生物化學(xué)第4篇 第21章 專題篇--基因診斷與基因治療

1、目錄第第 二二 十十 一一 章章基因診斷與基因治療基因診斷與基因治療Genetic Diagnosis and Gene Therapy目錄基因基因(gene)(gene) 基因是為生物活性產(chǎn)物編碼的基因是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片斷，這些產(chǎn)物主要是蛋功能片斷，這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或各種白質(zhì)或各種RNA。目錄基因變異致病類型基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因結(jié)構(gòu)突變基因表達異?；虮磉_異常外源基因的入侵外源基因的入侵目錄第第 一一 節(jié)節(jié)基因診斷基因診斷Gene Diagnosis目錄（二）、分類（二）、分類 DNADNA診斷診斷以以DNADNA為檢測對象的診斷方

2、法。為檢測對象的診斷方法。 RNARNA診斷診斷以以mRNAmRNA為檢測對象的診斷方法。為檢測對象的診斷方法。一、基因診斷的概念和特點一、基因診斷的概念和特點 （一）、定義（一）、定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。否正常，從而對疾病作出診斷的方法。目錄（三）、特點（三）、特點n針對性強針對性強 n特異性高特異性高n靈敏度高靈敏度高 n適用性強，診斷范圍廣適用性強，診斷范圍廣目錄二、二、 基因診斷常用技術(shù)方法基因診斷常用技術(shù)方法 （一）、核酸分

3、子雜交技術(shù)（一）、核酸分子雜交技術(shù)（二二）、聚合酶鏈反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)（三三）、基因測序、基因測序（四四）、基因芯片、基因芯片（五五）、DNADNA指紋指紋目錄（一）、核酸分子雜交（一）、核酸分子雜交(molecular hybridization)技術(shù)技術(shù) 核酸分子雜交核酸分子雜交可用以檢測可用以檢測樣本中是否存在與探針序列互樣本中是否存在與探針序列互補的同源核酸序列。補的同源核酸序列。 核酸探針核酸探針 是一類具有放射是一類具有放射性標記或化學(xué)標記的并與目的性標記或化學(xué)標記的并與目的目的目的DNA或或RNA分子序列互補分子序列互補的寡核苷酸片段。的寡核苷酸片段。 目錄 探針探針是能夠同某種

4、待研究的核是能夠同某種待研究的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子，經(jīng)標記之后可用來檢測目何分子，經(jīng)標記之后可用來檢測目的的DNA/RNA 或蛋白質(zhì)分子。或蛋白質(zhì)分子。 實驗流程：實驗流程：提取提取DNA(限制酶限制酶切切)凝膠電泳凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移膜轉(zhuǎn)移雜交雜交放放射自顯影射自顯影分析分析目錄建立在核酸雜交技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法1、限制性內(nèi)切酶、限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)酶譜分析法酶譜分析法2、DNA限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism

5、, RFLP)分分析法析法 3、等位基因特異寡核苷酸、等位基因特異寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探針雜交法探針雜交法目錄1、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法 是利用限制性內(nèi)切酶和特異性是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異探針來檢測是否存在基因變異的一種方法。的一種方法。目錄Mst酶切位點酶切位點(CCTNAGG)5 3 正?；蛘；? 3 突變基因突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析AT 目錄0.2kb1.15kb1.35k

6、b正常人正常人突變攜帶著突變攜帶著患者患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析目錄2、DNA-RFLP分析法分析法 中性突變是指在人基因組中，平均每200對堿基可發(fā)生一對變異的現(xiàn)象。 DNA多態(tài)性是指中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異。 限制性片段長度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性若發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶切水解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段。目錄RFLP分析法分析法目錄3、ASO雜交法雜交法 根據(jù)已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進行分子雜交來檢測是否存在等位基因突變。

7、 目錄ASO雜交法雜交法探針：探針：M N M N M N M N 正常基因正?；?純合突變純合突變 雜合突變雜合突變 基因缺陷基因缺陷 （新的突變類型？）（新的突變類型？） 目錄（二）、聚合酶鏈反應(yīng)（二）、聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特異的引物，特異地擴是利用特異的引物，特異地擴增目的增目的DNA的方法。的方法。 實驗流程：實驗流程：提取提取DNAPCR凝膠電泳凝膠電泳顯色顯色分析分析目錄5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5

