實驗2－柱層析技術(shù)分離純化菠蘿蛋白酶粗提液

1、一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康? 1 學(xué)習(xí)和理解蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化的學(xué)習(xí)和理解蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化的各種各種柱層析技術(shù)柱層析技術(shù)的原理和實驗技的原理和實驗技能。能。2 2 理解和掌握理解和掌握葡聚糖（葡聚糖（SephadexGSephadexG- - 7575）柱層析技術(shù)）柱層析技術(shù)原理和實驗操作原理和實驗操作步驟。步驟。二、實驗原理二、實驗原理 凝膠層析（凝膠層析（Gel chromatographyGel chromatography）是利用是利用具有一定孔徑的具有一定孔徑的多孔凝膠多孔凝膠作為固定相，把作為固定相，把分子大小不同的物質(zhì)分離開來的一種層析分子大小不同的物質(zhì)分離開來的一種層析技術(shù)技術(shù).

2、. 凝膠過濾凝膠過濾（Gel filtrationGel filtration） 分子篩分子篩（Molecular sieve Molecular sieve chromatographychromatography） 凝膠滲透層析凝膠滲透層析（Gel permeation Gel permeation chromatographychromatography） 經(jīng)常使用的凝膠：經(jīng)常使用的凝膠： 葡聚糖凝膠（商品名為葡聚糖凝膠（商品名為SephadexSephadex） 聚丙烯酰胺凝膠（生物膠、聚丙烯酰胺凝膠（生物膠、Bio Gel PBio Gel P） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Sephar

3、oseSepharose gel gel）及由烷基葡聚）及由烷基葡聚 糖與甲叉丙烯酰胺共價交聯(lián)制成的糖與甲叉丙烯酰胺共價交聯(lián)制成的SephacrylSephacryl 等。等。 葡聚糖凝膠用得最多葡聚糖凝膠用得最多，它是，它是-1-1，6 6葡聚糖與葡聚糖與1-1-氯氯-2-2，3-3-環(huán)氧丙烷反應(yīng)交聯(lián)而成的環(huán)氧丙烷反應(yīng)交聯(lián)而成的 ，有不同，有不同型號的凝膠。型號的凝膠。 凝膠的吸水能力與凝膠的交聯(lián)度關(guān)系密切：凝膠的吸水能力與凝膠的交聯(lián)度關(guān)系密切： G表示交聯(lián)度，交聯(lián)度大的，凝膠孔徑小，吸表示交聯(lián)度，交聯(lián)度大的，凝膠孔徑小，吸 水量少，膨脹程度小。水量少，膨脹程度小。 凝膠孔徑的大小可以用其吸

4、水量的大小來表凝膠孔徑的大小可以用其吸水量的大小來表 示，常以示，常以G-10至至G-200號碼標(biāo)記。號碼標(biāo)記。 G后面的數(shù)字是凝膠吸水量（后面的數(shù)字是凝膠吸水量（ml/g干膠）乘以干膠）乘以 10所得的值。所得的值。 G-25：表示吸水量為表示吸水量為2.5ml/g干膠。干膠。 G100：表示該顆粒膠實際吸水值的表示該顆粒膠實際吸水值的10倍。倍。 G值愈小，交聯(lián)度愈大，因此吸水量也愈小。值愈小，交聯(lián)度愈大，因此吸水量也愈小。 Sephadex G100 吸水值大，但機械性能不好，吸水值大，但機械性能不好，較較 軟。軟。 Sephadex G50 吸水值小，但機械性能好，能吸水值小，但機械性

5、能好，能承受較大靜水壓。快流速。承受較大靜水壓?？炝魉?。 G值小，交聯(lián)度越大值小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，顆粒內(nèi)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，顆粒內(nèi)孔徑越小，吸水值小，孔徑越小，吸水值小，分級范圍窄，分級范圍窄，機械性能機械性能好。好。 G值大值大，交聯(lián)度越小交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，顆粒內(nèi)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，顆粒內(nèi)孔徑越大，吸水值大，孔徑越大，吸水值大，分級范圍寬，分級范圍寬，機械性能機械性能不好。不好。 Sephadex G10 - Sephadex G50: 通常用于分離通常用于分離1.5KD30KD的肽或的肽或小分子蛋小分子蛋白質(zhì)或脫鹽等。白質(zhì)或脫鹽等。 Sephadex G75 - Sephadex

