微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量試驗(yàn)報告記錄

1、微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)報告記錄作者:日期:微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)報告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1 . .學(xué)習(xí)微量凱氏定氮法的原理2 2.掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)（未知樣品的消化、蒸儲、滴定及其含氮量的計算等）二、實(shí)驗(yàn)原理凱氏定氮法常用于測定天然有機(jī)物（如蛋白質(zhì)，核酸及氨基酸等）的含氮量。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫被氧化成二氧化碳和水，而氮則變成氨并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸鏤。此過程稱為“消化”。此過程進(jìn)行的相對較為緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高溶液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。氧化劑過氧化氫也能加速反應(yīng)。消化過程：2NH3H2SO4（

2、NH4）2SO4含氮有機(jī)物H2SO4，CO2SO2H2ONH3蒸儲：在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱3蒸儲，即可釋放出氨氣反應(yīng)方程式如下：(NH4)2SO42NaOH、Na2SO42NH40H吸收與滴定：蒸儲所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止(即滴定至藍(lán)紫色)，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)(相當(dāng)于待測物中氨的當(dāng)量數(shù))計算出待測物中的氮量。NH3H3BO3，NH4H2BO3NH4H2BO3HCLNH4CLH3BO3三、實(shí)驗(yàn)試劑、材料和器材實(shí)驗(yàn)材料：食用面粉。實(shí)驗(yàn)試劑：濃硫酸、3030 窗氧化鈉溶液、克氏催化劑、2

3、%2%口酸、指示劑、0.01MHCL0.01MHCL實(shí)驗(yàn)器材：凱氏燒瓶、電爐、凱氏定氮蒸儲裝置、錐形瓶、100ml100ml容量瓶、酸式滴定管。四、操作步驟1 1 .消化(1)(1)準(zhǔn)確稱取 1 1 克食用面粉，用稱量紙卷好小心送入至 5050 毫升的凱氏燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上；(2)(2)向另一燒瓶加入 1ml1ml 水作空白對照；在每個燒瓶內(nèi)加入硫酸鉀一硫酸銅混合物(克氏催化劑)少許， 濃硫酸 10ml,10ml,小瓷片兩粒，搖勻；(3)(3)將燒瓶約 6060 度角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚內(nèi)的電爐上消化；(4)(4)在消化開始時，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸；

4、(5)(5)待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出 SO2SO2 白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色為止；(6)(6)消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸儲水 10ml10ml(注意慢加，邊加邊搖)；(7)(7)冷卻后將瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)入 100ml100ml 的容量瓶中，并用蒸儲水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。2 2.蒸儲(1)(1)蒸儲器洗凈后，開放水龍頭 P3,P3,使水進(jìn)入 A A 室，水放至 A A 室球部 2/32/3 處即可。(2)(2)取 3 3 個 50ml50ml 的錐形瓶，分別加入 10ml10ml 硼酸(內(nèi)加有混合指本劑)。用

5、表面皿復(fù)蓋備用。(3)(3)加樣1用移液管吸取 2ml2ml 消化液，小心地由漏斗 D D 傾入 B B 室；2取一個盛有硼酸的錐形瓶，置于 M M 管下，使管口恰好接觸硼酸溶液， 用量筒從漏斗 D D 加入 3030 窗氧化鈉 5ml,5ml,隨即將 P4P4 夾緊,并往漏斗加入少量蒸儲水封閉。(4)(4)蒸儲用酒精燈加熱，維持火力恒定，沸騰不可高于 Y Y 管口以免 A A 室溶液從 Y Y 管倒吸，待第一滴蒸儲液從冷凝柱 F F 頂端滴下時起，繼續(xù)蒸儲 5 5 分鐘；然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸 2 2 分鐘，最后用蒸儲水洗導(dǎo)管外壁，蒸儲完畢，取下錐形瓶準(zhǔn)備滴定。(5)(5)空白

6、蒸儲用移液管分別吸取 2ml2ml 蒸儲水按上述操作步驟進(jìn)行蒸儲。儀器的洗滌：3 3 .滴定(1)(1)蒸儲完畢，用微量酸式滴定管，以 0.01mol/L0.01mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定錐瓶內(nèi)溶液，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榈仙蚧疑?，即為終點(diǎn)（2 2）記錄所用鹽酸的量。4 4 . .計算心口的人日。八（AB）M0.0100M14彳”樣品的總氮含反（克氮）=父100C1000若測定的樣品含氮量部分只是蛋白質(zhì)則：樣品的總蛋白含量（克蛋白）= =0 0. .01000100 1414 6 6叫100C1000式中：A A 為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B B 為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C

7、C 為稱量樣品的克數(shù)：0.01000.0100 為鹽酸的當(dāng)量濃度（實(shí)際上,此項(xiàng)應(yīng)按實(shí)驗(yàn)中使用鹽酸的實(shí)際濃度填寫）；1414 為氮的原子量；6.256.25 為常數(shù)（1 1 毫升 0.1N0.1N 鹽酸相當(dāng)于 0.140.14 毫克氮）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號稱量樣品（g g）滴定樣品用去的鹽酸（mlml）滴定空白用去的鹽酸（mlml）1 11 115.215.20.120.122 21 115.415.4滴定樣品用去鹽酸平均值=15.215.42=15.3ml）心口的 MNMN 冬口/古 N。八（AB）M0.0200M14“八樣品的總氮含反（克氮）=父100C1000=0.43%若測定的樣品含氮量部