8、 1 1、基本工作原理、基本工作原理目錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。目錄2、常用的常用的PCR方法方法： 常規(guī)常規(guī)PCR、巢式、巢式PCR、多重、多重PCR、多種、多種PCR、不對稱、不對稱PCR、反、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄PCR、定量反轉(zhuǎn)錄、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA差異顯示差異顯示PCR、原位、原位PCR、實時實時PCR等等。等等。目錄3、在、在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法nPCR-SSCP法法*nPCR-ASO法法nPC

9、R-RFLP法法nPCR-限制酶譜法限制酶譜法nPCR-STR（短串聯(lián)重復(fù)序列，（短串聯(lián)重復(fù)序列，short tandem repeat）目錄 SSCP是指相同長度的單鏈是指相同長度的單鏈DNA因其堿因其堿基序列不同，甚至單個堿基不同，都可能基序列不同，甚至單個堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時泳動速率不同的現(xiàn)象。酰胺凝膠電泳時泳動速率不同的現(xiàn)象。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)目錄PCR-SSCP分析分析 是指是指PCR產(chǎn)物變性后，

10、經(jīng)聚丙產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，借此可分析基因的遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。確定致病基因的存在。目錄正常人正常人純合突變純合突變雜合突變雜合突變Leber 遺傳性神經(jīng)病患者遺傳性神經(jīng)病患者 PCR/SSCP分析分析 （線粒體（線粒體DNA第第11778位位GA所致）所致）+目錄（三三）、基因測序、基因測序(gene sequencing)(gene sequencing) 即測定某一基因的堿基序列。即測定某一基因的堿基序列。 實驗流程：實驗流程：提取提取DNA分離出有關(guān)基因分離出有關(guān)基因測序測序分析診斷分析

11、診斷 基因測序的方法：基因測序的方法：n化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法nDNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法nDNA自動測序自動測序目錄（四四）、基因芯片（、基因芯片（gene chip)gene chip) 基因芯片，又稱基因芯片，又稱DNA芯片、芯片、DNA陣陣列、寡核苷酸微芯片（列、寡核苷酸微芯片（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip）是指將許多特定的寡核苷酸片段是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基

12、配對原理進行雜交，再通過激光因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出定性和定作出比較和檢測，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。量的結(jié)果。目錄目錄基因芯片的應(yīng)用基因芯片的應(yīng)用1、在診斷中的應(yīng)用、在診斷中的應(yīng)用 核酸序列分析、基因表達分析、尋找核酸序列分析、基因表達分析、尋找新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測等新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測等2、在藥學(xué)研究中的應(yīng)用、在藥學(xué)研究中的應(yīng)用 藥物篩選、藥物作用機制研究、耐藥藥物篩選、藥物作用機

13、制研究、耐藥菌株、藥敏檢測、毒理學(xué)研究、環(huán)境化菌株、藥敏檢測、毒理學(xué)研究、環(huán)境化學(xué)毒物的篩選、基因掃描等學(xué)毒物的篩選、基因掃描等目錄（五）、（五）、DNA指紋指紋(DNA fingerprint) 在人基因組在人基因組DNA中有高度可變的中有高度可變的“小衛(wèi)星小衛(wèi)星”區(qū)域，采用區(qū)域，采用“小衛(wèi)星小衛(wèi)星”基因探針，基因探針，在同一限在同一限制酶切產(chǎn)物的制酶切產(chǎn)物的DNA雜交雜交圖譜上，同一個體圖譜上，同一個體不同組織來源的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而的譜帶完全一致，而不同個體之間（同卵雙生除外）譜帶都不相不同個體之間（同卵雙生除外）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個體特異性一樣，同，