6、 G200 : 分離分離分子量大分子量大于于5KD800KD的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì). 吸水量大，預(yù)處理膨脹所需時間較長，膨脹度吸水量大，預(yù)處理膨脹所需時間較長，膨脹度較大，因此稱為軟膠較大，因此稱為軟膠. 進(jìn)行柱層析冼脫時，柱床上端洗脫液的壓力保進(jìn)行柱層析冼脫時，柱床上端洗脫液的壓力保持恒定。持恒定。 凝膠層析原理凝膠層析原理 當(dāng)分子大小不同的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)以凝膠當(dāng)分子大小不同的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)以凝膠為固定相的層析柱時，為固定相的層析柱時， 比凝膠網(wǎng)孔比凝膠網(wǎng)孔大大的分子的分子不能進(jìn)入網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，只能不能進(jìn)入網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，只能排阻在凝膠之外，隨流動相在凝膠顆粒之間移動排阻在凝膠之外，隨流動相在凝膠顆粒之

7、間移動并最并最先流出先流出柱外；柱外； 比網(wǎng)孔比網(wǎng)孔小小的分子的分子能完全滲入孔內(nèi)最能完全滲入孔內(nèi)最后流出后流出柱外；柱外； 若分子量完全介于上述二者之間若分子量完全介于上述二者之間，則居中流出。，則居中流出。 從流出次序的不同即可達(dá)到分離純化蛋白從流出次序的不同即可達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。質(zhì)的目的。 小顆粒（小分子量）小顆粒（小分子量）進(jìn)入進(jìn)入gelgel的孔內(nèi)擴散，的孔內(nèi)擴散，流動速度慢，流動速度慢，后冼脫后冼脫； 大顆粒（大分子量）大顆粒（大分子量）不進(jìn)入不進(jìn)入gelgel的孔內(nèi)，滑的孔內(nèi)，滑動速度快，動速度快，先洗脫先洗脫。 三實驗材料三實驗材料實驗一所提的菠蘿蛋白酶粗提樣品實驗一所

8、提的菠蘿蛋白酶粗提樣品四實驗設(shè)備四實驗設(shè)備電子天平電子天平層析柱層析柱(2 x 20cm)(2 x 20cm)恒流泵恒流泵自動部分收集器自動部分收集器水浴鍋水浴鍋751-751-紫外分光光度計紫外分光光度計五玻璃器皿五玻璃器皿燒杯、膠管、吸管、夾子、鐵架臺、收集器的指燒杯、膠管、吸管、夾子、鐵架臺、收集器的指管、滴管，移液器等。管、滴管，移液器等。六實驗試劑六實驗試劑1、Sephadex G75（葡聚糖（葡聚糖G75）2、柱層析試劑、柱層析試劑 0.1moL/L PBS 2000mL1000 mL pH7.83、測酶活試劑：、測酶活試劑： （1）1%酪蛋白酪蛋白300mL： 用用0.1 mol

9、/L PBS pH7.8配配, 50水浴溶解。水浴溶解。 （2）激活劑激活劑 300mL： 含有含有20 mmol/L半胱氨酸半胱氨酸-鹽酸鹽和鹽酸鹽和1mmol/L EDTA-Na，用，用0.1 mol/L PBS pH7.8溶解，最后定容至溶解，最后定容至300mL。 （3 3）5%TCA5%TCA（三氯乙酸）（三氯乙酸）400mL400mL 4 4、酶液濃縮、酶液濃縮 （1 1）透析袋處理（用于濃縮）：）透析袋處理（用于濃縮）：新買新買的透析袋，裁剪成所需大小，用加洗衣粉的透析袋，裁剪成所需大小，用加洗衣粉或洗潔劑的自來水浸泡煮沸或洗潔劑的自來水浸泡煮沸10 min，鑷子，鑷子取出，用自

10、來水漂洗干凈，再用取出，用自來水漂洗干凈，再用dH2O漂洗漂洗1-2次，即可使用。次，即可使用。 （2 2）PEGPEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）60006000 七實驗步驟七實驗步驟（一）凝膠的預(yù)處理（一）凝膠的預(yù)處理1、凝膠（干粉）必須使用前在過量的溶劑中充分凝膠（干粉）必須使用前在過量的溶劑中充分吸脹，一般多為吸脹，一般多為dH2O、鹽溶液或、鹽溶液或 buffer，放置，放置室溫較長時間，使之充分吸脹。室溫較長時間，使之充分吸脹。 浸泡時間：根據(jù)交聯(lián)度不同而異，浸泡時間：根據(jù)交聯(lián)度不同而異，G50需需6h。 注意：注意：不要過分?jǐn)嚢?，以防止顆粒破碎不要過分?jǐn)嚢瑁苑乐诡w粒破碎，防止破，防

