成功地移植異種皮膚和異種腫瘤，包括小鼠腫瘤及人腫瘤。 動(dòng)物要求小白鼠小白鼠裸鼠裸鼠人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 人體腫瘤細(xì)胞的來(lái)源大致可分為兩類，一類是人的癌細(xì)胞株，可從細(xì)胞庫(kù)或其他實(shí)驗(yàn)室得到；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞，主要從臨床腫瘤患者體內(nèi)獲得。為了使腫瘤細(xì)胞能得到長(zhǎng)期使用和保持不同代的腫瘤組織的本來(lái)特性，防止退化或變異，對(duì)腫瘤細(xì)胞的冷凍保存是很必要的。一般情況下，液氮凍存1-2年后，細(xì)胞存活率可達(dá)80%-90。 涉及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇技術(shù) 。腫瘤細(xì)胞

33、的來(lái)源1.消化洗滌 將對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞或腹水瘤細(xì)胞經(jīng)消化脫壁后，用培養(yǎng)液洗滌l次。2.凍存細(xì)胞 配制含有保護(hù)劑 (10%15的DMSO，甘油等)的培養(yǎng)液作為細(xì)胞凍存液。以腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞凍存液中的密度為ll07/ml左右懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入到2ml塑料凍存管內(nèi)。密封后注明標(biāo)記。將凍存管放入4或30低溫冰箱內(nèi)2h后，移入液氮罐內(nèi)長(zhǎng)期保存。3.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 將凍存腫瘤細(xì)胞的凍存管從液氮罐內(nèi)取出，立即置于37-40 溫水中，使凍存細(xì)胞在l min內(nèi)全部融化，1000r/min離心l0min，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)液稀釋到所需細(xì)胞數(shù)，再進(jìn)行培養(yǎng)。慢凍快融原則 人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤

34、動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立凍存與復(fù)蘇方法1.1.體外培養(yǎng)擴(kuò)增體外培養(yǎng)擴(kuò)增 無(wú)菌條件下，將復(fù)蘇的腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。2.2.制備細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用 0.05胰蛋白酶和0.02乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）消化12 min，傾出消化液，加入無(wú)血清1640液洗滌，離心，計(jì)數(shù)，用無(wú)血清1640液或無(wú)菌生理鹽水配成濃度為1107/ ml的細(xì)胞懸液。3.3.接種腫瘤細(xì)胞接種腫瘤細(xì)胞 在無(wú)菌環(huán)境中，消毒皮膚，用lml注射器抽吸取0.2ml細(xì)胞懸液（約含2106個(gè)腫瘤細(xì)胞），接種接種在裸鼠裸鼠右前肢根部（腋窩）皮下。約1周左右

35、局部就長(zhǎng)出花生米粒大小瘤塊 。4.4.飼養(yǎng)、觀察飼養(yǎng)、觀察 在無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)、觀察，觀察瘤塊生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量瘤體的直徑，最后剝瘤稱重，計(jì)算抑制率。 接種步驟人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法移植性動(dòng)物腫瘤模型移植性動(dòng)物腫瘤模型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 非實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立非實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立 移植性動(dòng)物腫瘤模型實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)移植法瘤體測(cè)量方法 接種方法主要特點(diǎn) 實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的

36、主要特點(diǎn)1.一群動(dòng)物同時(shí)接種等量同種癌細(xì)胞，腫瘤生 長(zhǎng)速度比較一致，個(gè)體差異較?。?.接種的成活率高，接近100%；3.對(duì)宿主的影響較相似，易于客觀判斷療效；4.可在同種或同品系動(dòng)物中連續(xù)移植，長(zhǎng)期保 留，供試驗(yàn)用；5.試驗(yàn)周期一般較短，試驗(yàn)條件易于控制。 實(shí)體瘤動(dòng)物模型主要用來(lái)篩選抗腫瘤藥物。移植性動(dòng)物腫瘤模型實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)移植法瘤體測(cè)量方法 接種方法主要特點(diǎn) 小塊瘤體接種法 從動(dòng)物剝離取出腫瘤后，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長(zhǎng)良好而無(wú)變性壞死、呈淡紅色 (黑色素瘤則呈黑色或黑紫色)、魚肉狀的瘤組織，切成2mm2mm2mm的小

