基因工程抗體PPT課件

1、單克隆抗體用于治療存在的問(wèn)題單克隆抗體用于治療存在的問(wèn)題 1 1、單克隆抗體的特異性、單克隆抗體的特異性 由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對(duì)腫瘤有嚴(yán)由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對(duì)腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對(duì)正常組織有交叉反應(yīng)；格特異性的單抗，對(duì)正常組織有交叉反應(yīng)； 2 2、異種抗體反應(yīng)、異種抗體反應(yīng) 鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)理想的抗體藥物的性質(zhì)理想的抗體藥物的性質(zhì)高特異性和高親和力（高特異性和高親和力（Kd=10Kd=108 810101010L/ML/M）對(duì)人沒(méi)有免疫原性，不誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗體的排對(duì)人沒(méi)有免疫原性，不誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)斥反應(yīng)游離

2、抗體不激活補(bǔ)體游離抗體不激活補(bǔ)體一旦結(jié)合到靶抗原上，能誘導(dǎo)效應(yīng)功能一旦結(jié)合到靶抗原上，能誘導(dǎo)效應(yīng)功能細(xì)胞系穩(wěn)定，適合在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞系穩(wěn)定，適合在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行 大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)抗體符合生物制品標(biāo)準(zhǔn)抗體符合生物制品標(biāo)準(zhǔn) 問(wèn)問(wèn) 題題異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果影響靶向性和效果靶部位攝取的量太低靶部位攝取的量太低效應(yīng)功能弱效應(yīng)功能弱在體內(nèi)被清除速度快在體內(nèi)被清除速度快 對(duì)對(duì) 策策 抗體人源化抗體人源化 改變抗體分子大小改變抗體分子大小 連接毒素、放射性連接毒素、放射性同位素、藥物同位素、藥物 抗體人源化抗體人源化抗體治療存在的問(wèn)題及對(duì)策抗體治療存

3、在的問(wèn)題及對(duì)策抗體藥物改造的方向抗體藥物改造的方向抗體人源化和人源抗體制備抗體人源化和人源抗體制備改變抗體分子大小改變抗體分子大小增強(qiáng)抗體親和力增強(qiáng)抗體親和力增強(qiáng)抗體效應(yīng)功能增強(qiáng)抗體效應(yīng)功能單克隆抗體人源化的改進(jìn)單克隆抗體人源化的改進(jìn)VHVH和和VLVL是抗原決定簇結(jié)是抗原決定簇結(jié)合位點(diǎn)合位點(diǎn) 高變區(qū)高變區(qū) HVRHVR 決定簇互補(bǔ)區(qū)決定簇互補(bǔ)區(qū)CDRCDR 骨架區(qū)骨架區(qū)FRFRCH1CH1和和CLCL：Ig Ig同種異型同種異型的遺傳標(biāo)志的遺傳標(biāo)志CH2CH2：補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)：補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn) CH3CH3：某些細(xì)胞某些細(xì)胞FcFc受體受體結(jié)合部位結(jié)合部位 從雜交瘤細(xì)胞分離出從雜交瘤細(xì)胞分離出功能

4、性功能性可變區(qū)基因，與人可變區(qū)基因，與人IgIg恒定區(qū)（決定免恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人- -鼠嵌合抗鼠嵌合抗體。體。 特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。抗原的能力。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體鏈嵌合載體L 鏈嵌合載體鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動(dòng)子啟動(dòng)子人人- -鼠嵌合抗體基因工程改造策略鼠嵌合抗體基因工

5、程改造策略 鼠鼠VH鼠鼠V L人人CL人人CH抗體分泌細(xì)胞抗體分泌細(xì)胞人人- -鼠嵌合基因工程抗體鼠嵌合基因工程抗體決定簇互補(bǔ)區(qū)決定簇互補(bǔ)區(qū)CDR序列序列 CDR序列序列 鼠單克隆抗體鼠單克隆抗體 人抗體人抗體人源化抗體人源化抗體鼠單克隆鼠單克隆V區(qū)人源化（區(qū)人源化（CDR移植）移植） 用基因工程方法，用基因工程方法，將抗體將抗體重鏈和輕鏈可重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過(guò)一個(gè)連接肽連接而成變區(qū)）通過(guò)一個(gè)連接肽連接而成AgAgAg雙特異性抗體的特點(diǎn)* 將免疫細(xì)胞錨著于腫瘤部位，提高腫瘤部位的效靶比。* 不受MHC的限制，直接激活免疫細(xì)胞的殺瘤機(jī)制。123提高抗體提高抗體效應(yīng)功能效應(yīng)功能抗體融合蛋白抗體融

