組織化學(xué)定位

1、酶組織化學(xué)定位學(xué)院：生命科學(xué)專業(yè)：植物學(xué)姓名：馬偉寶一、組織化學(xué)建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)之上的組織化學(xué)屬邊緣科學(xué)范疇,是研究細(xì)胞和組織中的化學(xué)組成、定位與定量以及代謝狀態(tài)的科學(xué),其根本的目的是聯(lián)系形態(tài)、化學(xué)成分、功能來了解細(xì)胞或組織的代謝變化。（一）、研究方法 化學(xué)方法、類化學(xué)方法、物理學(xué)方法、顯微燒灰法等。與其他學(xué)科的關(guān)系 細(xì)胞學(xué)：細(xì)胞學(xué)把細(xì)胞看作生命活動的基本單位，從細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子三個水平研究探索細(xì)胞的各種生命活動規(guī)律。 組織學(xué)：是闡明正常情況下細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和其生理活動。 聯(lián)系：他們都是組織化學(xué)的形態(tài)基礎(chǔ)。生物化學(xué)：一方面是進(jìn)行細(xì)胞組織成分的化學(xué)分析，另一方面是對這些成分的

2、化學(xué)反應(yīng)分析。聯(lián)系：是組織化學(xué)反應(yīng)原理的基礎(chǔ)。 免疫學(xué)與組織化學(xué)：將抗原、抗體的特異性與組織化學(xué)的可見性巧妙的結(jié)合起來，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)。 分子生物學(xué)與組織化學(xué)：將堿基配對的分子雜交原理與組織化學(xué)結(jié)合，產(chǎn)生核酸原有位置上進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)核酸定性、定位。二、酶的組織化學(xué)定位 概念:用細(xì)胞內(nèi)的酶具有催化底物的特性，并通過顯色反應(yīng)在切片或涂片上顯示組織或細(xì)胞中內(nèi)源性酶的活性及其定位的方法。 特點： 在原位檢測 檢測酶的活性而不是酶分子本身（一）、酶組織化學(xué)發(fā)展歷史 1939年以前：主要研究細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，未出現(xiàn)酶組織化學(xué)方法 （如Klebs和Stuve 指出愈創(chuàng)木酯酊同膿作用能產(chǎn)

3、生藍(lán)色過氧化物酶） 1939年：酶組織化學(xué)真正開始 高松英雄和Gomori堿性磷酸酶（硫化鈷反應(yīng)、銀反應(yīng)） 同年，酸性磷酸酶組織化學(xué)方法也發(fā)表 1940-1950年：酶組織化學(xué)發(fā)展的黃金時期 創(chuàng)立了金屬鹽法、偶聯(lián)偶氮色素法 50年代后：電鏡酶組織化學(xué) 將超薄切片法和電鏡技術(shù)應(yīng)用到酶組織化學(xué)上，獲得了酶的更精確的定位 60年代后期：免疫組織化學(xué) 利用抗原抗體特異性反應(yīng)來定位酶蛋白 電鏡免疫組化（二）、酶的種類 1. 氧化還原酶 2. 轉(zhuǎn)移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶（裂解酶） 5. 異構(gòu)酶 6. 合成酶（連接酶） 目前，能用酶組織化學(xué)方法顯示出來，并可進(jìn)行定性、定位和定量的酶較少，僅200余種

4、，因此潛力巨大（三）、酶組織化學(xué)反應(yīng)的基本知識 1、酶的特性：水溶性，易擴散，難溶或不溶于有機溶劑、有機溶劑不同程度降低酶的活性、易受溫度影響，對熱耐受性弱、對干燥耐受性強 2、酶的定位：酶在細(xì)胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在的特定部位。 如：5-核苷酸酶漿膜 ATPase肌球蛋白 細(xì)胞膜 線粒體3、酶組化的基本條件 同時保存結(jié)構(gòu)和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的擴散或移位 保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性 * 影響酶活性的因素： 溫度 PH值 抑制劑 激活劑 4、原理及一般原則 基本原理：細(xì)胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物（即初級反應(yīng)產(chǎn)物），然后其中之一再與輔助物（或捕捉劑）反應(yīng)，生成有色不溶性的終反應(yīng)產(chǎn)物

5、，該反應(yīng)產(chǎn)物沉積在原位，以顯示酶的存在 第一反應(yīng)：酶促反應(yīng) 底物 初級反應(yīng)產(chǎn)物（PRP） 不可見 第二反應(yīng)：捕捉反應(yīng) PRP + 捕捉劑 終反應(yīng)產(chǎn)物（FRP） 一般原則：1、對組織處理,制片過程不能影響酶活性及分布2、所選底物和輔助物必須迅速、同步穿透入組織和細(xì)胞中3、所選底物最好只能被一種酶催化分解 4.所選輔助物不影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性, 不影響其他反應(yīng)試劑的穿透性5.PRP必須迅速與輔助物反應(yīng),FRP為水不溶性的有色穩(wěn)定產(chǎn)物6.所有參與反應(yīng)的試劑均不能與其他成分吸附或結(jié)合5、 酶組織化學(xué)的主要步驟 1、固定或不固定的標(biāo)本 2、切片(冷凍或不冷凍) 3、孵育 4、顯色 5、顯微鏡下觀察6、各步

6、驟注意問題 1、檢測方法的選擇 2、酶的保存與固定 一般新鮮組織快速冷凍, 冰凍切片(-70長期保存；可用丙酮 氯仿=1 14，510分鐘稍固定) 固定劑:抑制酶活性和細(xì)胞化學(xué)成分活性的重金屬鹽Hg、Cr、Pb等不能用做固定劑；慎用醛類 固定方法: 浸泡固定 灌流固定 固定溫度: 04 3、切片制作: 切片厚度40um，一般812um 4、 緩沖液選擇 緩沖液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反應(yīng)孵育液 選擇緩沖液應(yīng)注意 A.不能減弱目標(biāo)酶的活性 B.不能含有與捕捉機制相同的物質(zhì) C. 注意漂洗用緩沖液的滲透壓 D. 漂洗用緩沖液原則上與固定液配置的緩沖液相同 5、孵育反應(yīng) A. 孵育液配置: 底物濃度量要足夠1 20(V/ V); 孵育液只能用一次，配制時要適量 B. 孵育的溫度和時間: 37 15