14、如同人的指紋具有高度個體特異性一樣，因此這種因此這種雜交雜交圖譜被稱為圖譜被稱為DNA指紋或遺傳指紋或遺傳指紋指紋（genetic fingerprint）。目錄 簡言之：簡言之：DNA指紋或遺傳指紋指紋或遺傳指紋是指是指采用采用“小衛(wèi)星小衛(wèi)星”基因探針基因探針進行進行DNA分子雜交分子雜交（ Southern 印跡，印跡，Southern blotting）所得的圖譜。所得的圖譜。 實驗流程：實驗流程：提取提取DNADNA限制酶切限制酶切凝膠電泳凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移膜轉(zhuǎn)移雜交雜交放射自顯放射自顯影影分析分析目錄三、基因診斷的應(yīng)用三、基因診斷的應(yīng)用n遺傳疾病遺傳疾病n腫瘤腫瘤n感染性疾病感染性疾病n

15、傳染性流行病傳染性流行病n判斷個體疾病易感性判斷個體疾病易感性n器官移植組織配型器官移植組織配型n法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定目錄總結(jié) 基因診斷的概念、特點、常基因診斷的概念、特點、常用的技術(shù)方法及應(yīng)用。用的技術(shù)方法及應(yīng)用。目錄復(fù)習(xí)題1、名詞解釋：、名詞解釋： 基因診斷、基因診斷、DNA診斷、診斷、RNA診斷、診斷、RFLP分析、分析、SSCP、基因芯片、基因芯片、DNA指紋指紋2、簡述基因診斷的特點、常用技術(shù)方、簡述基因診斷的特點、常用技術(shù)方法及可用于診斷的疾病。簡述基因變異法及可用于診斷的疾病。簡述基因變異致病的類型及內(nèi)源性基因變異的類型。致病的類型及內(nèi)源性基因變異

16、的類型。簡述限制性內(nèi)切酶譜分析法、簡述限制性內(nèi)切酶譜分析法、ASO探針探針雜交法、雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、分析、基因芯片、DNA指紋等的實驗流程。指紋等的實驗流程。目錄第第 二二 節(jié)節(jié)基因治療基因治療Gene Therapy目錄（一）、基因治療的概念（一）、基因治療的概念早期早期是指用正常的基因整合入細胞基因組，是指用正常的基因整合入細胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。以校正和置換致病基因的一種治療方法。 目前目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的

17、方法。達到治療疾病目的的方法。一、基因治療的概念一、基因治療的概念目錄（二）、基因治療的基本方法（二）、基因治療的基本方法1 1、基因矯正、基因矯正 ( (gene correction) )2 2、基因置換、基因置換 ( (gene replacement) )3 3、基因增補、基因增補 ( (gene augmentation) )4 4、基因失活、基因失活 ( (gene inactivation) ) 目錄 1、基因矯正、基因矯正 (gene correction) 指將致病基因的異常堿基進行糾指將致病基因的異常堿基進行糾正，而正常部分予以保留。正，而正常部分予以保留。 納米鉗納米鉗目

18、錄A G C T G T G A A G T C G T GA G C T G T G A A G T C G T GT C G A C A C T T C A G C A CT C G A C A C T T C A G C A CabnormalgeneGene correctionnormalgeneTACG目錄2 2、基因置換、基因置換 ( (gene replacement) ) 指用正常的基因通過體內(nèi)基因同源指用正常的基因通過體內(nèi)基因同源重組，原位替換致病基因，使細胞內(nèi)的重組，原位替換致病基因，使細胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。完全恢復(fù)正常狀態(tài)。目錄A G C T G T G A

19、G C T G T G C C A A G T C G T GA A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C G G T T C A G C A CT T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G C A A G T C G T GA G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G A G C T G T G T T A A G T C G T GA

20、 A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C A A T T C A G C A CT T C A G C A CabnormalgeneGene replacement目錄3、基因增補、基因增補 (gene augmentation) 將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌殞⒛康幕驅(qū)氩∽兗毎蚱渌毎蝗コ惓；颍峭ㄟ^目的基胞，不去除異常基因，而是通過目的基因的非定點整合，使其表達產(chǎn)物彌補缺因的非定點整合，使其表達產(chǎn)物彌補缺陷基因的功能或使原有基因表達增強。陷基因的功能或使原有基因表達增強。目錄A G C T G T G A G C T G T G

21、C C A A G T C G T GA A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C G G T T C A G C A CT T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G A G C T G T G T T A A G T C G T GA A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C A A T T C A G C A CT T C A G C A CabnormalgeneGene augmentation目錄4 4、基因失活、基因失活 (gene inactivation)(gene