6、合蛋白雙特異性抗體雙特異性抗體偶連細(xì)胞毒物質(zhì)偶連細(xì)胞毒物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞內(nèi)抗體提高抗體效應(yīng)功能提高抗體效應(yīng)功能偶連細(xì)胞毒物質(zhì)偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素連接放射性同位素( (131131I I、99m99mTcTc）連接植物或細(xì)菌毒素（連接植物或細(xì)菌毒素（ricinricin、PEPE4040）連接細(xì)胞毒性藥物（連接細(xì)胞毒性藥物（C1027C1027、柔紅霉素）柔紅霉素）免疫毒素免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:蓖麻毒素A,對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性作用CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2 免疫細(xì)胞因子免疫細(xì)胞因子

7、(Immunocytokine)(Immunocytokine) 阻斷靶蛋白的活性部位阻斷靶蛋白的活性部位 阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白蛋白相互作用阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白蛋白相互作用 干擾細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)干擾細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn) 促使靶蛋白降解促使靶蛋白降解今后抗體藥物發(fā)展的方向今后抗體藥物發(fā)展的方向?qū)ふ倚碌陌锌乖瓕ふ倚碌陌锌乖诳乖Ⅲw結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)抗體基于抗原立體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)抗體基于抗原基于抗原- -抗體相互作用設(shè)計(jì)小分子抗抗體相互作用設(shè)計(jì)小分子抗體模擬物體模擬物最理想的單克隆抗體最理想的單克隆抗體100%100%人源人源人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生2525年來(lái)的全人抗體的嘗試年來(lái)的全人抗體的嘗試 鼠骨髓瘤

8、不適合與人鼠骨髓瘤不適合與人B B細(xì)胞融合細(xì)胞融合穩(wěn)定性差穩(wěn)定性差抗體產(chǎn)量低抗體產(chǎn)量低 非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒 (EBV) (EBV) 保存抗體分保存抗體分泌細(xì)胞泌細(xì)胞細(xì)胞株不穩(wěn)定細(xì)胞株不穩(wěn)定抗體的產(chǎn)量低抗體的產(chǎn)量低不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞 很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體進(jìn)成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體進(jìn)入新的里程入新的里程用用 途：能穩(wěn)定的保持人途：能穩(wěn)定的保持人B B細(xì)胞分泌抗體的能力細(xì)胞分泌抗體的能力發(fā)明人：英國(guó)劍橋大學(xué)的發(fā)明人：英國(guó)劍橋大學(xué)的Dr KarpasDr Karpas教授教授意意

9、 義：義：1 1 在整體水平上研究人類產(chǎn)生抗體在整體水平上研究人類產(chǎn)生抗體 2 2 開創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究開創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究評(píng)評(píng) 價(jià)：價(jià)：1 1 諾貝爾獎(jiǎng)得主諾貝爾獎(jiǎng)得主Dr Milstein Dr Milstein 推薦發(fā)表在推薦發(fā)表在PNASPNAS 2 2 世界權(quán)威雜志世界權(quán)威雜志“科學(xué)科學(xué)”發(fā)表了新聞評(píng)述發(fā)表了新聞評(píng)述 3 3 劍橋大學(xué)開了新聞發(fā)布會(huì)劍橋大學(xué)開了新聞發(fā)布會(huì)未來(lái)單抗開發(fā)的完美方案未來(lái)單抗開發(fā)的完美方案從已知治療靶子生產(chǎn)高親和力全人從已知治療靶子生產(chǎn)高親和力全人抗體抗體全人抗體挑戰(zhàn)靶分子的篩選全人抗體挑戰(zhàn)靶分子的篩選開發(fā)未知抗原的治療用抗體開發(fā)未知抗原的治療用抗

10、體42已批準(zhǔn)上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段移植排斥大腸癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎癥性腸病、類風(fēng)濕CD317-1A血小板受體baCD20CD25TNF- OKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠單抗鼠單抗人鼠嵌合抗體人鼠嵌合抗體人鼠嵌合抗體人鼠嵌合抗體19861995(德國(guó))1994199719981998、199943適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSV F蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗體人源化抗體人源

