5+SDS-PAGE電泳技術(shù)

1、SDS-PAGE 電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量 SDS-PAGE凝膠的制備 SDS-PAGE電泳 凝膠染色和脫色 蛋白質(zhì)分子量的測定實驗?zāi)康募耙?掌握SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)的原理 掌握SDS-PAGE電泳的操作方法 掌握SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理電泳及基本原理 電泳（electrophoresis）： 帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動 影響因素：泳動的速度與電場強(qiáng)度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，與顆粒大小和介質(zhì)粘度成反比 常用電泳種類有：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）、雙向

2、電泳等等 瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計了世界上第一臺自由電泳儀，建立了移界電泳法，成功地將血清蛋白分成白蛋白、a1-、a2-、b-和g-球蛋白五種主要成分，為人們了解血清奠定了基礎(chǔ)，并由此獲得1948年諾貝爾獎聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide, Acr）和交聯(lián)劑NN-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比例在聚合劑過硫酸銨(ammonium persulfate, APS)和催化劑TEMED的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 優(yōu)點： 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)（改變單體和交聯(lián)劑的濃度），因此可根據(jù)被分離物的分子量范

3、圍選擇合適的濃度 靈敏度可達(dá)1mg 分辨率高，可分離大小相差僅3%的多肽 無電滲作用，只要純度高，操作條件一致，樣品分離重復(fù)性好 凝膠透明，有彈性，機(jī)械效能好 化學(xué)性能穩(wěn)定，與分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng); 對pH和溫度變化較穩(wěn)定聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分類 根據(jù)有無濃縮效應(yīng)： 連續(xù)-不連續(xù) 根據(jù)電泳體系是否含有蛋白變性劑，如巰基乙醇等： 變性-非變性SDS-PAGE電泳原理分子篩效應(yīng): 分子大小和形狀電荷效應(yīng)：大部分的蛋白質(zhì)在pH8.3電泳緩沖液的條件下帶有負(fù)電荷，表面負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)遷移快，反之則慢 （強(qiáng)陰離子去污劑SDS使蛋白結(jié)構(gòu)松散，并帶上大量負(fù)電荷，導(dǎo)致本身電荷差別消失，因此SDS-P

4、AGE分離蛋白主要依賴分子大小，而非電荷或形狀）不連續(xù)系統(tǒng)具有對樣品的濃縮效應(yīng) pH值的不連續(xù) 電位梯度的不連續(xù) 凝膠濃度的不連續(xù) 電壓的不連續(xù) pH 6.8 80 V 濃縮膠（積層膠）4-6 %SDS-PAGE電泳pH 8.8 130 V 分離膠配膠液dH2O Tris-HClAcr/BisSDSAPS TEMED7-15 %電泳液dH2OTris-HClGlycine+ +(pH 8.3) 不連續(xù)電泳系統(tǒng)： 緩沖液pH、電位梯度、凝膠濃度及電壓 分子量的對數(shù)與其在凝膠中的相對遷移率呈正比關(guān)系濃縮膠的作用： 濃縮膠中的氯離子遷移速度快，形成移動界面的先導(dǎo)邊界;電泳液(pH8.3) 中的甘氨酸

5、分子遷移速度慢，形成尾隨邊界; 在移動界面的兩邊界之間是電導(dǎo)較低而電位梯度較陡的區(qū)域。蛋白樣品夾在前導(dǎo)和尾隨離子界面之間，在電場的作用下邊濃縮邊向正極泳動，在分離膠上沿積聚。分離膠的作用：分子篩 在pH8.8分離膠中，甘氨酸離子化，遷移率超過蛋白質(zhì)，穿過堆積的多肽并緊隨氯離子之后泳動。SDS多肽復(fù)合物從電位梯度界面中解脫開來，在電位和pH值均勻的區(qū)段泳動，依分子量大小得到分離Acr/Bis %線性分離范圍 kDa1512107.5510-4312-6020-8036-9457-212分離膠(7-15 %, pH 8.8)濃縮膠(4-6 %, pH 6.8)加樣加電場，樣品濃縮在界面上電泳結(jié)束+

6、 +封膠條梳子平，凹玻板斜楔板電泳槽DYCZ-24D型垂直板電泳槽配膠步驟配膠步驟安裝玻璃板并放置膠條u 加少許水到凹槽內(nèi)測試兩層玻板間隙是否漏液吸取少量水加到分離膠液面上標(biāo)記上下層膠的界面：梳子下0.5-1cm處傾去覆蓋液，用濾紙將殘余液吸去，注意勿破壞凝膠面配制濃縮膠溶液，加過TEMED后，立刻灌膠室溫放置30min ，或37放置10-20分鐘室溫放置30-45min，或37放置20-30分鐘將玻璃板固定到電泳架上（凹槽面朝外）立刻插入梳子，平的一側(cè)貼高玻板，注意避免氣泡配制分離膠溶液，加過TEMED后混勻，立刻用移液槍吸取溶液沿凹槽加入間隙，直到液面抵達(dá)劃線處傾去水分聚丙烯酰胺凝膠的配制

7、貯液 分離膠（10%） 濃縮膠（5%）ddH2O 3.3 ml 2.77 ml30% Acr/Bis 4.0 ml 0.83 ml1.5M Tris pH8.8 2.5 ml /0.5M Tris pH6.8 / 1.26 ml10% SDS 100 ml 50 ml10% APS 100 ml 50 mlTEMED 10 ml 10 mlTotal volume 10 ml 5 ml20-37 30-45 min20-37 20-30 min 按表中的順序加入各溶液 每加入一種溶液，立刻混勻 TEMED加入之后聚合反應(yīng)開始，應(yīng)立即混勻并灌膠 聚丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，應(yīng)帶手套操作！取下玻

8、璃板并抽出膠條將電泳架放入電泳槽內(nèi)，在內(nèi)外槽 分別加入電泳緩沖液直至沒過上樣孔, 緩慢取出梳子上樣：marker、待測樣品，加入梳孔中加上電泳槽蓋，并連接電泳儀（注意正負(fù)極）樣品藍(lán)色前沿（溴酚蘭）進(jìn)入分離膠后,調(diào)電壓為130V溴酚蘭抵達(dá)凝膠底部，關(guān)閉電源，并取出玻板在玻板和凝膠間注入水，小心剝離凝膠標(biāo)記分離膠方向，標(biāo)記溴酚藍(lán)前沿位置在電壓為80V的條件下開始電泳電泳步驟電泳步驟將帶膠玻璃板轉(zhuǎn)面再次固定到電泳架上（凹槽面朝內(nèi)）上樣：1.蛋白A 10 ml2.蛋白B 10 ml3.蛋白C 10 ml4.蛋白D 10 ml5. 蛋白E 10 ml6. Marker 20 ml 考馬斯亮藍(lán)染色過夜、脫色2-3h，測量距離并照相測量并計算分子量：1. 測量 溴酚藍(lán)條帶 距 分離膠上沿 的距離2. 測量 Marker 各個條帶 距 分離膠上沿 的距離3. 測量 待測樣品A、B、C、D 主要蛋白條帶 距 分離膠上沿 的距離4. 根據(jù)下列公式計算 蛋白相對遷移率 mRmR =蛋白質(zhì)條帶遷移距離溴酚藍(lán)條帶遷移距離5. 根據(jù) Marker的各個已知蛋白相對遷移率（mR, 橫坐標(biāo)）和分子量 Mr. 大小的對數(shù)值（IgMr, 縱坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線6. 根據(jù)待測樣品主要蛋白條帶的相對遷移率，計算其分子量思 考 SDS-PAGE的用途除了測定