實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及培養(yǎng)條件

1、2022-4-2912.1 實(shí)驗(yàn)室布局實(shí)驗(yàn)室布局 v 在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。2022-4-292v實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模：實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模： 1. 以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會限制生產(chǎn)影響效率。會限制生產(chǎn)影響效率。 2.在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，

2、應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)序來設(shè)計(jì) 避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。v 植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。養(yǎng)條件。2022-4-293 標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室包括：標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室包括： 洗滌室（準(zhǔn)備室） 配置室 滅菌室 接種室 培養(yǎng)室 觀察室等 2022-4-294v1. 準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室 器具的洗滌、干燥、消毒。 v2. 配置室配置室 進(jìn)

3、行藥品的保存、配置、消毒、分裝 等。 v3. 滅菌室滅菌室 培養(yǎng)基及使用器具的消毒與滅菌v4. 接種室接種室 進(jìn)行材料的接種，內(nèi)置超凈工作臺或v 接種箱。外設(shè)緩沖間,放置拖鞋、v 工作服、工作帽等。 v5. 培養(yǎng)室培養(yǎng)室 將接種的材料進(jìn)行無菌培養(yǎng)生長的 場所 v6. 細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行培養(yǎng)材料的組織學(xué)、 細(xì)胞學(xué)、觀察照相等 2022-4-295v。準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室緩沖間緩沖間(過渡室過渡室)接種室接種室(外設(shè)緩沖間外設(shè)緩沖間)培養(yǎng)室培養(yǎng)室2022-4-296 （一）儀器設(shè)備（一）儀器設(shè)備 1.超凈工作臺超凈工作臺(cleaning table): 用于培養(yǎng)物的無菌操作（由鼓風(fēng)機(jī)

4、、濾板、操作臺、紫外燈和照明燈組成）。 超凈臺分水平式和垂直式二種型號 2. 高壓滅菌鍋（手提式、立式或臥式）高壓滅菌鍋（手提式、立式或臥式） 用于進(jìn)行培養(yǎng)基和器械用具的滅菌。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。 2022-4-2972022-4-298高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋手提式滅菌鍋手提式滅菌鍋超凈工作臺超凈工作臺2022-4-299 3.恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱: 用于植物材料的培養(yǎng)，其用于植物材料的培養(yǎng)，其內(nèi)有溫度感受器，控制箱內(nèi)溫度到所調(diào)指標(biāo)。內(nèi)有溫度感受器，控制箱內(nèi)溫度到所調(diào)指標(biāo)。生化培養(yǎng)箱還配有光照裝置。生化培養(yǎng)箱還配有光照裝置。 4. 電子分析天平和托盤天平：電子分析天平和托盤天

5、平： 電子分析天電子分析天平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品精確度為激素等微量藥品精確度為00001g；托盤；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，其精天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，其精確度為確度為0.1g。天平應(yīng)放置在干燥、不受震動(dòng)。天平應(yīng)放置在干燥、不受震動(dòng)的天平操作臺上。的天平操作臺上。2022-4-2910電子天秤電子天秤培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱2022-4-2911 5. 酸度計(jì)：酸度計(jì)： 組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pH值的準(zhǔn)確度是十分重要的，應(yīng)當(dāng)使用酸度計(jì)，若無酸度計(jì)，也可使用pH試紙進(jìn)行粗測。首次使用酸度計(jì)前，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位，然后固定

6、。測量pH值時(shí)，待測液必須充分?jǐn)嚢杈鶆?。如果培養(yǎng)基溫度過高，測量時(shí)要調(diào)整pH值計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。 6. 烘箱：烘箱： 用于干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測定干物重。用于干燥需保持80-100；進(jìn)行干熱滅菌需保持150，達(dá)1-3h；若測定干物重，則溫度應(yīng)控制在80烘干至完全干燥為止。2022-4-29122022-4-29132022-4-2914v 7. 培養(yǎng)架：培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)材料。v 8. 紫外線殺菌燈紫外線殺菌燈：殺菌。v 9. 不銹鋼托盤：不銹鋼托盤：v 10. 定時(shí)器：定時(shí)器：控制光照時(shí)間。v 11.普通冰箱：普通冰箱：主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化

