xiap原核重組蛋白的表達和純化ppt課件

1、xiap原核重組蛋白的表達和純化報告人：周光現(xiàn)日期：09-06-01 簡介 資料和方法 結果 討論簡介X連鎖凋亡抑制蛋白X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP是一類細胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白，它特異性的抑制caspase活性，經(jīng)過多種途徑抑制細胞凋亡?？梢宰鳛槟[瘤檢測的一個目的也可以作為治療和預防腫瘤的一個靶標?？梢宰鳛槟[瘤檢測的一個目的也可以作為治療和預防腫瘤的一個靶標。 本文經(jīng)過pET151-XIAP載體在大腸桿菌中表達，Ni-NTA親和層析柱純化。表達和純化優(yōu)化初始OD600 0.6、溫度30、IPTG濃度0.5ug/ml、誘導時間4h時。純

2、化過程中，添加兩個不同pH的洗脫液pH 5.4、pH 4.9。 XIAP構造和功能表示圖資料和方法 資料 實驗用質(zhì)粒pET151-XIAP、菌種JMY109、Rosseta為實驗室保管 主要試劑 誘導培育：LB培育基、氨芐、異丙基-硫代半乳糖苷IPTG 蛋白純化：尿素、Tris、NaH2PO4 SDS-PAGE電泳：30%丙烯酰胺、 1.5mol/L Tris(pH8.8)、10%SDS、 10%過硫酸銨 、TEMED 、1mol/L Tris(pH6.8)原核載體構建pET151轉(zhuǎn)化Rossate小型誘導在最正確誘導條件下大型誘導200mlIPTG濃度誘導溫度誘導時間細胞破碎蛋白純化蛋白純化

3、條件優(yōu)化SDS-PAGE檢測實驗技術道路圖 pET151原核載體構建 表達載體轉(zhuǎn)化 1.感受態(tài)細胞制備CaCl2 2.轉(zhuǎn)化 誘導條件優(yōu)化IPTG濃度、時間、OD、誘導溫度 蛋白純化條件優(yōu)化 1.Ni-NTA柱規(guī)范方法洗脫 2.透析結果：一、表達優(yōu)化1.初始OD值的影響 從圖中可以看出，當OD為0.6時，目的蛋白表達最多。而且隨著OD值的繼續(xù)增大，蛋白表達量有下降，但是不明顯。闡明在溫度37，IPTG濃度5ug/ml，誘導時間4h的情況下，誘導前的OD值在0.6-1.0范圍內(nèi)時，目的蛋白表達量都較高。2.誘導溫度 OD值為0.6,IPTG濃度為IPTG濃度5ug/ml，誘導時間4h的情況下，30

4、誘導的結果明顯好于其他溫度，遺憾的是目的蛋白一直在沉淀中，沒有成為可溶性蛋白，即使是在低溫下誘導。3. IPTG濃度 溫度30，初始OD600 0.6，誘導時間4h的情況下。IPTG濃度低于0.5ug/ml是目的蛋白表達量較少，而高于0.5ug/ml時，目的蛋白表達量高，而且隨著IPTG濃度的增大，對目的蛋白表達量的影響不大。可以初步確定IPTG濃度為0.5ug/ml是較為經(jīng)濟和高效的誘導濃度。同樣目的蛋白依然存在于沉淀中。4.誘導時間 溫度30，初始OD600 0.6，IPTG濃度0.5ug/ml時，設計不同的誘導時間梯度可以看出，誘導時間在4-8h時，目的蛋白表達較高，而且差別不大。當誘導

5、時間到達10h時，蛋白表達量下降。這能夠是由于菌種中某種酶降解該蛋白的緣故?？偨Y： 經(jīng)過以上4個實驗，可以初步確定，溫度30，初始OD600 0.6，IPTG濃度0.5ug/ml，誘導時間4h,是誘導XIAP原核重組蛋白表達的最經(jīng)濟最有效地條件。二、蛋白純化條件優(yōu)化Ni-NTA柱規(guī)范方法洗脫跑膠檢測M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脫液pH4.5:洗脫液pHNi-NTA柱改良方法洗脫后SDS-PAGE膠檢測M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脫液pH4.5:洗脫液pHNi-NTA柱改良方法洗脫后SDS-PAGE膠檢測添加了兩個PHM

6、：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脫液pH4.5:洗脫液pH 5.4、4.9洗脫液pH 總結：在添加兩個不同pH洗脫液后，發(fā)如今洗脫液pH為4.9、4.5時洗脫下來的目的蛋白較規(guī)范方法多。但是純化后的蛋白依然有兩條雜帶，這有一條能夠是His標簽蛋白，另外有能夠是由于與目的蛋白等電點很接近，沒法用不同梯度的pH將其分別。討論：1.原核表達操作簡單、生長周期短，能在短時間內(nèi)表達大量目的蛋白。但不能進展內(nèi)含子的自我剪接，表達的蛋白質(zhì)不能進展翻譯后加工，不能進展正確折疊，使表達產(chǎn)物量少，活性低。2.原核表達中應該留意的事項：1選擇適宜的載體 2選擇適宜的菌種3選擇標簽4選

7、擇適宜的誘導條件3.怎樣提高可溶蛋白的含量4.原核生物表達的外源蛋白純化結論： 1. 原核重組蛋白的最正確誘導條件為：初始OD600 0.6、溫度30、IPTG濃度0.5ug/ml、誘導時間4h。 2. 在純化過程中，添加兩個不同pH的洗脫液，可以顯著添加純化后目的蛋白的含量。Thanks！Caspases 存在于胞質(zhì)溶膠中的構造上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點是特異地斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。 可以高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，這種切割只發(fā)生在少數(shù)通常只需1個位點上，主要是在構造域間的位點上，切割的結果或是活化某種蛋白，或使某種蛋白失活，但從不完全降解一種蛋白質(zhì)。Caspases現(xiàn)已確定至少存在11種caspase： 這些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及能夠還有caspase 4被以為不直接參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導，它們主要參與白介素前體的活化；而caspase 2，caspase 8，caspase 9和caspase 10參與細胞凋亡的起始；參與細胞凋亡執(zhí)行的那么是caspase 3，caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP，DFF-45DNA fragmentati