22、inactivation) 指將特定的序列導(dǎo)入細胞后，在轉(zhuǎn)錄指將特定的序列導(dǎo)入細胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，已達到治療疾病的目的。已達到治療疾病的目的。目錄幾種常見的基因失活技術(shù)幾種常見的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)三鏈技術(shù)干擾干擾RNA技術(shù)技術(shù)肽核酸肽核酸基因敲除基因敲除目錄反義反義(antisence)核酸技術(shù)核酸技術(shù) 是指用人工合成的是指用人工合成的RNA或或DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。因而不能翻譯成相

23、應(yīng)的蛋白質(zhì)。目錄反義反義RNA技術(shù)技術(shù) 反義反義RNA是指與是指與mRNA互補，互補，且能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因表且能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因表達的達的RNA。 反義反義RNA技術(shù)技術(shù)是指利用反義是指利用反義RNA在在mRNA水平上封閉基因表達，水平上封閉基因表達，最終可通過調(diào)節(jié)劑量，來治療由基因最終可通過調(diào)節(jié)劑量，來治療由基因突變或過度表達所致的疾病或嚴重感突變或過度表達所致的疾病或嚴重感染性疾病。染性疾病。 目錄T C G A C A C T C G A C A C A A T T C A G C A CT T C A G C A CA G C T G T G A G C T G T

24、 G T T A A G T C G T GA A G T C G T GabnormalgeneGene inactivationabnormalmRNA U C G A C A C A U U C A G C A CU C G A C A C A U U C A G C A C反義反義RNARNA A G C U G U G A G C U G U G U U A A G U C G U G A A G U C G U GAbnormal proteinAbnormal protein目錄核酶核酶(ribozyme)技術(shù)技術(shù) 通過核酶分子結(jié)合到靶通過核酶分子結(jié)合到靶RNA分分子中適當(dāng)?shù)牟课?/p>

25、，形成錘頭核酶結(jié)子中適當(dāng)?shù)牟课?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，催化對靶構(gòu)，催化對靶RNA分子的剪切，從分子的剪切，從而破壞靶而破壞靶RNA分子達到治療疾病的分子達到治療疾病的目的。目的。目錄5353靶靶RNA核酶分子核酶分子核酶技術(shù)核酶技術(shù)目錄三鏈技術(shù)三鏈技術(shù)(triplex approach) 又稱為又稱為反基因策略反基因策略(antigene stragegy)，是利用脫氧寡核苷酸能與雙，是利用脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈螺旋雙鏈DNA專一性序列結(jié)合，形成三專一性序列結(jié)合，形成三鏈鏈DNA，從而在轉(zhuǎn)錄水平或復(fù)制水平阻，從而在轉(zhuǎn)錄水平或復(fù)制水平阻止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù)。止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù)。 能形成三鏈

26、能形成三鏈DNA的脫氧寡核苷酸稱的脫氧寡核苷酸稱為三鏈為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸（形成脫氧寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide,TFO)。目錄復(fù)制、轉(zhuǎn)錄復(fù)制、轉(zhuǎn)錄三鏈三鏈DNA技術(shù)技術(shù)目錄干擾干擾RNA(interference RNA,RNAi)技術(shù)技術(shù) RNAi是指在特定因子作用下，是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的降解生成的約約22nt左右的左右的SiRNAs(single strand RNAi)。 RNAi技術(shù)技術(shù)是指利用堿基互補配是指利用堿基互補配對原則，使對原則，使RNAi和靶和靶DNA結(jié)合，結(jié)合，同時誘導(dǎo)

27、激活體內(nèi)的基因沉默因子，同時誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶從而使靶DNA降解。降解。目錄dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解降解干擾干擾RNA技術(shù)技術(shù)RNAi目錄RNAi技術(shù)的特點技術(shù)的特點n特異性強特異性強n效率性高效率性高n作用時間長作用時間長n可通過細胞屏障而發(fā)揮作用可通過細胞屏障而發(fā)揮作用目錄肽核酸肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)技術(shù)技術(shù) PNA是指是指DNA-肽復(fù)合物。肽復(fù)合物。 PNA技術(shù)技術(shù)是利用多肽與是利用多肽與DNA的的特異性結(jié)合，專一地抑制某一基因的特異性結(jié)合，專一地抑制某一基因的表達。表達。目錄肽肽肽核酸技術(shù)肽核酸技術(shù)目錄基因敲除基