7、學(xué)藥品以及植物材料等v 12. 大型工作臺大型工作臺: 其高度應(yīng)方便配制工作。v 13. 藥品柜藥品柜: 用于放置常用藥品。v 14. 解剖鏡：解剖鏡：種類較多，用于分離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。解剖鏡上帶有照相裝置，根據(jù)需要隨時(shí)對所需材料進(jìn)行攝影記錄。 2022-4-2915儀儀儀儀儀儀 器器器器器器 設(shè)設(shè)設(shè)設(shè)設(shè)設(shè) 備備備備備備 1鑷子類鑷子類(forceps) 常應(yīng)用醫(yī)療上的鑷子。 根據(jù)操作需要有各種類型 2剪刀類剪刀類(scissors) 可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。2022-4-2916 3. 解

8、剖刀解剖刀: 切割較小材料和分離莖尖分生組織時(shí)，可用解剖刀。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀態(tài)，否則切割時(shí)會造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。 4. 解剖針解剖針: 解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉，可以自制。 5. 接種盤接種盤:2022-4-2917儀儀儀儀儀儀 器器器器器器 設(shè)設(shè)設(shè)設(shè)設(shè)設(shè) 備備備備備備 組培瓶（玻璃）組培瓶（玻璃）-要求透光度好，能耐高壓高溫, 以試管、三角瓶、培 養(yǎng)皿等使用較多。v三角錐瓶三角錐瓶- 適用于各種培養(yǎng)（如固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、大規(guī)模培養(yǎng)或一般培養(yǎng)）。v培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿- 適于作單細(xì)胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和

9、無菌發(fā)芽。v試管試管- 適合于用少量培養(yǎng)基及試驗(yàn)各種不同配方時(shí)選 用。 2022-4-2918儀儀儀 器器器 設(shè)設(shè)設(shè) 備備備v 培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的200ml罐頭瓶 .v 培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點(diǎn) v 瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。污染。現(xiàn)在多采用聚丙烯塑料薄膜作為封

10、口 ,為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙 .也可采用專用的封口膜。2022-4-2919儀儀儀 器器器 設(shè)設(shè)設(shè) 備備備v 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿.v 包括各種型號的燒杯、量筒、移液管、試劑瓶、容量瓶、試管以及移液管架、酒精、玻璃棒、滴瓶等等。 2022-4-2920儀儀儀 器器器 設(shè)設(shè)設(shè) 備備備（四）其他（四）其他吸耳球、刷子、記號筆、定時(shí)鐘、手套、封口膜、衛(wèi)生藥棉、拖鞋、口罩、白大褂、濾紙、洗瓶2022-4-2921細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 該室用于對培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)等。主要設(shè)備：雙筒實(shí)體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。小型儀器設(shè)

11、備有：分注器、血球計(jì)數(shù)器、移液槍、過濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺式離心機(jī)等。2022-4-2922顯微鏡 2022-4-2923v玻璃器皿 培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等； 顯微鏡下觀察用的：細(xì)胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等。v微孔過濾器（細(xì)胞過濾器） ：激素用于滅菌。v一般用石棉濾膜2022-4-2924v2.3.1培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分v2.3.2培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類v2.3.3培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制2022-4-2925 v2.3.1.2 無機(jī)鹽類無機(jī)鹽類v（1）、大量元素）、大量元素v（2）、微量元素）、微量元素v2.3.1.3有機(jī)營養(yǎng)成分有機(jī)營養(yǎng)成分v（1）、碳源

12、）、碳源v（2）、維生素）、維生素v（3）、肌醇）、肌醇v（4）、氨基酸）、氨基酸2022-4-2926v（5）、天然復(fù)合物2022-4-2927v大量元素v微量元素v氨基酸和有機(jī)附加物v植物激素（植物生長調(diào)節(jié)劑）v維生素類v凝固劑2022-4-29282.3.1 培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分2.3.1.2 無機(jī)營養(yǎng)成分無機(jī)營養(yǎng)成分2022-4-2929序號序號化學(xué)式化學(xué)式化學(xué)名稱化學(xué)名稱用量用量mg/l1KNO3硝酸鉀硝酸鉀19002NH4NO3硝酸銨硝酸銨16503KH2PO4磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀 1704MgSO4.7H2O硫酸鎂硫酸鎂3705CaCL2.4H2O二氯化鈣二氯化鈣4402022-