11、止破壞膠鏈結(jié)構(gòu)。壞膠鏈結(jié)構(gòu)。2、用傾瀉法出去混雜的小顆粒，重復(fù)、用傾瀉法出去混雜的小顆粒，重復(fù)3到到4次，以次，以防止粉末等物質(zhì)塞住膠孔。防止粉末等物質(zhì)塞住膠孔。3、加熱、加熱100溶脹，不同交聯(lián)度，時間不同，溶脹，不同交聯(lián)度，時間不同，G50需需2h，可殺死細(xì)菌和霉菌，且可排除凝膠內(nèi)包藏可殺死細(xì)菌和霉菌，且可排除凝膠內(nèi)包藏的氣泡。的氣泡。（二）柱的選擇（二）柱的選擇 1 1、為了防止分離受管壁效應(yīng)的影響，一般應(yīng)選用內(nèi)徑、為了防止分離受管壁效應(yīng)的影響，一般應(yīng)選用內(nèi)徑大于大于2.5cm2.5cm的柱（本實驗為的柱（本實驗為2cm2cm）或最好用直徑為）或最好用直徑為23cm23cm的柱。的柱。

12、管壁效應(yīng)：管壁效應(yīng)：在柱管中心部位組分移動較慢，而在管在柱管中心部位組分移動較慢，而在管壁周圍移動較快，因而影響分離效果。壁周圍移動較快，因而影響分離效果。2 2、柱的長度通常為柱的長度通常為5050100cm100cm：柱高柱高50cm 50cm 適用于脫鹽，適用于脫鹽，柱高柱高100cm100cm，蛋白質(zhì)分級分離較好。，蛋白質(zhì)分級分離較好。 一般說，柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗一般說，柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，且樣品稀釋度大，易擴散。反而效果不好時間長，且樣品稀釋度大，易擴散。反而效果不好 （三）安裝設(shè)備（三）安裝設(shè)備 柱子、恒流泵、自動部分收集器，并柱子、恒流泵

13、、自動部分收集器，并調(diào)好流速。調(diào)好流速。 主要看老師操作演示。主要看老師操作演示。（四）裝柱（四）裝柱（最重要的操作步驟最重要的操作步驟）1 1、首先垂直的安裝好玻璃層析柱，、首先垂直的安裝好玻璃層析柱， 出口的膠出口的膠管管不能留有氣泡不能留有氣泡。2 2、在柱中、在柱中先裝先裝10mL10mL的水的水，將已溶脹的凝膠沿著，將已溶脹的凝膠沿著玻璃棒小心的徐徐的灌入柱中，讓其自然下玻璃棒小心的徐徐的灌入柱中，讓其自然下降以免出現(xiàn)不均勻的凝膠帶。降以免出現(xiàn)不均勻的凝膠帶。3 3、裝柱時需打開下口，并調(diào)節(jié)適當(dāng)流速。裝柱時需打開下口，并調(diào)節(jié)適當(dāng)流速。4 4、注意事項、注意事項 （1 1）凝膠不能太稀

14、或太粘稠，若太稀分幾次）凝膠不能太稀或太粘稠，若太稀分幾次裝上的凝膠床往往不均勻，過于粘稠，會裝上的凝膠床往往不均勻，過于粘稠，會吸留氣泡。吸留氣泡。（2 2）凝膠柱床必須裝得十分均勻凝膠柱床必須裝得十分均勻。（3 3）在任何時候不要使液面低于凝膠表面，）在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則凝膠變干，出現(xiàn)裂層，且有可能混入否則凝膠變干，出現(xiàn)裂層，且有可能混入氣泡，氣泡，對蛋白分離不利。對蛋白分離不利。（五）加樣（五）加樣1 1、凝膠沉集后，、凝膠沉集后，調(diào)整流速調(diào)整流速，加一濾紙或尼龍濾，加一濾紙或尼龍濾布于凝膠面上，以防止加樣時，凝膠被沖起或布于凝膠面上，以防止加樣時，凝膠被沖起或不平。不

15、平。3、接上恒流泵（注意：恒流泵速度不能太高或、接上恒流泵（注意：恒流泵速度不能太高或全速），繼續(xù)用蒸餾水洗柱子，約全速），繼續(xù)用蒸餾水洗柱子，約0.51 h。4、調(diào)整恒流泵流速，使每管、調(diào)整恒流泵流速，使每管4 mL，每，每6 min收收集集1管（管（4 mL/管管/6 min）。）。5、調(diào)整好部分收集器，使其轉(zhuǎn)動的速度為、調(diào)整好部分收集器，使其轉(zhuǎn)動的速度為1管管/6 min。 6 6、加樣量加樣量為層析柱體積的為層析柱體積的1.2%1.2%，如，如100ml100ml體積，加樣體積，加樣12ml12ml，2 220cm20cm的柱的柱體積為體積為62.8 ml62.8 ml，裝柱體積，裝柱

