分光光度計(jì)的使用

1、 分光光度計(jì)：指能夠從含有各種波長(zhǎng)的混合分光光度計(jì)：指能夠從含有各種波長(zhǎng)的混合光中將每一單色光分離出來并測(cè)量其強(qiáng)度的光中將每一單色光分離出來并測(cè)量其強(qiáng)度的儀器。儀器。 紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì):200:200400nm400nm 可見光分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì):400:400760nm760nm 紅外分光光度計(jì)紅外分光光度計(jì):760nm:760nm 全波段分光光度計(jì)全波段分光光度計(jì) 掌握掌握722722分光光度計(jì)的正確使用方法分光光度計(jì)的正確使用方法 熟悉分光光度計(jì)的原理、結(jié)構(gòu)和波長(zhǎng)檢測(cè)方熟悉分光光度計(jì)的原理、結(jié)構(gòu)和波長(zhǎng)檢測(cè)方法法 了解紫外分光光度計(jì)和可見分光光度計(jì)物質(zhì)了解紫外分光光度計(jì)

2、和可見分光光度計(jì)物質(zhì)檢測(cè)的特點(diǎn)檢測(cè)的特點(diǎn)目目 的的 要要 求求準(zhǔn)直準(zhǔn)直透鏡透鏡放大器放大器光源光源反射鏡反射鏡狹縫狹縫保護(hù)保護(hù)玻璃玻璃棱鏡棱鏡比色池比色池聚光透鏡聚光透鏡光電管暗盒光電管暗盒光電管光電管光光門門聚光聚光透鏡透鏡儀器光學(xué)系統(tǒng)儀器光學(xué)系統(tǒng) 光源：光源： 可見光區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈可見光區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈(320 (320 2500 nm)2500 nm) 紫外區(qū)：紫外區(qū)： 氫燈，氘燈氫燈，氘燈(180 (180 375 nm)375 nm)光源光源 單色器單色器 吸收池吸收池 檢測(cè)器檢測(cè)器 顯示系統(tǒng)顯示系統(tǒng)儀器的基本結(jié)構(gòu)儀器的基本結(jié)構(gòu) 單色器：?jiǎn)紊鳎汗庠吹墓庥纱诉M(jìn)入單色器；：光源的光由

3、此進(jìn)入單色器；：將復(fù)合光分解成單色光，棱鏡或光柵；：將復(fù)合光分解成單色光，棱鏡或光柵；透鏡或反射鏡使入射光成為平行光束；透鏡或反射鏡使入射光成為平行光束； ：?jiǎn)紊饩劢怪脸錾洫M縫；：?jiǎn)紊饩劢怪脸錾洫M縫； 依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過棱鏡時(shí)折射率不同依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過棱鏡時(shí)折射率不同 玻璃玻璃350 350 3200 nm, 3200 nm, 石英石英185 185 4000 nm4000 nm入射狹縫入射狹縫 準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直鏡棱鏡棱鏡聚焦透鏡聚焦透鏡 出射狹縫出射狹縫白光白光紅紅紫紫1 12 2800 600 500400棱鏡單色器的結(jié)構(gòu)原理示意圖棱鏡單色器的結(jié)構(gòu)原理示意圖在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的在

4、鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等等寬度等間距寬度等間距條痕條痕(600(600、12001200、24002400條條/mm )/mm )。M M1 1M M2 2出出射射狹狹縫縫光屏光屏透透鏡鏡平面透平面透射光柵射光柵光柵衍射示意圖光柵衍射示意圖原理：原理：利用光通過光柵利用光通過光柵時(shí)發(fā)生衍射和干時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光涉現(xiàn)象而分光. .光柵光柵: :波長(zhǎng)范圍寬波長(zhǎng)范圍寬, , 色散均勻色散均勻, ,分辨性能好分辨性能好, , 使用方便使用方便 吸收池：吸收池： 玻璃玻璃(G) (G) 能吸收能吸收UVUV光，光，僅適用于可見光區(qū)。僅適用于可見光區(qū)。 石英石英(Q) (Q) 吸收紫外光，吸

5、收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)。適用于紫外和可見光區(qū)。 要求：匹配性（對(duì)光的吸收要求：匹配性（對(duì)光的吸收和反射應(yīng)一致）。和反射應(yīng)一致）。直流放大器直流放大器h 光敏陰極光敏陰極陽(yáng)極陽(yáng)極90V直流電源直流電源高電阻高電阻光電管檢測(cè)示意圖光電管檢測(cè)示意圖把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置，又稱為光電轉(zhuǎn)換把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置，又稱為光電轉(zhuǎn)換器（光電管、光電倍增管、光電二極管陣列器（光電管、光電倍增管、光電二極管陣列 ）。）。 紫外紫外- -可見分光光度計(jì)，是依據(jù)物質(zhì)在不同可見分光光度計(jì)，是依據(jù)物質(zhì)在不同光區(qū)吸收光譜的特性，根據(jù)光吸收定律即朗伯光區(qū)吸收光譜的特性，根據(jù)光吸收定律即朗伯- - -比爾定律，