13、4-2930序序號號化學(xué)名稱化學(xué)名稱化學(xué)式化學(xué)式用量用量（mg/l)1碘化鉀碘化鉀KI0.832硼酸硼酸H3BO36.23硫酸錳硫酸錳MnSO4.4H2O22.34硫酸鋅硫酸鋅ZnSO4.7H2O8.65鉬酸鈉鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O 0.256硫酸銅硫酸銅CuSO4.5H2O0.0257氯化鉀氯化鉀CoCL2.6H2O0.0252022-4-2931序號 化學(xué)名稱化學(xué)式用量(mg/l)1肌醇C6H12O6.2H2O1002甘氨酸NH2.CH2.COOH23鹽酸硫胺素C12H17CLN4OS.HCL0.14鹽酸吡哆醇C8H11O3N.HCL0.55煙酸NC5H4COOH0.52022-4

14、-29321、生長素類：、生長素類：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。等。2、細(xì)胞分裂素類：、細(xì)胞分裂素類：KT，6-BA，ZT等。等。3、赤霉素類；、赤霉素類；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等等4、脫落酸：、脫落酸：ABA5、乙烯、乙烯6、PH值：值：5.6-5.8 2022-4-29332.3.1.5 其他成分其他成分（1） 活性碳活性碳（3） 硝酸銀硝酸銀（4） 抗生素抗生素（5） 瓊脂及其他固化劑瓊脂及其他固化劑（6） pH（2） 滲透壓滲透壓2022-4-2934v按性質(zhì)分按性質(zhì)分v基本培養(yǎng)基 ：MS、MT（Murashige and Tucher）

15、Whitev完全培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 其它成分（激素、有機(jī)物質(zhì)等）2022-4-2935v按狀態(tài)分按狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基。v按作用分：誘導(dǎo)培養(yǎng)基；增值培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。v按培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基。2022-4-2936l培養(yǎng)液的配制與保存培養(yǎng)液的配制與保存l培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制2022-4-2937 成 分 用 量(g/l)每升培養(yǎng)基取用量(ml)母液母液1（大量元素）（大量元素）NH4NO3KNO3 MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液母液2（微量元素）（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCu

16、SO4.5H2OCoCL2.6H2O. 2022-4-2938 成 分用量（） 每升培養(yǎng)基用量（）母液母液3（鐵鹽）（鐵鹽）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O. 母液母液4（維生素、氨基酸）（維生素、氨基酸）肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸. 2022-4-2939（1） 一些組織培養(yǎng)基的成分一些組織培養(yǎng)基的成分成分 培養(yǎng)基（單位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6NH4No3 - - 1650 1200 - 720 -KNO3 80 - 1900 1900 2527.5 950 2830CaCl2. 2H2O - 75 440 440 1

17、50 - 166CaCl2 - - - - - 166 -MgSo4. 7H2O 750 250 370 370 246.5 185 185KH2PO4 - - 170 340 - 68 400(NH4)2SO4 - - - - 134 - 463Ca(NO3)2 . 4HO2 300 - - - - - -NaNo3 - 600 - - - - -NaSO4 200 - - - - - -NaH2PO4 . HO2 19 125 - - 150 - -2022-4-2940成分 培養(yǎng)基（單位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6NH4No3 - - 16

18、50 1200 - 720 -KNO3 80 - 1900 1900 2527.5 950 2830CaCl2. 2H2O - 75 440 440 150 - 166CaCl2 - - - - - 166 -MgSo4. 7H2O 750 250 370 370 246.5 185 185KH2PO4 - - 170 340 - 68 400(NH4)2SO4 - - - - 134 - 463Ca(NO3)2 . 4HO2 300 - - - - - -NaNo3 - 600 - - - - -NaSO4 200 - - - - - -NaH2PO4 . HO2 19 125 - - 15