28、因敲除(gene knock-out)技術(shù)技術(shù) 指有目的的去除動物體內(nèi)某種指有目的的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。基因的技術(shù)。目錄（三）、基因治療的其他方法（三）、基因治療的其他方法1、“自殺基因自殺基因”的應(yīng)用的應(yīng)用 某些病毒或細菌的基因所表達的酶能某些病毒或細菌的基因所表達的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體在人體細將對人體無毒或低毒的藥物前體在人體細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘援a(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘援a(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細胞也被殺死，故稱這類基該基因的受體細胞也被殺死，故稱這類基因為自殺基因。因為自殺基因。 自殺基因自殺基因 無毒、低毒的藥物前體無毒、低毒的藥物前體 細胞細胞毒性

29、產(chǎn)物毒性產(chǎn)物細胞死亡細胞死亡目錄2、基因疫苗的應(yīng)用、基因疫苗的應(yīng)用 將編碼外源性抗原的基因插入到含將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直真核表達系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞接導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞內(nèi)表達抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)內(nèi)表達抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。答。目錄重組表達質(zhì)粒重組表達質(zhì)粒外源性抗外源性抗原基因原基因基因疫苗基因疫苗目錄二、基因治療的基本程序二、基因治療的基本程序一、一、治療性基因的選擇治療性基因的選擇 目的基因的選擇目的基因的選擇二、基因載體的選擇二、基因載體的選擇三、靶細胞的選擇三、靶細胞的選擇四

30、、基因轉(zhuǎn)移四、基因轉(zhuǎn)移五、外源基因表達的篩選五、外源基因表達的篩選 利用載體中的標記基因利用載體中的標記基因 有有neoneor r標記基因時，用標記基因時，用 418418進行篩選進行篩選六、回輸體內(nèi)六、回輸體內(nèi) 靜脈回輸靜脈回輸 自體骨髓移植自體骨髓移植 埋入皮下組織埋入皮下組織病毒載體病毒載體* * *非病毒載體非病毒載體體細胞體細胞生殖細胞生殖細胞間接體內(nèi)療法間接體內(nèi)療法(ex vivo)(ex vivo)直接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法(in vivo)(in vivo)目錄目錄 常見基因載體的優(yōu)缺點常見基因載體的優(yōu)缺點載體載體 優(yōu)點優(yōu)點 缺點缺點逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒 基因組小并且簡單基因組

31、小并且簡單 僅感染分裂細胞僅感染分裂細胞 穩(wěn)定整合于宿主基因組穩(wěn)定整合于宿主基因組 隨機整合可能導(dǎo)致突變隨機整合可能導(dǎo)致突變 生物學(xué)特性清楚生物學(xué)特性清楚 常常只有短暫表達常常只有短暫表達 可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細胞可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細胞 病毒滴度低病毒滴度低107pfu/ml107pfu/ml 對宿主無害對宿主無害 可能會于有復(fù)制能力的病毒重組可能會于有復(fù)制能力的病毒重組腺病毒相關(guān)病毒腺病毒相關(guān)病毒 基因組小基因組小 未知未知 可特異整合于人染色體可特異整合于人染色體19q 19q 需腺病毒輔助復(fù)制需腺病毒輔助復(fù)制 以人細胞作為宿主以人細胞作為宿主 攜帶外源基因能力有限攜帶外源基因能力有限 無毒，無致病性無毒，無致病性 難得到高滴度病毒難得到高滴度病毒目錄腺病毒腺病毒 適用于原位使用，尤其是肺適用于原位使用，尤其是肺 不與宿主基因整合不與宿主基因整合 在不分裂細胞中可進行高效率在不分裂細胞中可進行高效率 只有短暫表達只有短暫表達 的體內(nèi)感染的體內(nèi)感染 無特異性靶細胞無特異性靶