一種CAST基因過表達(dá)小鼠的建立

1、鈣蛋白酶抑制蛋白基因過表達(dá)Balb/C 小鼠的繁育及鑒定虞 勇，李明輝，劉桂劍，李冰玉，鄒云增，陳瑞珍*( 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心血管病研究所實驗室，上海200032)收稿日期2016-02-03接受日期2016-06-04基金項目國家自然科學(xué)基金(31070786). Supported by National Natural Science Foundation ofChina( 31070786) .作者簡介虞勇，主管技師. E-mail: yu.yong1zs-* 通 信 作 者 (Corresponding author). Tel:8543, E-mai

2、l: chen.ruizhenzs-摘要 目的： 建立 Balb/C 小鼠遺傳背景的鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST )基因過表達(dá)小鼠的培育方法，并探討堿性裂解液提取基因組DNA 在子代鼠基因型鑒定中的應(yīng)用價值。方法： 將雄性 C57BL/6-CAST +/-轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性Balb/C 野生型小鼠雜交，子代小鼠中取雄性鑒定為CAST +/-雜合子小鼠與雌性Balb/C 野生型小鼠雜交，連續(xù)雜交直至消除C57BL/6小鼠遺傳背景。取子代小鼠鼠尾組織，采用堿性裂解液提取基因組DNA ， PCR 法擴(kuò)增 CAST基因片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。采用柯薩奇B3 病毒( CVB3

3、 )感染 Balb/C-CAST -/-小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。結(jié)果： C57BL/6-CAST +/-轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性Balb/C野生型小鼠連續(xù)雜交10 代可消除C57BL/6 小鼠遺傳背景。采用堿性裂解液提取的基因組DNA 數(shù)量、純度能夠滿足后續(xù)實驗需要，且產(chǎn)物大小與目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST -/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。結(jié)論： 成功建立Balb/C-CAST 基因過表達(dá)小鼠，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；堿性裂解液提取基因組DNA 簡單、高效，值得推廣。關(guān)鍵詞鈣離子依賴性蛋白酶；鈣蛋白酶抑制蛋白；柯薩奇B3 病毒；轉(zhuǎn)基因；基因型鑒定中圖分類號 R文獻(xiàn)標(biāo)志碼

4、 ABreeding of calpastatin gene overexpression and identification in Balb/C mice YU Yong, LI *Ming-hui, LIU Gui-jian, LI Bing-yu, ZOU Y un-zeng, CHEN Rui-zhenLaboratory of cardiovascular disease research institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, ChinaAbstractObjective ： To est

5、ablish methods for the breeding of calpastatin (CAST ) gene overexpression mice on Balb/C background and to investigate the application of alkaline lysis solution extracted genomic DNA in genotyping. Methods：Tg-C57BL/6-CAST +/- male mice+/- were backcrossed to Balb/C wild type female mice. In the fi

6、lial generations, CAST heterozygous male mice were backcrossed to Balb/C wild type female mice for more than 10 generations to remove C57BL/6 genetic background. Then, Balb/C-CAST -/- mice from the same brood were infected with coxsakievirus ( CVB3 ) to establish the mouse model of acute viral myoca

7、rditis.Genomic DNA was isolated from filial generation mice tails. Then CAST gene fragment was amplified by PCR. Results： The reproduction of the filial generations with different phenotypes(CAST +/-, CAST -/- ) is basically in accordance with Mondels Genetics Law. To remove C57BL/6 genetic backgrou

8、nd,CAST +/- heterozygous male mice should be backcrossed to Balb/C-/-wild type female mice for at least 10 generations. the Mouse model of VMC with Balb/C-CAST mice was established. The agarose electrophoresis showed that the molecular weight of PCR products were consisted with that of objective gen

9、e fragments. Conclusions： Calpastatin gene overexpression transgenic mice on Balb/C background is a comparatively ideal experimental animal to study the interaction between calpain and CAST in the context of viral myocarditis and other diseases.The method of DNA extraction in our study can isolate g

10、enomic DNA from large number of tissue samples of mice which providing a solution for genotyping.Key Words calpain； calpastatin； coxsakie virus group B type3（ CVB3 ） ; transgenic； genotyping Calpain 是一類主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶，激活后能通過有限酶切作用切割其底物，參與包括心血管疾病在內(nèi)的多種病理過程1-2。 研究3發(fā)現(xiàn)，Calpain在急性病毒性心肌炎（VMC ）發(fā)病過程中