37、塊，在所選宿主動(dòng)物的腋下剪開(kāi)一個(gè)小口，用無(wú)鉤眼科鑷子夾取小塊，送入切口內(nèi)皮。 如何保證切成的小塊是2mm2mm2mm？ 為什么接種在腋下，因?yàn)橐赶虏科つw松弛，能使腫瘤生長(zhǎng)得較大，可延長(zhǎng)宿主動(dòng)物的壽命。實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的接種方法腫瘤細(xì)胞懸液接種法 將選取的腫瘤組織放入玻璃勻漿器中，用無(wú)菌生理鹽水研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾成單個(gè)的細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每個(gè)接種點(diǎn)皮下注射0.2ml(含1l06-1l07個(gè)細(xì)胞)，每只動(dòng)物可選用一個(gè)或多個(gè)接種點(diǎn)，通常接種于腋下部皮下。 在無(wú)菌條件下操作。實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的接種方法1.1.研磨方向及轉(zhuǎn)速 制備腫瘤細(xì)胞懸液時(shí)，在人工研磨時(shí)必須使研磨桿向

38、同一方向轉(zhuǎn)動(dòng)，不可反向交替研磨，防止磨破腫瘤細(xì)胞；如果采用電動(dòng)研磨，一定要控制好轉(zhuǎn)速，以免破壞完整的腫瘤細(xì)胞。2.2.細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞數(shù)多少適中，如果瘤細(xì)胞數(shù)過(guò)多，接種后瘤體生長(zhǎng)過(guò)快，不便于藥物作用的觀察；瘤細(xì)胞數(shù)過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致接種失敗，接種部位不能形成腫瘤。接種失敗后再在原動(dòng)物體內(nèi)重新接種也難成功，必須重新更換動(dòng)物。（為什么？）腫瘤細(xì)胞懸液接種注意事項(xiàng) 將培養(yǎng)至快要融合的單層細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)用0.25%的胰蛋白酶消化脫壁以后，經(jīng)用PBS或生理鹽水以1000r/min經(jīng)l0min離心洗滌2次后，洗掉細(xì)胞中胰蛋白酶和培養(yǎng)液中血清等成分，用臺(tái)盼籃染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用生理鹽水將腫瘤細(xì)胞稀釋成1l06-

39、1l07/ml，每個(gè)接種點(diǎn)皮下注射0.2ml細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)移植法實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的接種方法移植性動(dòng)物腫瘤模型實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)移植法瘤體測(cè)量方法 接種方法主要特點(diǎn) 實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型實(shí)體瘤瘤體測(cè)量方法 測(cè)量實(shí)體瘤生長(zhǎng)的方法有多種，主要包括測(cè)定腫瘤的質(zhì)量、體積或直徑等。瘤體測(cè)量方法 通常于停藥之后次日處死動(dòng)物，立即剝離取出瘤塊，剔除其他組織后稱重。若對(duì)照組小鼠腫瘤平均小于1g或20%小鼠的瘤重小于400mg，表示腫瘤生長(zhǎng)不良。在治療期間給藥組小鼠死亡率大于20%或平均體重下降 (自身對(duì)照)超過(guò)15%者，表示藥物毒性反應(yīng)，

40、應(yīng)適當(dāng)減量重復(fù)試驗(yàn)。 比較試驗(yàn)組與對(duì)照組瘤重的差異，按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率 對(duì)照組瘤重重對(duì)照組瘤重給藥組瘤100%100% 稱量腫瘤的質(zhì)量 當(dāng)中藥組的瘤重抑制率大于30%，需重復(fù)試驗(yàn)，連續(xù)數(shù)次療效穩(wěn)定，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異時(shí)，則評(píng)定此藥有一定療效。 瘤體的直徑與腫瘤的大小及質(zhì)量成正比。測(cè)量瘤體的直徑不需要處死動(dòng)物，可用來(lái)動(dòng)態(tài)觀察瘤體的變化。 方法：用游標(biāo)千分卡尺測(cè)量腫瘤的相互垂直的直徑，取它們的平均值即為平均直徑。MD3CBA100% MD為腫瘤平均直徑；A、B、C為實(shí)體腫瘤3個(gè)相互垂直的直徑，一般用毫米為單位。由于測(cè)量的厚度包括皮膚在內(nèi)，故瘤體越小，產(chǎn)生的誤差也就越大。注意由同一實(shí)驗(yàn)者測(cè)量。瘤體測(cè)量方法 測(cè)量腫瘤的直徑 動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法移植性動(dòng)物腫瘤模型移植性動(dòng)物腫瘤模型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型