11、化抗體人源化抗體化療藥物交聯(lián)物人源化抗體1997199819982000200144正在進(jìn)行臨床開發(fā)中的基因工程抗體適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段銀屑病IL8CD11a(IgG1)ICAM-3CD80CD2CD3ABXIL8Anti-CD11aICM3IDEC-114MEDI-507Smart anti-CD3Human(人源)Humanized (人源化)HumanizedPrimatizedHumanizedHumanized( IgG)，臨床前/45適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Complement(C5)TNF-TNF-TNF-CD4CD45G1.1D2E7

12、CDP870InfliximabIDEC-151MDX-CD4HumanizedHumanHumanized ( Fab)Chimeric(IgG1)(嵌合)Primatized (IgG1)Human (IgG)FDA批準(zhǔn)（1999）46適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段克羅恩病，節(jié)段性回腸炎潰瘍性結(jié)腸炎自身免疫病TNF-TNF-47CD4CD3InfliximabCDP571LDP02OrthoClone OKT4ASmart anti-CD3Chimeric(IgG1)Humanized(IgG4)HumanizedHumanized( IgG)HumanizedFDA批準(zhǔn)（1998

13、）/47適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段系統(tǒng)性紅斑狼瘡多發(fā)性硬化癥C5CD40LCD40LComplement(C5)VLA-4CD40L5G1.1AntovaIDEC-1315G1.1MEDI-507AntegrenIDEC-131HumanizedHumanized (IgG)HumanizedHumanized( IgG)Humanized( IgG)Humanized(繼續(xù))/48適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段自身免疫出血性病癥氣喘/變態(tài)反應(yīng)CD64(FcgR)IL-5IL-5IL-4IgECD23MDX-33SCH55700SB-240563SB-240683rhuMa

14、b-E25IDEC-152HumanHumanized (IgG4)HumanizedHumanizedHumanized( IgG1)Primmatized49適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段移植物抗宿主疾病同種異體移植排斥CD147CD2CD2CD3CD3ABX-CBLBTI-322MEDI507Orthoclone/OKT3SMAT anti-CD3Murine(IgM)(小鼠)Rat(IgG)(大鼠)Humanized Murine(Ig2a)Humanized/FDA批準(zhǔn)（1996）/50適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段同種異體移植排斥CD25CD252-integrin

15、CD4CD147ZenapaxSimulectLDP-01OKT4AABX-CBLHumanized (IgG1)Chimeric (IgG1)Humanized (IgG)Humanized (IgG)Murine(IgM)FDA批準(zhǔn)（1997）FDA批準(zhǔn)（1998）/ 51適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段同種異體移植排斥中風(fēng)青光眼抗凝血?jiǎng)〤D40LCD182-integrinTGF 2Fact AntovaAnti-LFA-1LDP-01CAT-152Corsevin MHumanized (IgG)Murine F(ab)2 Humanized (IgG)HumanChimeric

16、(Fab)/(繼續(xù))/ 52適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段冠狀血管成形術(shù)并發(fā)癥心肌梗死羅氏肉瘤病毒Glycoprotein ba receptorPDGF RCD18F proteinReoPro AbciximabCDP860Anti-CD18SynagisHumanized (IgG)Humanized F(ab)2Humanized F(ab)2Humanized (IgG1)/ FDA批準(zhǔn)（1998）53適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段艾滋病乙型肝炎巨細(xì)胞病毒中毒性休克一般癌癥Gp120Hep BCMVTNF-CD14VEGFPRO542OstavirProtovirMA

17、K-195 (SEGAND)IC14Anti-VEGFCD4 fusionHumanHumanMurine F(ab)2?Humanized (IgG1)(批準(zhǔn))54適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段卵巢癌結(jié)腸病肺病頭、頸部病變CA12517-1A Cell surface antigenAnti-idiotypic GD3epitopeEGFROvaRexPanorexBEC2IMCC225MurineMurine (IgG2a)Murine(IgG)MerckKGaAChimeric (IgG0/德國(guó)批準(zhǔn)（1995）55適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段乳腺病慢性淋巴細(xì)胞白血病急性