8、分只是蛋白質(zhì)，則：樣品的總蛋白含量（克蛋白）=5X100、C1000=2.66%式中：A A 為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C C 為稱量樣品的克數(shù)：0.01000.0100 為鹽酸的當(dāng)量濃度（實(shí)際上，此項(xiàng)應(yīng)按實(shí)驗(yàn)中使用鹽酸的實(shí)際濃度填寫）；1414 為氮的原子量；6.256.25 為常數(shù)（1 1 毫升 0.1N0.1N 鹽酸相當(dāng)于 0.140.14 毫克氮）。六、注意事項(xiàng)1 1.本法適用于 0.05-3.0mg0.05-3.0mg 氮，樣品中含氮量過高時，則應(yīng)減少取樣量或?qū)右合♂尅? 2 .勿使樣品粘于燒瓶頸部。放置液體樣品時，需將吸管插至燒瓶底部再放樣

9、：如固體樣品，可將樣品卷在紙內(nèi)，平插入燒瓶底部，然后再將燒瓶直起，紙卷內(nèi)的樣品即完全放在燒瓶底部。3 3.蒸儲完畢，先將蒸儲出口離開液面，繼續(xù)蒸儲 1min,1min,將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后移開酒精燈，絕不能先滅燈，否則吸收液將發(fā)生倒吸。4 4 .硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過 4040C,C,否則氨吸收減弱， 造成損失， 可置于冷水浴中?；旌现甘緞┰趬A性溶液中呈蘭綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。七、思考題1 1 .寫出一下各步的化學(xué)反應(yīng)方程式：蛋白質(zhì)的消化、氨的蒸儲、氨的滴定。答：蛋白質(zhì)的消化：含氮有機(jī)物.H2s04CO2SO2H2ONH3氨的蒸儲

10、：NH42SO42NaOHNa2s042NH40HNH40H，H2ONH3NH3H3BO3NH4H2BO3氨的滴定：NH4H2BO3HCLNH4CLH3BO34234332 2 . .指出本測定方法產(chǎn)生誤差的原因答：在消化過程中，消化時間，催化劑，濃硫酸都要一樣，一定要消化完全。在消化過程中蛋白質(zhì)附著在凱氏燒瓶壁上沒有被消化9也會影響最終的濃度蒸儲過程中，蒸儲出來的液體量一定要相同，因?yàn)椴灰粯拥恼魞λ詈蠼Y(jié)果不一樣，在蒸儲的過程中一開始要加入買的蒸儲水，蒸儲過程中加入的是自己用自來水蒸儲的。蒸儲中出氣孔的管子一定要插入硼酸液面以下，蒸儲過程中保證冷凝水一直在流動。蒸儲過程中定氮儀各連接處應(yīng)使

11、玻璃對玻璃外套橡皮管絕對不能漏氣。加入消化液后加氫氧化鈉應(yīng)小心緩慢加入，開關(guān)甲不能常開，加完后加水液封。滴定過程中應(yīng)一滴一滴加入，滴定速度過快容易滴定過量。滴定過程中仰視刻度結(jié)果偏小，俯視刻度線結(jié)果偏大。蒸儲裝置的洗滌過程中洗滌不干凈也會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)方法適合測量 0.05-3.0mg0.05-3.0mg 氮，含量過大應(yīng)該減少取樣量或者樣液稀釋。否則會產(chǎn)生誤差。3 3 . .消化過程中產(chǎn)生何種有毒氣體？如何判斷消化終點(diǎn)？答：可能會產(chǎn)生一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫。消化終點(diǎn)判定：在消化開始時，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出S SQ Q 白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)

12、火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色為止。八、討論經(jīng)過本次利用微量凱氏定氮法進(jìn)行面粉中蛋白質(zhì)的粗測定實(shí)驗(yàn)，10使我較為熟練的掌握了凱氏定氮蒸儲裝置的使用，并且了解了其工作原理，這對于以后的學(xué)習(xí)是有很大幫助的。經(jīng)查閱資料得，面粉中蛋白質(zhì)的含量大概在 9%9%左右，本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為 2.66%,2.66%,總體來講，本次試驗(yàn)較為失敗，沒能夠粗略地測量出了面粉中蛋白質(zhì)的含量。經(jīng)過分析后，得出幾點(diǎn)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，如下：1 1 .在消化過程中，消化時間，催化劑，濃硫酸都要一樣，一定要消化完全。在消化過程中蛋白質(zhì)附著在凱氏燒瓶壁上沒有被消化也會影響最終的濃度；2 2 . .蒸儲過程中，蒸儲出來的液體量

13、一定要相同，因?yàn)椴灰粯拥恼魞λ?，最后結(jié)果不一樣，在蒸儲的過程中一開始要加入買的蒸儲水，蒸儲過程中加入的是自己用自來水蒸儲的。蒸儲中出氣孔的管子一定要插入硼酸液面以下，蒸儲過程中保證冷凝水一直在流動。蒸儲過程中定氮儀各連接處應(yīng)使玻璃對玻璃外套橡皮管絕對不能漏氣。加入消化液后加氫氧化鈉應(yīng)小心緩慢加入，開關(guān)甲不能常開，加完后加水液封；3 3 . .滴定過程中應(yīng)一滴一滴加入，滴定速度過快容易滴定過量。滴定過程中仰視刻度結(jié)果偏小，俯視刻度線結(jié)果偏大；4 4. .蒸儲裝置的洗滌過程中洗滌不干凈也會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)；5 5 . .本實(shí)驗(yàn)方法適合測量 0.05-3.0mg0.05-3.0mg 氮， 含量過大應(yīng)該減少取樣