16、體積50 ml50 ml，加加樣樣0.50.51.2ml1.2ml。7 7、用、用吸管取吸管取1 11.2ml1.2ml粗蛋白溶液，小心的將粗蛋白溶液，小心的將樣品加到凝膠床的表面濾紙上。樣品加到凝膠床的表面濾紙上。!注意：注意： （1 1）加樣時勿將床面凝膠沖起）加樣時勿將床面凝膠沖起 （2 2）不要沿壁管加樣（因為樣品易從柱壁與凝）不要沿壁管加樣（因為樣品易從柱壁與凝膠床之間漏下）膠床之間漏下） （3 3）打開出口管，待樣品恰好進(jìn)入柱后，用少）打開出口管，待樣品恰好進(jìn)入柱后，用少量量PBS洗一下凝膠表面和接觸過樣品的柱壁，洗一下凝膠表面和接觸過樣品的柱壁，待完全流入床后，再加待完全流入床后

17、，再加PBS進(jìn)行洗脫。進(jìn)行洗脫。（六）洗脫（六）洗脫 （1 1）洗脫液：）洗脫液：0.1moL/L PBS pH7.8 （2 2）調(diào)節(jié)流速：）調(diào)節(jié)流速： 每管每管4ml4ml，每，每6min6min收集收集1 1管管 即即4ml/4ml/管，管，6min/6min/管管 共收集共收集20202525管。管。（七）（七） 實驗檢測和酶活測定實驗檢測和酶活測定（1）用紫外分光光度計測各管的）用紫外分光光度計測各管的A280（2）A280數(shù)值高（大于數(shù)值高（大于0.2）的管進(jìn)行酶活測）的管進(jìn)行酶活測定定A275（3）把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混）把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干

18、凈的透析袋，在一起，到入干凈的透析袋，用聚乙二醇用聚乙二醇6000吸水，直到酶液濃縮到吸水，直到酶液濃縮到1ml，用吸管把，用吸管把酶取出，酶取出，-10保存，保存，留到下次電泳實驗用。留到下次電泳實驗用?？偟膶嶒灹鞒炭偟膶嶒灹鞒萄b柱（裝柱時裝柱（裝柱時, ,柱內(nèi)留柱內(nèi)留10 mL10 mL 的水的水, ,倒入倒入SephadexSephadex G75 G75，要，要求求SephadexSephadex G75 G75均勻，大約均勻，大約1.5h1.5h） 調(diào)節(jié)流速調(diào)節(jié)流速4mL/4mL/管管/6/6分（注意：恒流泵的轉(zhuǎn)速不能太高）分（注意：恒流泵的轉(zhuǎn)速不能太高）加樣加樣: :約約1.2mL

19、1.2mL收集管（收集收集管（收集20202525管）管）用紫外分光光度計測各管的用紫外分光光度計測各管的A280（蛋白含量測定）（蛋白含量測定）A280數(shù)值高的管進(jìn)行酶活測定：按下表進(jìn)行，其中，以一數(shù)值高的管進(jìn)行酶活測定：按下表進(jìn)行，其中，以一管作為對照。管作為對照。把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干凈把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干凈的透析袋，的透析袋，用用PEG6000吸水，直到酶液濃縮到吸水，直到酶液濃縮到1 mL，用，用吸管把酶取出，吸管把酶取出， -10保存，留到下次電泳實驗用。保存，留到下次電泳實驗用。 把把Sephadex G75倒到燒杯中倒到燒杯

20、中 清洗干凈層析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管清洗干凈層析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管試劑對照(調(diào)零)試管1TCA(mL)1%酪蛋白 (mL)酶液(mL)激活劑(mL)31010910.10.937 水浴 10minTCA(mL) 3靜置1015min ，濾紙過濾A275nmA275nm 酶活單位(U) 酶活單位：酶活單位： 在上述條件下在上述條件下(37, 酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)10min)，每，每10min增加增加0.01個光吸收值的酶量為一個酶活力個光吸收值的酶量為一個酶活力單位（單位（U）。）。實驗結(jié)實驗結(jié)果果試試 管管1 12 23 34 45 56 67 78 89 91010A280nm A280nm A275nm A275nm 酶活酶活(U) (U) 111112121313141415151616171718181919202