18、粒細(xì)胞白血病非何杰金淋巴瘤HER2/neuCD52CD33CD20CD22HerceptinCampath1/ ( LDP03)SmartRituxanLymphoCideHumanized (IgG1)Humanized(IgG1)M195Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)FDA批準(zhǔn)（1998）生物制品許可申請(qǐng)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)FDA批準(zhǔn)/56適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來(lái)源臨床階段非何杰金淋巴瘤黑色素瘤HLAHLA DR抗id(GD2)*Smart 1D10Oncolym (Lym-1)TriGemHumanizedRadiolabelled murineMurine/57 武

19、漢生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人T淋巴細(xì)胞CD3抗原單克隆抗體是國(guó)內(nèi)自行研制最早批準(zhǔn)上市的抗體；北京百泰生物與古巴合作開發(fā)的I類癌癥治療新藥“重組人源化抗人表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體”(商品名：泰欣生)是我國(guó)批準(zhǔn)的第一個(gè)人源化單克隆抗體藥物；58 第四軍醫(yī)大學(xué)、成都華神聯(lián)合研制的美妥昔單抗注射液(商品名：利卡汀)是全球第一個(gè)用于治療原發(fā)性肝癌的藥物，也是我國(guó)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體類藥物。噬菌體展示系統(tǒng)Phage on displayExponential growth in publications referring to phage display.The number of

20、Medline citations containing the terms phageand display are plotted against the year of publication.TIBTECH NOVEMBER 1999 (VOL 17).Of Needles and Haystacks噬菌體展示系統(tǒng)Phage on display噬菌體展示原理 噬菌體展示定義、分類 簡(jiǎn)介噬菌體及淘選過(guò)程噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)表型 基因型展示肽 編碼基因什么是噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將 外源多肽或蛋白 與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子

21、的 DNA 則位于病毒粒子內(nèi)。使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過(guò)淘選得以快速鑒定。Smith 在 1985 年首次證實(shí)外源 DNA 可以插入絲狀噬菌體基因 III 中，并與 pIII 蛋白融合展示。Smith GP. Science 1985; 228:1315-7噬菌體展示技術(shù)Phage Display TechnologyWhat can be displayed? Proteins from 6-300 aa Short peptides Antibody fragments cDNA library enzymes1P

22、an library withimmobilized targets2Wash off unbound phage3Elute bound phage4Amplify overnight5Pan eluted phage6Isolate individual colony3-4 2004 Montarop YamabhaiCell Free展示系統(tǒng)Display SystemPhage DisplayCell BasedCell Surface DisplayRibosome DisplaymRNA Display根據(jù)噬菌體不同根據(jù)載體不同根據(jù)文庫(kù)不同PhageLibrary噬菌體展示系統(tǒng)的分

23、類Classification of phage display systems根據(jù)載體不同VectorTrue PhagePhagemid根據(jù)噬菌體不同PhageM13, f1, fdT7, T4, lamda根據(jù)文庫(kù)不同Library隨機(jī)肽庫(kù)cDNA文庫(kù)抗體文庫(kù)蛋白質(zhì)文庫(kù)Schematic representation of M13 PhageSchematic representation of T7 Phage種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)Structure of

24、M13 filamentous phage絲狀噬菌體：M13、f1和fd 。單鏈DNA病毒,6407 bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5Schematic representation of M13 PhageLife Cycle of M13pIII蛋白結(jié)合于 E.Coli 的F纖毛;細(xì)菌的Tol蛋白復(fù)合體解聚噬菌體的衣殼蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿（再用）;病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37 oC）。感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體。次要衣殼蛋白p

25、IIIBRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS. VOL 1. NO 2. 189203. JULY 2002406 aa 組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1 穿膜區(qū)： 作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2 受體結(jié)合 區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT 疏水區(qū)： 組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1 、 G2: 甘氨酸片段，在感染過(guò)程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性。Infection of E.coli by Ff baceriophage主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)病毒子含約2700個(gè)

26、拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達(dá)的多肽是低價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽則是高價(jià)的（每個(gè)病毒子200個(gè)拷貝）。這種高價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫(kù)都是pIII融合方式（每個(gè)病毒子展示5個(gè)拷貝的外源多肽）。Smith et al. (1997) Chem. Rev. 97, 391-410phagemid vectorsTypes of phage displaysystempVIII 展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只

