18-生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)吳憲-Folin法測(cè)定血糖含量

1、吳憲-Folin法測(cè)定血糖含量【目的】1 .掌握吳憲-Folin法測(cè)定血糖含量的實(shí)驗(yàn)方法。2 .熟悉吳憲-Folin法測(cè)定血糖含量的實(shí)驗(yàn)原理。【原理】鎢酸鈉（Na2WO4）和硫酸作用，生成鎢酸，可沉淀血液樣品中的蛋白質(zhì)濾除蛋白質(zhì)沉淀即可制得無(wú)蛋白血濾液，此血濾液中的葡萄糖具有還原性與鹼性銅試劑共熱可使蘭色的二價(jià)銅離子（Cu2+）還原成紅色的氧化亞銅（Cu2O）沉淀。氧化亞銅再使無(wú)色的磷鉬酸還原成蘭色的鉬蘭。顏色深淺與葡萄糖含量成正比。因此，將血濾液和經(jīng)同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)葡葡萄溶液分別進(jìn)行比色，即可求出血糖含量。其反應(yīng)如下：1鹼性銅試劑內(nèi)的反應(yīng)N32CO3*H?0呂OH+NaHCO3-2NaOH4C

2、uS.O4：7Cu（OH）24Na2SO42 定糖顯色反應(yīng)2Cu（OHh-CEH12p6u20+C6H12.O742H2O葡萄糖（:磚紅色）葡萄擔(dān)酸3Cu2O+3H3P042Mo03d2H203H3POMo2O3d2H2O6CuO磷韜酸鉗藍(lán)（藍(lán)色？【器材】1 Folin-吳氏定糖管2中號(hào)試管3電爐及加熱器4刻度吸管5微量移液器6漏斗7分光光度計(jì)【試劑】11/3mol/L硫酸溶液2 10%鎢酸鈉3 堿性銅試劑取無(wú)水碳酸鈉40g溶解于400ml蒸餾水中，再加入酒石酸，溶解后定量地移入1000ml量瓶中，再加入結(jié)晶硫酸銅（可先用熱水浴稍微加熱），待其完全溶解后加蒸餾水至刻度，混勻貯于棕色瓶中保存。4

3、 磷鉬酸試劑取鉬酸（H2MoO4）35g和鎢酸鈉5g加入1000ml平底燒杯中，加入10%的氫氧化鈉200ml，蒸餾水100ml煮沸20-40分鐘以除以鉬酸試劑中可能存在的氨。冷卻后加蒸餾水使全量為350ml。再加入濃磷酸（85%）120ml，最后加水蒸餾水至500ml。5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1）儲(chǔ)存液（1mg/ml）：精確稱取葡萄糖置于1000ml量瓶中，加入防腐劑%苯甲酸溶液至刻度。（2）應(yīng)用液（dl）：臨用時(shí)，取上述儲(chǔ)存液25ml，注入1000ml量瓶中，加蒸餾水至刻度處?！静僮鳌?無(wú)蛋白血濾液的制備取小錐形瓶1個(gè)，準(zhǔn)確加入蒸餾水7ml，用干燥移液管準(zhǔn)確吸取全血。用小塊濾紙擦干吸管外面附著血

4、液，然后徐徐地將血液放入水中（將吸管尖端放在錐形瓶液面以下），待血液放完以后再吸取錐形瓶?jī)?nèi)液將試管洗滌二次。吸管內(nèi)最后一滴液體吹出，混勻，透明呈寶石紅色。加1/3mol/L，硫酸液混勻再加10%鎢酸鈉溶液、充分混勻。放置5分鐘，待溶液由棕色透明變?yōu)榭Х壬鞚岷?，用多層干燥濾紙過(guò)濾于一干燥的試管中，即得40倍稀釋的鎢酸血濾液。濾液必須無(wú)色透明，如發(fā)現(xiàn)混濁，即證明尚有蛋白質(zhì)存在，不合要求，應(yīng)重新制備。2血糖測(cè)定取干燥潔凈的Folin-吳氏定糖管3支，標(biāo)號(hào)，按下表操作：試劑（ml）測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管無(wú)蛋白血濾液一一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液一一蒸餾水一一鹼性銅試劑充分混勻，置沸水浴準(zhǔn)確煮沸8分鐘，取出切勿搖動(dòng)，以

5、自來(lái)水沖冷3分鐘，各加磷鉬酸試劑。混勻，放置3分鐘，待蘭色反應(yīng)完全后，將上述各管加蒸餾水稀釋至刻度處，用拇指或手掌堵嚴(yán)管口，倒轉(zhuǎn)12次，充分混勻，放置10分鐘后，于波長(zhǎng)620nm處，以空白管調(diào)零點(diǎn)，進(jìn)行比色，分別讀取并記錄各管吸光度值。【計(jì)算】測(cè)定管吸光度咤訃血糖濃度（mg/dl）=mg/di血糖濃度（mmol/L）=1和【注意事項(xiàng)】1 血液不能放置過(guò)久，以免血糖分解致使含量降低。2 在制備無(wú)蛋白血濾液時(shí)，加各種試劑的順序不能顛倒，每加一種試劑后應(yīng)充分振搖以免形成血塊蛋白沉淀不完全。3 葡萄糖與鹼性試劑的鹼性、各成分的濃度、加熱的溫度及時(shí)間等均有關(guān)。因此操作時(shí)應(yīng)力求條件恒定。4 加入磷鉬酸試劑后顯色不穩(wěn)定，應(yīng)迅速進(jìn)行比色。5 本法測(cè)定的是血中還原性糖的含量，所以血糖正常值為80120mg/dl或L,比葡萄糖氧化酶法測(cè)定值高。目前臨床多用專一性高的葡