19、0 - -一些組織培養(yǎng)基的成分一些組織培養(yǎng)基的成分2022-4-2941成分 培養(yǎng)基（單位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6KCL 65 750 - - - - -KI 0.75 0.01 0.83 - 0.75 - 0.8H3BO3 1.5 1 6.2 0.63 3 10 1.6MnSO4. 4H2O 5 0.1 22.3 2.23 - 25 4.4MnSO4.H2O - - - - 10 - -ZnSO4 . 7H2O 3 1 8.6 - 2 10 1.5Zn.Na2 . EDTA - - - 15 - - -Na2MoO4 . 2H2O - -

20、0.25 0.025 0.25 0.25 -MoO3 0.001 - - - - - -CuSO4 . 5H2O 0.01 0.03 0.025 0.0025 0.025 0.025 -CoCl2 . 6H2O - - 0.025 0.0025 0.025 - -AlCl3 - 0.03 - - - - -NiCl . 6H2O - 0.03 - - - - -FeCl3 . 6H2O - 1 - - - - -Fe2(SO)4 2.5 - - - - - -2022-4-2942成分 培養(yǎng)基（單位）：mg/L White Heller MS ER B5 Nitsch N6FeSO4 . 7H

21、2O - - 27.8 27.8 - 27.8 27.8 Na2 . EDTA . 2H2O - - 37.3 37.3 - 37.3 37.3NaFe . EDTA - - - - 28 - -有機(jī)物肌醇 - - 100 - 100 100 -煙酸 0.05 - 0.5 0.5 1 5 0.5鹽酸吡哆醇 0.01 - 0.5 0.5 1 0.5 1鹽酸硫胺素 0.01 - 0.1 0.5 10 0.5 1甘氨酸 3 - 2 2 - 2 2 葉酸 - - - - - 0.5 -生物素 - - - - - 0.05 -蔗糖 2% - 3% 4% 2% 2% 5%2022-4-29431、在潔凈的

22、不銹鋼鍋里放入、在潔凈的不銹鋼鍋里放入750ml蒸餾水，加入所需蒸餾水，加入所需要的瓊脂和糖，加熱熔化。要的瓊脂和糖，加熱熔化。2、加入儲備液、加入儲備液1，儲備液，儲備液2、各、各，按需要量加入植物激素。，按需要量加入植物激素。3、用蒸餾水定容到、用蒸餾水定容到1L。4、調(diào)、調(diào)H值。一般值。一般.5、培養(yǎng)基的分裝。、培養(yǎng)基的分裝。6、封口。、封口。7、培養(yǎng)基的高壓滅菌。、培養(yǎng)基的高壓滅菌。2022-4-2944v培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌v器皿試材和接種用具的滅菌器皿試材和接種用具的滅菌v培養(yǎng)室和接種室的滅菌培養(yǎng)室和接種室的滅菌v無菌操作無菌操作2022-4-2945即培養(yǎng)室和接種室的滅菌即培養(yǎng)室

23、和接種室的滅菌v室內(nèi)滅菌可用室內(nèi)滅菌可用 2新潔爾敏檫洗新潔爾敏檫洗v 75 酒精噴霧酒精噴霧v UV照射照射20分鐘分鐘2022-4-2946v滅菌方法有：滅菌方法有：v高溫高壓蒸汽滅菌高溫高壓蒸汽滅菌v121，1.1Kg/c，15-20芬，時(shí)間芬，時(shí)間過長，培養(yǎng)基成分易變性失效過長，培養(yǎng)基成分易變性失效v過濾滅菌過濾滅菌v在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類素類2022-4-2947v解剖刀、鑷子、剪刀等用具采用解剖刀、鑷子、剪刀等用具采用干熱滅菌法，用烘箱滅菌，干熱滅菌法，用烘箱滅菌，120時(shí)時(shí)1小時(shí)小時(shí)2022-4-2948v原則：原則：v充分滅菌，但不傷外

24、植體充分滅菌，但不傷外植體v不同的外植體，滅菌的要求也不不同的外植體，滅菌的要求也不一樣一樣2022-4-2949v75酒精酒精v表面殺菌，具有濕潤和殺菌作用，表面殺菌，具有濕潤和殺菌作用，浸浸30秒秒v氯化汞（升汞氯化汞（升汞）v常用濃度常用濃度0.1-0.2 ，處理，處理5-10分鐘，分鐘，有殘毒有殘毒v次氯酸鈉次氯酸鈉v濃度濃度2-10 ，是，是15-30芬，對植物芬，對植物無害無害2022-4-2950v即外植體的接種即外植體的接種v是將表面滅菌的植物材料切碎或是將表面滅菌的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部過程。整到無菌培養(yǎng)基上