11、被激活，介導(dǎo)柯薩奇B3 病毒（ CVB3 ）直接感染導(dǎo)致的心肌損傷作用。在許多炎癥性疾病模型的研究中，calpain 抑制劑表現(xiàn)出相應(yīng)的器官保護(hù)作用4。Calpastatin（ CAST）是 Calpain 的內(nèi)源性抑制劑，在心肌細(xì)胞內(nèi)兩者共定位，CAST 負(fù)向調(diào)控 Calpain 的活性，在體內(nèi)及體外過表達(dá)CAST 均可抑制Calpain 活性 5。轉(zhuǎn)基因動物模型常用于致病機(jī)制的探討及治療藥物的篩選，2011 年本研究室從加拿大西安大略大學(xué)病理生理學(xué)系彭天慶教授實驗室引進(jìn)了C57BL/6-CAST 基因過表達(dá)小鼠。因此，本研究以C57BL/6-CAST 基因過表達(dá)小鼠為基礎(chǔ)，嘗試建立穩(wěn)定的B

12、alb/C 小鼠遺傳背景CAST 基因過表達(dá)模型，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 主要材料及試劑實驗動物：C57BL/6-CAST +/-雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠雌、雄各1 只（5 6周齡）引進(jìn)于加拿大西安大略大學(xué)病理生理學(xué)系彭天慶教授實驗室，Balb/C 雌性野生型小鼠 （ 5 6 周齡） 購于復(fù)旦大學(xué)實驗動物部。試劑：2 PCR Master mix、 DNA Marker 購自 ThermoFisher 公司； PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠cTnI ELISA 試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司；CVB3（ Nancy 株， 由本實驗室保存復(fù)制）， 在 Vero 細(xì)

13、胞上復(fù)制?；蚪M DNA 裂解液配制：溶液A 成分為 25 mmol/L NaOH ， 0.2 mmol/L EDTA ；溶液 B 成分為 40 mmol/L Tris-HCl ， pH 值 5.0。小鼠組織基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。儀器： Thermo Fisher 公司高速臺式冷凍離心機(jī)；美國 Bio-Rad 公司 PCR儀、電泳槽、ChemiDoc? MP System 全能型成像系統(tǒng)；Eppendorf 紫外分光光度計。1.2 Balb/C 遺傳背景CAST 基因過表達(dá)小鼠的培育轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實驗動物部，光照及黑暗每隔12 h 循環(huán)，恒溫恒濕，

14、自由飲水進(jìn)食，自然交配。采用1 雄配 3 雌合籠的方法將雄性C57BL/6-CAST +/-小鼠與雌性Balb/C 近交系小鼠交配繁殖，F(xiàn)1 代子鼠在3周齡時與親代分離，提取鼠尾DNA ，用 PCR 方法鑒定出CAST 基因表達(dá)陽性小鼠，將雄性+/CAST 基因表達(dá)陽性小鼠與雌性Balb/C 近交系小鼠交配繁殖，獲得的F2 代雄性CAST +/-小Balb/C 近交系小鼠交配繁殖，連續(xù)交配直至可獲得遺傳背景穩(wěn)定的Balb/C-CAST 基因過表達(dá)小鼠，具體繁殖方案見圖1 。100%C57BL/60%Balb/CF150%C57BL/650%Balb/CN225%C57BL6/75%Balb/C

15、N100.1%C57BL6/99.9%Balb/CC57-CAST+/-CAST+/-CAST+/-CAST+/-CAST+/-CAST+/-Balb/CBalb/CBalb/C圖 1 Balb/C 遺傳背景CAST 基因過表達(dá)小鼠繁育方法1.3 堿性裂解液提取子代小鼠基因組DNA 及 PCR 鑒定 子代小鼠斷奶打耳號標(biāo)記后剪取1 2 mm 鼠尾，采用堿性裂解液法提取DNA，放入 1.5 mL EP 管，加入50 L 溶液A，于金屬浴上95孵育40 min， 室溫放置1.5 h， 再加入 50 L 溶液B， 充分震蕩混合，4 10 000 g離心 5 min，放4冰箱待用?；蚪MDNA 提取試

