18-生物化學實驗吳憲-Folin法測定血糖含量

1、吳憲-Folin法測定血糖含量【目的】1 .掌握吳憲-Folin法測定血糖含量的實驗方法。2 .熟悉吳憲-Folin法測定血糖含量的實驗原理?！驹怼挎u酸鈉（Na2WO4）和硫酸作用，生成鎢酸，可沉淀血液樣品中的蛋白質(zhì)濾除蛋白質(zhì)沉淀即可制得無蛋白血濾液，此血濾液中的葡萄糖具有還原性與鹼性銅試劑共熱可使蘭色的二價銅離子（Cu2+）還原成紅色的氧化亞銅（Cu2O）沉淀。氧化亞銅再使無色的磷鉬酸還原成蘭色的鉬蘭。顏色深淺與葡萄糖含量成正比。因此，將血濾液和經(jīng)同樣處理的標準葡葡萄溶液分別進行比色，即可求出血糖含量。其反應(yīng)如下：1鹼性銅試劑內(nèi)的反應(yīng)N32CO3*H?0呂OH+NaHCO3-2NaOH4C

2、uS.O4：7Cu（OH）24Na2SO42 定糖顯色反應(yīng)2Cu（OHh-CEH12p6u20+C6H12.O742H2O葡萄糖（:磚紅色）葡萄擔酸3Cu2O+3H3P042Mo03d2H203H3POMo2O3d2H2O6CuO磷韜酸鉗藍（藍色？【器材】1 Folin-吳氏定糖管2中號試管3電爐及加熱器4刻度吸管5微量移液器6漏斗7分光光度計【試劑】11/3mol/L硫酸溶液2 10%鎢酸鈉3 堿性銅試劑取無水碳酸鈉40g溶解于400ml蒸餾水中，再加入酒石酸，溶解后定量地移入1000ml量瓶中，再加入結(jié)晶硫酸銅（可先用熱水浴稍微加熱），待其完全溶解后加蒸餾水至刻度，混勻貯于棕色瓶中保存。4

3、 磷鉬酸試劑取鉬酸（H2MoO4）35g和鎢酸鈉5g加入1000ml平底燒杯中，加入10%的氫氧化鈉200ml，蒸餾水100ml煮沸20-40分鐘以除以鉬酸試劑中可能存在的氨。冷卻后加蒸餾水使全量為350ml。再加入濃磷酸（85%）120ml，最后加水蒸餾水至500ml。5 葡萄糖標準液（1）儲存液（1mg/ml）：精確稱取葡萄糖置于1000ml量瓶中，加入防腐劑%苯甲酸溶液至刻度。（2）應(yīng)用液（dl）：臨用時，取上述儲存液25ml，注入1000ml量瓶中，加蒸餾水至刻度處。【操作】1無蛋白血濾液的制備取小錐形瓶1個，準確加入蒸餾水7ml，用干燥移液管準確吸取全血。用小塊濾紙擦干吸管外面附著血

4、液，然后徐徐地將血液放入水中（將吸管尖端放在錐形瓶液面以下），待血液放完以后再吸取錐形瓶內(nèi)液將試管洗滌二次。吸管內(nèi)最后一滴液體吹出，混勻，透明呈寶石紅色。加1/3mol/L，硫酸液混勻再加10%鎢酸鈉溶液、充分混勻。放置5分鐘，待溶液由棕色透明變?yōu)榭Х壬鞚岷?，用多層干燥濾紙過濾于一干燥的試管中，即得40倍稀釋的鎢酸血濾液。濾液必須無色透明，如發(fā)現(xiàn)混濁，即證明尚有蛋白質(zhì)存在，不合要求，應(yīng)重新制備。2血糖測定取干燥潔凈的Folin-吳氏定糖管3支，標號，按下表操作：試劑（ml）測定管標準管空白管無蛋白血濾液一一葡萄糖標準液一一蒸餾水一一鹼性銅試劑充分混勻，置沸水浴準確煮沸8分鐘，取出切勿搖動，以

5、自來水沖冷3分鐘，各加磷鉬酸試劑?；靹?，放置3分鐘，待蘭色反應(yīng)完全后，將上述各管加蒸餾水稀釋至刻度處，用拇指或手掌堵嚴管口，倒轉(zhuǎn)12次，充分混勻，放置10分鐘后，于波長620nm處，以空白管調(diào)零點，進行比色，分別讀取并記錄各管吸光度值?！居嬎恪繙y定管吸光度咤訃血糖濃度（mg/dl）=mg/di血糖濃度（mmol/L）=1和【注意事項】1 血液不能放置過久，以免血糖分解致使含量降低。2 在制備無蛋白血濾液時，加各種試劑的順序不能顛倒，每加一種試劑后應(yīng)充分振搖以免形成血塊蛋白沉淀不完全。3 葡萄糖與鹼性試劑的鹼性、各成分的濃度、加熱的溫度及時間等均有關(guān)。因此操作時應(yīng)力求條件恒定。4 加入磷鉬酸試劑后顯色不穩(wěn)定，應(yīng)迅速進行比色。5 本法測定的是血中還原性糖的含量，所以血糖正常值為80120mg/dl或L,比葡萄糖氧化酶法測定值高。目前臨床多用專一性高的葡