25、的全部過程。整過接種過程均需無菌操作。過接種過程均需無菌操作。2022-4-2951 l采樣和表面滅菌采樣和表面滅菌外植體：就是第一次接種用的植物材料。外植體：就是第一次接種用的植物材料。任何植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)體系的建立，都必任何植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)體系的建立，都必須采用適宜的外植體。須采用適宜的外植體。l首次接種污染率的計(jì)算與對策首次接種污染率的計(jì)算與對策首次接種，小容器。多數(shù)量，盡量分散，互首次接種，小容器。多數(shù)量，盡量分散，互相隔離，效果最好。初次接種時(shí)以每管放一相隔離，效果最好。初次接種時(shí)以每管放一塊材料，采用大量小試管將塊材料，采用大量小試管將材料分散，是材料分散，是最有效的。最有效的

26、。2022-4-2952頂芽與腋芽的發(fā)育頂芽與腋芽的發(fā)育頂芽的培養(yǎng)又叫頂芽的培養(yǎng)又叫“莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)”，一般為，一般為0.10.5mm,有去除病毒有去除病毒的作用。如果是經(jīng)過病毒檢驗(yàn)的母株，最好是采用腋芽或帶葉腋的作用。如果是經(jīng)過病毒檢驗(yàn)的母株，最好是采用腋芽或帶葉腋的莖切段。的莖切段。不定芽的發(fā)育不定芽的發(fā)育不定芽的發(fā)生大多有一個(gè)從外植體上產(chǎn)生愈傷組織的階段。從觀不定芽的發(fā)生大多有一個(gè)從外植體上產(chǎn)生愈傷組織的階段。從觀賞園藝育苗的要求來說，應(yīng)盡快出苗，減少發(fā)生愈傷組織。由外賞園藝育苗的要求來說，應(yīng)盡快出苗，減少發(fā)生愈傷組織。由外植體產(chǎn)生不定芽經(jīng)歷兩個(gè)不同的生長時(shí)期，首先形成愈傷組織，植體產(chǎn)

27、生不定芽經(jīng)歷兩個(gè)不同的生長時(shí)期，首先形成愈傷組織，而后形成不定芽而后形成不定芽。體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育原球莖的發(fā)育原球莖的發(fā)育2022-4-2953 在第二階段培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、在第二階段培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，難以直接栽培，苗、胚狀體和原球莖等，難以直接栽培，這些培養(yǎng)的材料統(tǒng)稱為中間繁殖體。需要這些培養(yǎng)的材料統(tǒng)稱為中間繁殖體。需要進(jìn)一步增殖才能發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。一進(jìn)一步增殖才能發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。一般情況下，在般情況下，在46周內(nèi)增殖周內(nèi)增殖34倍是很容倍是很容易的。易的。2022-4-2954 一般認(rèn)為，礦物質(zhì)元素濃度較高時(shí)有一般認(rèn)為

28、，礦物質(zhì)元素濃度較高時(shí)有利于發(fā)展莖葉，而較低時(shí)有利于生根。所利于發(fā)展莖葉，而較低時(shí)有利于生根。所以多采用以多采用1/2或或1/4量的培養(yǎng)基，僅用很低的量的培養(yǎng)基，僅用很低的細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長（細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長（NAA）。）。一般一般24周即可生根。周即可生根。2022-4-2955v2.5.1 2.5.1 外植體的種類外植體的種類2022-4-2956v植株的生理植株的生理年齡越小年齡越小，外植體的，外植體的再生再生能力越強(qiáng)能力越強(qiáng)，培養(yǎng)成功的可能性越大。，培養(yǎng)成功的可能性越大。v同一植株上越同一植株上越 接近接近基部基部 的枝條，生的枝條，生理年齡理年齡 越小越小。20