16、劑盒(北京天根)操作按說明書進(jìn)行?；蚪M DNA 擴(kuò)增： CAST 基因引物上游，5 -GTT GGC TTA GGC TGC TTT TCG T- 3；下游，5 -CCA GAC TCC GTG ACA CCC CTT-3 。目的基因片段長度為518 bp。 PCR 反應(yīng)體系：2 PCR Master Mix 12.5L，Primer( 25 mol/L ) 0.4L，DEPC-H2O 10.1L， cDNA 2L，總體積 25 L。 PCR 反應(yīng)條件：(1)預(yù)變性 94，3 min；(2)變性 94，30 s；(3)退火 60,30s； (4)延伸72，60 s； 重復(fù)步驟(2) (4)4

17、0 次循環(huán)； (5)最后延伸72，10 min； (6)4保存。60瓊脂糖凝膠電泳:用 0.5 TBE 緩沖液配置1%瓊脂糖凝膠，加熱融化，待溫度降至左右加入溴化乙啶（EB） 1 2 L（ 10 mg/mL ） ，混勻后鋪板，室溫放置30 min，待凝膠完全凝固后放入電泳槽，25 L PCR 樣本+5 L 6Loading Buffer ，上樣量30 L，電壓90 V，電泳 40 min，使用Bio-Rad 凝膠成像儀進(jìn)行凝膠掃描。Eppendorf 紫外分光光度計上檢測各樣本濃度在600 800 ng/mL， D260/280值在1.6 1.8。1.4 Balb/C-CAST -/-小鼠急性

18、心肌炎模型的建立以第 10 代同窩3 4 周齡、基因型鑒定為 CAST -/-的雄性小鼠腹腔注射100 TCID50 的 CVB3 0.1 mL/只，對照組腹腔注射Eagle 液0.1 mL/只， 正常條件飼養(yǎng)7 d 時斷頸處死，取心肌組織在10%中性甲醛中固定，H-E 染色觀察心肌組織病變程度；取小鼠外周血分離血清，ELISA 法檢測外周血中cTnI 含量。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x s 表示，兩樣本比較采用 t 檢驗，組間顯著性檢驗采用單因數(shù)方差分析，所有實驗重復(fù)3 次，檢驗水準(zhǔn)（） =0.05。2 結(jié) 果2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠大體觀察結(jié)果（圖2）表

19、明：經(jīng)過連續(xù)10 代以上雜交，得到遺傳背景穩(wěn)定的 Balb/C-CAST 基因過表達(dá)小鼠。圖 2 不同遺傳背景CAST 基因過表達(dá)小鼠A: C57BL/6-CAST 基因過表達(dá)小鼠;B: 雜交 F1 代 CAST 基因過表達(dá)小鼠;C: 雜交第 10 代 Balb/C-CAST 基因過表達(dá)小鼠2.2 堿性裂解液法及商品化試劑盒提取基因組DNA 效果的比較結(jié)果（圖3）表明：堿性裂解液提取DNA 效果與市售DNA 提取試劑盒完全符合。圖 3 雜交第 10 代 Balb/C-CAST 小鼠不同基因型PCR 鑒定結(jié)果1 5 ： 堿 性 裂 解 液 法 提 取 DNA ； 6 ： DNA marker;

20、711: 試 劑 盒 提 取 DNA. 1,7: 同 一 標(biāo) 本( Balb/C-CAST +/-) ； 2,8：同一標(biāo)本(Balb/C-CAST +/-) ； 3,9：同一標(biāo)本(Balb/C-CAST -/-) ； 4,10：同一標(biāo)本(Balb/C-CAST -/-) ； 5， 11：同一標(biāo)本(Balb/C-CAST +/-)2.3 Balb/C-CAST -/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型的建立同窩基因型鑒定為CAST-/-的雄性小鼠感染CVB3 進(jìn)行急性心肌炎造模7 d 后，可見心臟表面有點狀、片狀白斑(圖4) 。H-E 染色(圖5)顯示：心肌組織可見明顯病灶和炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排