27、要不影響感染，可以展示300 aa的多肽。噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86 kDa。噬菌體質(zhì)粒方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性Phage display with phagemid vectors噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒(méi)有其他噬菌體基因。有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(322 ori)和噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori用于合成ssDNA)。有包裝序列信號(hào)（packing signal）。有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helper phage ： 提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶（f1ori defect)。包裝后的噬菌體包含有兩種不同來(lái)源的成份：噬菌體質(zhì)粒和He

28、lper phage。多價(jià)展示？單價(jià)展示？Polyvalent or monovalent display?展示價(jià)位（Display valency)：噬菌體表面展示的多肽的拷貝數(shù)。展示價(jià)位不同所篩選的分子親和力就會(huì)不同。用噬菌體質(zhì)粒時(shí)，以pIII展示為例：10%病毒展示為單價(jià)，非常少量的展示為兩個(gè)拷貝，絕大多數(shù)只展示野生型pIII。The major displaying speciesis monovalent, but mostparticles do not display at all.True phagePhagemid多價(jià)展示單價(jià)展示篩選到的分子親和力相對(duì)低親和力高極少或無(wú)未展示

29、的噬菌體*大 部 分 是 未 展 示 的 噬 菌 體高拷貝數(shù)增加了抗原性可能會(huì)影響噬菌體的組裝和增殖易克隆，遺傳穩(wěn)定性好改進(jìn) helper phagepJuFo噬菌質(zhì)粒中加入了 Jun and Fos Leu Zipper基因兩個(gè)基因都以 PelB 作為 signal sequence，以 lac作為 promoter/operator。NH2- pelB + Jun Leu zipper + C-terminal domain pIII-COOHNH2- pelB + Fos Leu zipper + cDNA-product COOHJun和 Fos通過(guò)二硫鍵形成異源二聚體the lead

30、er in enzyme technology展示 cDNA 文庫(kù)Selection from cDNA librariesCarmeri et al. Gene 1993the leader in enzyme technology淘選Finding the needle in the haystack: Screeningphage display libraries建立噬菌體展示庫(kù)淘選噬菌體展示庫(kù)分析克隆the leader in enzyme technology淘選的方法親和淘選直接包被法淘選法： 優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單直接。 缺點(diǎn)： 偶爾會(huì)導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入 可能是由于分子的立體封阻

31、或者是靶分子表面的部分變性而引起液相法： 先將噬菌體庫(kù)在液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體 - 靶分子復(fù)合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和素包被的表面。the leader in enzyme technology噬菌體肽庫(kù)與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)三輪淘選后，克隆測(cè)序噬菌體肽庫(kù)淘選示意圖：親和篩選the leader in enzyme technology測(cè)定抗FLAG M2單克隆抗體的抗原決定簇對(duì)每 輪 淘選 所得到的克隆測(cè)序，結(jié)果清晰地顯示核心抗原決定簇是DYKXXD,其中X可以是任意氨基酸。為 了 確 定 FLAG 抗 原

32、 決 定 簇 序 列DYKDDDDK中哪一個(gè)氨基酸是抗體結(jié)合所必需的，將單克隆抗體包被于96孔板 ， 對(duì)Ph.D.-7 展 示 文 庫(kù) 進(jìn) 行 三 輪 淘選。the leader in enzyme technology噬菌體展示系統(tǒng)Phage on display噬菌體展示原理噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)the leader in enzyme technology噬菌體展示的應(yīng)用抗原表位分析制備特異性抗體制備疫苗、多價(jià)疫苗構(gòu)建新型的生物催化劑如Ren et al (1997)將T4 DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。有可能把催化某一代謝途徑的多

33、種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復(fù)合體?；蛘甙殉砂偕锨€(gè)酶分子的活性位點(diǎn)展示到同一個(gè)噬菌體顆粒上，制造superenzyme。the leader in enzyme technology噬菌體展示的應(yīng)用篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫(kù)中篩選到非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制 F VIIa 活性的肽段。Coagulation Cascade. A current simplified view of thecoagulation cascade initiated by the TFFVIIa complex is shown.the leader in enzyme techn