29、22-4-2957v選取外植體的季節(jié)和時(shí)間，對培養(yǎng)材選取外植體的季節(jié)和時(shí)間，對培養(yǎng)材料的啟動(dòng)和培養(yǎng)至關(guān)重要。料的啟動(dòng)和培養(yǎng)至關(guān)重要。v一般在一般在生長季生長季春夏春夏2022-4-2958v外植體過大，不易滅菌，過小，不易成活。外植體過大，不易滅菌，過小，不易成活。v一般一般 0.51厘米厘米v脫毒培養(yǎng)脫毒培養(yǎng) 0.20.5厘米厘米2022-4-2959v 無菌的外植體材料是植物組織培養(yǎng)成功無菌的外植體材料是植物組織培養(yǎng)成功的重要前提與可靠保證，而消毒則是獲得的重要前提與可靠保證，而消毒則是獲得無菌外植體的有效方法。無菌外植體的有效方法。v 生長在開放環(huán)境條件下的植物，其表面生長在開放環(huán)境條件

30、下的植物，其表面附著各種微生物，取來的外植體需要經(jīng)過附著各種微生物，取來的外植體需要經(jīng)過仔細(xì)的表面滅菌處理。仔細(xì)的表面滅菌處理。2022-4-2960滅菌劑滅菌劑使用濃度使用濃度（）（）處理時(shí)間處理時(shí)間（min)從外植體從外植體去除難易去除難易程度程度滅菌效果滅菌效果次氯酸鈣次氯酸鈣次氯酸鈉次氯酸鈉過氧化氫過氧化氫氯化汞氯化汞乙醇乙醇溴水溴水硝酸銀硝酸銀抗菌素抗菌素漂白粉漂白粉 910 2 1012 0.11 7075 12 1 450mg/L 飽和溶飽和溶液液 530 530 515 215 0.22 210 530 3060 5-30 容易容易 容易容易 最易最易 較難較難 容易容易 容易

31、容易 較難較難 中等中等 易易 很好很好 很好很好 好好 最好最好 好好 很好很好 好好 比較好比較好 很好很好2022-4-29611 1、表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒、表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以減少組織的死亡。劑的濃度和處理時(shí)間，以減少組織的死亡。2 2、在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料、在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3 3次以上以次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。3 3、與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其、與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，

32、因?yàn)橄緞璧K植物細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)切除，因?yàn)橄緞璧K植物細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。的吸收。4 4、若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗、若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1 1小時(shí)以上或先小時(shí)以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織培養(yǎng)。培養(yǎng)。5 5、HgClHgCl2 2效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖洗至少洗至少5 5次。次。 消毒注意事項(xiàng)消毒注意事項(xiàng)2022-4-29622022-4-2963v（一）外植體的接種（一）外植體的接種 無菌操作無菌操作是將表面滅菌的植物材料切碎或

33、分離出是將表面滅菌的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部過程。整過接種過程均需無菌上的全部過程。整過接種過程均需無菌操作。操作。2022-4-2964外植體接種全過程外植體接種全過程酒精擦拭手酒精擦拭手外植體消毒外植體消毒浸泡浸泡5min器械消毒器械消毒酒精燈灼燒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿酒精擦拭培養(yǎng)皿2022-4-2965酒精擦拭酒精擦拭旋轉(zhuǎn)灼燒旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體取外植體接種接種蓋好瓶塞蓋好瓶塞修剪外植體修剪外植體2022-4-2966（二）外植體的培養(yǎng)（二）外植體的培養(yǎng)1、光照、光照2、溫度、溫度3、濕度、濕度4、氧氣、氧氣2022-

34、4-2967v 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、PH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都回影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。 2022-4-2968 溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)在2327之間進(jìn)行，一般采用252。 低于15時(shí)培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止， 高于35時(shí)對植物生長不利。 但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。白鶴非的最適溫度是20、月季是2527、番茄是28。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28為最好，在12以下，33以上形成率皆最低。2022-4-2969 不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度

35、不同：v 百合鱗片在30以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率比在25 以下的高。v 桃胚在2條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。v 用35處理草莓的莖尖分生組織3d，可得到無病毒苗。2022-4-2970 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一， 光強(qiáng) 主要表現(xiàn)在 光質(zhì) 光照時(shí)間 2022-4-29711、光照強(qiáng)度（、光照強(qiáng)度（light intensity) 光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植物體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。 光照強(qiáng)度：1000lx1500lxv黑暗條件：利于細(xì)胞、愈傷組織的誘導(dǎo)增殖v光照條件：利于器官的分化 百合原球