21、列紊亂，局部存在鈣化現(xiàn)象。CVB3 模型組小鼠外周血cTnI 定量檢測，與注射Eagle s液對照組小鼠相比，外周血 cTnI 濃度顯著上升(P0.01 ) 。（ ng/ml）123456平均數(shù)SDP值對照組0.020.010.650.330.230.160.2330.24CVB3 組8.336.521.233.429.256.485.8723.030.00106圖 4 VMC 造模小鼠心臟外觀A: 正常對照小鼠心臟；B: CVB3 感染 7 d 小鼠心臟5 VMC 造模小鼠心肌組織H-E 染色A C:正常對照小鼠心肌組織；D F: VMC 小鼠心肌組織.Original magnificat

22、ion: 10(A,D); 100(B,E); 400(C,F)3 討 論Calpain是一類主要存在于胞質(zhì)中的鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶，與許多疾病相關(guān)6，是許多疾病的潛在分子治療靶點7-8。前期研究3已證實，Calpain在急性病毒性心肌炎( VMC )發(fā)病過程中被激活，介導(dǎo)CVB3 直接感染導(dǎo)致的心肌損傷作用。CAST是 Calpain的內(nèi)源性抑制劑，通過其C末端的I、 IV結(jié)構(gòu)域結(jié)合Calpain抑制其活性，同時通過其特定的氨基酸序列調(diào)節(jié)Ca2+通道的啟閉，調(diào)控Calpain活性 9。Balb/C小鼠是公認(rèn)的病毒性心肌炎模型動物，而C57BL/6-CAST 基因過表達(dá)小鼠因其C57B

23、L/6 小鼠遺傳背景導(dǎo)致的免疫偏離不適合用作病毒性心肌炎模型小鼠10。 因此， 需要用C57BL/6-CAST 基因過表達(dá)小鼠與Balb/C小鼠進(jìn)行雜交，以去除C57BL/6小鼠遺傳背景。一般認(rèn)為，通過至少10代的回交，同類系基本可以去除C57BL/6 小鼠遺傳背景，8代及以上的代數(shù)種群小鼠，可基本認(rèn)為遺傳背景一致11。本研究以第11代同窩3周齡基因型鑒定為Balb/C-CAST -/-的雄性小鼠感染CVB3 制作 VMC 小鼠模型，CVB3 模型組 5只小鼠造模均成功，提示該類系小鼠已排除C57BL/6 小鼠遺傳背景影響，完全可用于VMC 小鼠模型制作。本研究采用堿性裂解液裂解法提取DNA

24、，所用試劑均為常規(guī)化學(xué)試劑，不需用蛋白酶K ， DNA 得率較高、成本低廉；不使用酚、氯仿等試劑，不污染環(huán)境；不需要勻漿操作，避免交叉污染；鑒定結(jié)果與市售商品化DNA 提取及基因型鑒定試劑盒相比，完全一致。此外， 使用堿裂解法提取DNA 能節(jié)約大量實驗經(jīng)費，尤其是進(jìn)行大批量小鼠的基因型鑒定時。本研究室自2012 年起使用該方法對轉(zhuǎn)基因/基因敲除小鼠進(jìn)行基因型鑒定，取得了穩(wěn)定、可靠的鑒定結(jié)果，證明其是一種高效、低成本的解決方案，完全能夠滿足后續(xù)實驗的需要。綜上所述，本研究成功建立Balb/C-CAST 基因過表達(dá)小鼠，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；采用的堿性裂解液提取基因組DNA 具有高效、可靠、低成本

25、的特點，值得推廣。參考文獻(xiàn)1Ono Y, Sorimachi H. Calpains:an elaborate proteolytic systemJ. Biochim Biophys Acta, 2012,1824(1):224-236.2Inserte J, Hernando V, Garcia-Dorado D. Contribution of calpains to myocardial ischaemia/reperfusion injuryJ.Cardiovasc Res, 2012, 96(1):23-31.3 李明輝 ,汪云開,虞勇,陳瑞珍,楊英珍.急性病毒性心肌炎小鼠心肌中C

26、alpain mRNA 表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究.中國分子心臟病學(xué)雜志, 2009, 9(5):277-281.4Li X, Li Y, Shan L, et al. Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates myocardial dysfunction during endotoxaemiaJ. Cardiovasc Res, 2009, 83(1):72-79.5 Campbell RL, Davies PL. Structure-function relationships in c