34、ology噬菌體展示的應(yīng)用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用噬菌體cDNA文庫(kù)與芯片相結(jié)合(a)合成噬菌體cDNA文庫(kù)。(b)生物淘選。(c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準(zhǔn)備。General selection scheme for cDNA expression-products displayed on phagesurface. Konthur et al 2003 TARGETS Vol. 2, No.6 261-270.the leader in enzyme technology噬菌體展示的應(yīng)用噬菌體cDNA文庫(kù)與芯片結(jié)合(a)淘選后的文庫(kù)，制作DNA芯片。(b)確認(rèn)插入片段的種類。(c)

35、生物化學(xué)方法進(jìn)一步確認(rèn)。Scheme for the elucidation of the complexity of enriched cDNA expression-productphage display libraries. Konthur et al 2003 TARGETS Vol. 2, No.6 261-270.the leader in enzyme technology用病人IgE血清對(duì)6種不同的cDNA文庫(kù)淘選，5輪后，挑出38,000個(gè)克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為已知， 186種是新的過(guò)敏源。煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)已成為臨床上僅

36、次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌。草本枝孢 (小麥黑霉病菌)Cladosporium herbarum雞腿蘑（Coprinus comatus）皮屑牙胞菌 (Malassezia furfur)花生和人肺組織Crameri, R. et al. (2001) Tappingallergen repertoires by advancedcloning technologies. Int. Arch.Allergy Immunol. 124, 4347噬菌體展示的應(yīng)用應(yīng)用舉例the leader in enzyme technology噬菌體展示系統(tǒng)Phage on display噬菌體展

37、示原理噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)the leader in enzyme technologyCommercial suppliers of phagedisplay vectors and librariesthe leader in enzyme technologyPhDTM Phage Display System用于 PhD 中的噬菌體是 M13KE由M13mp19衍生的溶源性噬菌體。隨機(jī)肽與次要衣殼蛋白N-端融合，經(jīng)細(xì)胞膜分泌，噬菌斑模糊不透明，用有-互補(bǔ)的宿主菌在含Xgal/IPTG的平板上可呈藍(lán)斑 。融合蛋白表達(dá)時(shí)N端有一段信號(hào)肽前導(dǎo)序列，蛋白分泌后前導(dǎo)序列被切除，使隨

38、機(jī)七肽直接展示于成熟蛋白的N端。the leader in enzyme technology噬菌體展示肽庫(kù)E. coli ER2738 宿主菌- 28 gIII 測(cè)序引物 （用于人工測(cè)序）- 96 gIII 測(cè)序引物 （用于自動(dòng)測(cè)序）鏈霉親和素 Streptavidin生物素試劑盒組成the leader in enzyme technology文庫(kù)克隆載體可以買到嗎？用 來(lái) 構(gòu) 建 所有這三種Ph.D.文庫(kù)的載體，M13KE （# E8101S）， 是 可 以 購(gòu) 買 到的。M13KE 是M13mp19 的 衍 生 株 ， 其pIII 基因的5 端構(gòu)建了限制性酶切位點(diǎn)，用戶可 以 將 設(shè)

39、計(jì) 好 的 人 工 基 因 盒（ synthetic cassette） 插 入 此 處 構(gòu)建自己的肽庫(kù)。因?yàn)镸13KE是噬菌體，而不是噬菌粒載體，所以在已加工的病毒子上所有5個(gè)拷貝的pIII蛋白均攜帶有展示肽序列。另外，大于20-30個(gè)氨基酸的展示多肽會(huì)影響噬菌體的感染力，所以此載體僅適合展示短的多肽。the leader in enzyme technologyM13K07 Helper Phage由M13衍生而來(lái)。在M13復(fù)制起始點(diǎn)處，插入有卡那霉素抗性基因。能在無(wú)噬菌質(zhì)粒的情況下復(fù)制。當(dāng)有噬菌質(zhì)粒時(shí)，由于噬菌質(zhì)粒含有野生型M13或者f1復(fù)制起始點(diǎn)，因此，單鏈?zhǔn)删|(zhì)粒的DNA會(huì)被優(yōu)先包裝