36、莖：黑暗下長出小球莖，關(guān)照下長出葉片2022-4-29722、光質(zhì)（、光質(zhì)（light wave) 光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，十幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。 楊樹：對愈傷組織生長紅光促進(jìn)藍(lán)光阻礙2022-4-2973培培培培培培 養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng) 條條條條條條 件件件件件件3、光周期（、光周期（light period) 試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 研究

37、表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，如葡萄，莖切段培養(yǎng)在短日照下形成根。 2022-4-2974 三、濕度（三、濕度（humidity) 濕度的影響包括培養(yǎng)容器內(nèi)濕度的保持和環(huán)境的濕度條件。 a. 容器內(nèi)濕度水平主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)當(dāng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。2022-4-2975v b. 環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70

38、%-80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長霉，造成污染。2022-4-2976培培培培培培 養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng) 條條條條條條 件件件件件件 四、滲透壓（四、滲透壓（penetrating pressure) 培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1-2個(gè)大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5-6個(gè)大氣壓植物生長就會完全停止，6個(gè)大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。 2022-4-2977培培培培培培

39、養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng) 條條條條條條 件件件件件件 五、五、PH值值 不同的植物對培養(yǎng)基最適PH值的要求也是不同的（見表），大多在56.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多數(shù)植物培養(yǎng)的需要。PH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。 2022-4-2978培培培培培培 養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng) 條條條條條條 件件件件件件不同植物的最適不同植物的最適PH值值 種類種類 最適最適PH值值 種類種類 最適最適PH值值 杜鵑 4.0 月季 5.8 越橘 4.5 胡蘿卜 6.0 石刁柏 6.0 蠶豆 5.5 桃 7.0 番茄、葡萄 5.72022-4-2979培培培培培培 養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng) 條條條條條條 件件件件

40、件件 以硝態(tài)氮硝態(tài)氮作氮源比以銨態(tài)氮銨態(tài)氮作氮源PH值較小一些。 一般來說PH值高于6.5時(shí)，培養(yǎng)基會變硬；低于5時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。因?yàn)楦邷販缇鷷档蚉H值（約0.2-0.3個(gè)PH值）因此在配制時(shí)常提高PH值0.2-0.3單位。 PH值大小調(diào)節(jié)可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl來調(diào)整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2單位，1ml的HCl可使PH值降低0.2單位。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?2022-4-2980培培培培培培 養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng)養(yǎng) 條條條條條條 件件件件件件 六、氣六、氣 體（體（gas) v 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料

41、。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。v 固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。v 培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。v 液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。 2022-4-2981v高溫高壓蒸汽滅菌：121，1.1Kg/c，15-20芬，時(shí)間過長，培養(yǎng)基成分易變性失效v過濾滅菌：在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類2022-4-2982主要內(nèi)容：v外植體的選擇v外植體的滅菌v外植體的接種和培養(yǎng)v外植體的成苗途徑v污染的原因及預(yù)防措施v外植體的褐變及其防止措施v培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施2022-4-29831、

42、外植體（Explant）：是指植物離體培養(yǎng)中的各種接種材料。包括植物體的各個(gè)器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。2、外植體選擇的要求v選擇優(yōu)良的種質(zhì)：材料的選擇要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加實(shí)用性。v選擇健壯的植株：選取發(fā)育正常的器官或組織，再生能力強(qiáng)，組培易成功。2022-4-2984v選擇合適的大?。焊鶕?jù)不同的植物而異，太大容易污染，太小，多形成愈傷組織甚至難于成活。一般在0.5-1.0cm之間。v選擇最適的時(shí)期：一般按植物生長的最適時(shí)期選取材料2022-4-29851、莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限）2、莖段（采用嫩莖的切段促進(jìn)腋芽萌發(fā)，