6、對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別和定量分析的比爾定律，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別和定量分析的儀器。儀器。A=kLcA A 吸光度吸光度(absorbance)(absorbance)L L 介質(zhì)厚度介質(zhì)厚度(length/cm)(length/cm)c c 濃度濃度(concentration)(concentration)K K 吸光系數(shù)吸光系數(shù)(absorptivity)(absorptivity)工作原理工作原理朗伯朗伯- -比爾定律的適用條件：比爾定律的適用條件： 入射光為單色光。入射光為單色光。 溶液是稀溶液。溶液是稀溶液。 適用于分子吸收和原子吸收。適用于分子吸收和原子吸收。: :表達(dá)了物質(zhì)對(duì)單色光的吸

7、收程表達(dá)了物質(zhì)對(duì)單色光的吸收程度與溶液濃度和液層厚度之間的定量關(guān)系度與溶液濃度和液層厚度之間的定量關(guān)系. . 根據(jù)下述公式求得濃度根據(jù)下述公式求得濃度. .測(cè)定測(cè)定管的吸光度值測(cè)定測(cè)定管的吸光度值找出該溶液的找出該溶液的 測(cè)定方法（摩爾吸光系數(shù)法）測(cè)定方法（摩爾吸光系數(shù)法）c=A/kL根據(jù)下述公式求得濃度根據(jù)下述公式求得濃度. .同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管的吸光度值同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管的吸光度值找出該溶液的找出該溶液的 測(cè)定方法（標(biāo)準(zhǔn)管法）測(cè)定方法（標(biāo)準(zhǔn)管法）標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)管的濃度標(biāo)準(zhǔn)管的濃度值值測(cè)定管的吸光度值測(cè)定管的吸光度值測(cè)定管的濃度值測(cè)定管的濃度值= = 0 1 2

8、 3 0 1 2 3 4 4 C C(mg/ml)(mg/ml)A A 。 。 。 。 。 * *0.80.80.60.60.40.40.20.20 0求得濃度求得濃度. .做做工作曲線工作曲線. .找出該溶液的找出該溶液的 測(cè)定方法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）測(cè)定方法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法） 722722分光光度計(jì)分光光度計(jì) 鐠釹濾光片鐠釹濾光片 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 器器 材材一、一、722722分光光度計(jì)的正確使用分光光度計(jì)的正確使用1.1.接通電源，打開儀器開關(guān)，預(yù)熱接通電源，打開儀器開關(guān)，預(yù)熱25min25min；2.2.打開樣品室蓋，將裝參比溶液的比色皿放入打開樣品室蓋，將裝參比溶液的比色皿放入比色皿架中比色皿架中

9、, ,在測(cè)定波長(zhǎng)將透射比在測(cè)定波長(zhǎng)將透射比T T調(diào)到調(diào)到0%0%。關(guān)閉樣品室蓋，將透射比關(guān)閉樣品室蓋，將透射比T T調(diào)到調(diào)到100%100%。操作步驟操作步驟3. 3. 重復(fù)重復(fù)3 3次打開、合上比色皿暗盒蓋，反復(fù)調(diào)整次打開、合上比色皿暗盒蓋，反復(fù)調(diào)整透射率透射率“0 0”和和“100100”，選擇，選擇A A測(cè)量方式。測(cè)量方式。4. 4. 將裝有待測(cè)溶液的比色皿放入比色皿架中將裝有待測(cè)溶液的比色皿放入比色皿架中, ,蓋蓋上比色蓋暗盒，推入光路，讀出吸光度。上比色蓋暗盒，推入光路，讀出吸光度。5. 5. 每次改變一次波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，必須重新校正每次改變一次波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，必須重新校正透光率透光

10、率“0 0”和和“100100”. . 波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)使用鐠釹濾光片來做標(biāo)準(zhǔn)。本波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)使用鐠釹濾光片來做標(biāo)準(zhǔn)。本儀器鐠釹濾光片是粉紅色的，實(shí)際波長(zhǎng)為儀器鐠釹濾光片是粉紅色的，實(shí)際波長(zhǎng)為529nm529nm、741nm741nm。將鐠釹濾光片裝到儀器的比色。將鐠釹濾光片裝到儀器的比色皿座中，空白為空氣，待儀器穩(wěn)定后進(jìn)行以下皿座中，空白為空氣，待儀器穩(wěn)定后進(jìn)行以下步驟：步驟：操作步驟操作步驟一、一、722722分光光度計(jì)波長(zhǎng)檢測(cè)分光光度計(jì)波長(zhǎng)檢測(cè) 1.1.打開比色皿蓋子，調(diào)節(jié)透射比為打開比色皿蓋子，調(diào)節(jié)透射比為“0 0” ； 2.2.將比色皿蓋合上，使光電管受光，將透射比調(diào)將比色皿蓋合上，使光電管受光，將透射比調(diào) “100100” ，反復(fù)反復(fù)3 3次調(diào)整次調(diào)整透光率透光率“0 0”和和 “100100”； 3.3.將鐠釹濾光片置于光路中，然后根據(jù)表將鐠釹濾光片置于光路中，然后根據(jù)表12-112-1、 12-212-2完成測(cè)試；完成測(cè)試； 4.4.每變一次波長(zhǎng)必須重新校對(duì)每變一次波長(zhǎng)必須重新校對(duì)“0 0”和和 “100100”，找出找出 透射比最小的波長(zhǎng)即最大吸收波長(zhǎng)。透射比最小的波長(zhǎng)即最大吸收波長(zhǎng)。1 1開機(jī)預(yù)熱后才能使用開機(jī)預(yù)熱后才能使用 ；2 2測(cè)試過程每次改變波長(zhǎng)必須調(diào)測(cè)試過