40、并分泌。不能用M13KO7作為克隆載體，如果要克隆噬菌體展示庫(kù)，建議使用M13KE噬菌體克隆載體。the leader in enzyme technologyM13噬菌體與其他噬菌體比較有什么優(yōu)點(diǎn)？M13噬菌體為非裂解性噬菌體（溶源性），周質(zhì)內(nèi)組裝，經(jīng)細(xì)胞膜分泌，噬菌斑的形成不是由于菌體裂解而是由于細(xì)胞生長(zhǎng)力減弱所致，因此噬菌斑是渾濁的而不是清亮的，用有 -互補(bǔ)的宿主菌在含 Xgal/IPTG的平板上可呈 藍(lán)斑 。由于 M13噬菌體在增殖期間不裂解宿主菌。簡(jiǎn)化了噬菌體純化步驟，只用簡(jiǎn)單的 PEG沉淀方法就足以將噬菌體與其他所有污染的細(xì)胞蛋白分開。而其他用于噬菌體展示的噬菌體如： T7, T4

41、和 Lambda噬菌體均為裂解性噬菌體，每輪淘選之間都需要花時(shí)間進(jìn)行純化，以避免淘選擴(kuò)增的噬菌體污染有細(xì)胞蛋白（如：有些蛋白酶類物質(zhì)會(huì)在淘選時(shí)將靶分子降解掉）。the leader in enzyme technologyNEB的噬菌體文庫(kù)能展示cDNA文庫(kù)嗎？不適合于 cDNA文庫(kù)展示，因?yàn)檫@種表達(dá)需要使目的蛋白序列在前導(dǎo)序列（蛋白分泌所需要的）和噬菌體包膜蛋白 pIII或 pVIII的 N端序列之間保持讀碼框架一致，這樣產(chǎn)生的 M13 cDNA文庫(kù)中，能有效表達(dá)的克隆會(huì)非常少。Novagen的 T7 Select 噬菌體展示系統(tǒng)可以將 cDNA插入片段融合在包膜蛋白的 C末端，但是該系統(tǒng)利

42、用的是裂解性噬菌體 T7而不是溶源性噬菌體 M13，淘選擴(kuò)增的噬菌體可能會(huì)污染有細(xì)胞蛋白，故需要化更多的時(shí)間進(jìn)行噬菌體的純化。貨號(hào)產(chǎn)品名稱規(guī)格價(jià)格E8100SPh.D.-7噬菌體表面展示試劑盒10次淘選E8110SPh.D.-12噬菌體表面展示試劑盒10次淘選E8120SPh.D.-C7C噬菌體表面展示試劑盒10次淘選E8101SPh.D.多肽展示克隆系統(tǒng)20 gthe leader in enzyme technologyNEB提供的三種隨機(jī)肽庫(kù)the leader in enzyme technologyRecombinant PhageAntibody system用于克隆、表達(dá)和檢測(cè)小

43、鼠抗體基因噬菌質(zhì)粒-Helper phage系統(tǒng)抗體片段克隆于噬菌質(zhì)粒與pIII蛋白融合展示在M13噬菌體表面Helper phage-M13KO7the leader in enzyme technologyT7Select Phage Display Systemfrom NovagenNovagen 提供：Display VectorPre-Made Librariesthe leader in enzyme technologyT7 噬菌體結(jié)構(gòu)Structure of the T7 phage particle(Source: Novagen)裂解型噬菌體，含有雙鏈DNA(40 kb,

44、55 gene,3 classes)。Life cycle 30 min at 30C頭部：20面體（icosahedral)，衣殼蛋白有415拷貝（capsidprotein,gene 10)，分別由60個(gè)6聚體和11個(gè)5聚體組成。尾部：連接頭尾的頸圈（connector)、1個(gè)短小的圓錐型尾部和6個(gè)尾絲。the leader in enzyme technologyGenetic map of T7衣殼蛋白表達(dá)受以下因素的調(diào)控：T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子10 (promoter)終止子T （terminator)翻譯起始因子s10（translation initiation signals

45、)衣殼蛋白有兩種形式：10A (344aa)和10B（397aa）T7Select載體：10Bthe leader in enzyme technologyT7Select vector featuresT7Select 415-1b: 衣殼蛋白基因含有野生型的調(diào)控信號(hào)：10 promoter, Tterminator, and s10 translation initiation signals。T7Select10-3b： The s10 translation initiation signal (ribosome bindingsite) was modified to produce the mid-copy vector。T7Select1-2: 10 and s10 wer