43、取材容易）3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產(chǎn)生植株，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）；4、花球和花蕾5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。 2022-4-2986 外植體的消毒是組培成功與否的第一關(guān)鍵步驟。v外植體的預(yù)處理：對外植體進(jìn)行修整,去掉不要的部分,在流水下沖洗干凈.v外植體的表面滅菌： 原則：充分滅菌，但不傷外植體；不同的外植體，滅菌的要求也不一樣2022-4-2987消毒劑使用濃/%清除難易消毒時(shí)/min滅菌效果次氯酸鈉2易5-30很好次氯酸鈣9-10易5-30很好漂白粉飽和溶液易5-30很好升汞0.1-1較難2-10最好酒精70-75易0.2-2好過氧化氫10-12最易

44、5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸銀1較難5-30好抗菌素4-50mg/L中30-60較好2022-4-2988v(1)莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗-75%酒精浸泡10-20min-無菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min-無菌水洗3-4次v（2）果實(shí)和種子的消毒：自來水沖洗10-30min-70%酒精漂洗-2%Naclo液浸10min-無菌水2-3次-取出種子培養(yǎng)v（3）根及地下部器官的消互毒：自來水沖洗-純酒精漂洗-升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min-無菌水洗3次v（4）花藥的消毒：自來水沖洗 70%酒精浸泡數(shù)秒鐘-無菌水洗2-3次-漂白

45、粉上清液浸10min-無菌水洗2-3次2022-4-2989v表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以減少組織的死亡。v在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。v與消毒劑接觸過的切面在轉(zhuǎn)移到無菌基質(zhì)前需將其切除，因?yàn)橄緞璧K植物細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。v若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1小時(shí)以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織培養(yǎng)。vHgCl2效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖洗至少5次。 2022-4-29902022-4-2991v是將表面滅菌的植物材料切碎或分離出器是將表面滅菌的植物

46、材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的官、組織、細(xì)胞，轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部過程。整過接種過程均需無菌操作。全部過程。整過接種過程均需無菌操作。2022-4-2992外植體接種全過程外植體接種全過程酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿2022-4-2993酒精擦拭旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體接種蓋好瓶塞修剪外植體2022-4-29942022-4-29952022-4-2996v1、光照v2、溫度v3、濕度v4、氧氣2022-4-2997v愈傷組織途徑：試管苗外植體愈傷組織根、芽芽芽 根如安祖花的組織培養(yǎng)就屬此類途徑2022-4-2998v器官發(fā)生途徑：外植體

47、經(jīng)誘導(dǎo)后直接形成根和芽，進(jìn)而形成完整的植物體。如莖尖培養(yǎng)。2022-4-2999v胚胎發(fā)育途徑：外植體胚狀體（原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期、子葉期）試管苗2022-4-29100v50年代末期，Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養(yǎng)基通過游離細(xì)胞的分化，獲得了胚狀體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在植物組織培養(yǎng)中具有胚狀體分化能力的種子植物已達(dá)117種，分屬43科，75屬 。v培養(yǎng)基的激素成分和氮源影響胚狀體的發(fā)生。有的植物可在無激素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體，如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養(yǎng)；有的植物需要生長素與細(xì)胞分裂素的一定比例誘導(dǎo)胚狀體，如油茶、酸棗、桃等。v在植物組織組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)胚狀體與誘

48、導(dǎo)芽相比較，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，一是數(shù)量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優(yōu)點(diǎn)，所以在育種工作及園藝工作中，可用胚狀體作為特定的優(yōu)良基因型個(gè)體的無性繁殖手段，同時(shí)在研究胚胎發(fā)育中也有很重要的理論意義。 2022-4-291011、污染：植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材 料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象2、污染的原因v一是病原菌污染（細(xì)菌、真菌）v二是外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌v三是操作人員未遵守操作規(guī)程。真菌污染2022-4-291022022-4-291032022-4-29104 組織培養(yǎng)中降低污染率是工廠化生產(chǎn)中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。預(yù)防措施有：v防止材料帶菌-選擇取材時(shí)間、材料與培養(yǎng)、外植體滅菌等措施；v防止用具帶菌-器皿與金屬器械滅菌；v操作室要處于無菌狀態(tài)-工作室、培養(yǎng)室滅菌等；v操作人員要按照操作程序進(jìn)行。v在培養(yǎng)基中加入抗菌素v分散接種2022-4-29105假設(shè)污染率為假設(shè)污染率