瓊脂柱法測(cè)定抗真菌藥物對(duì)皮膚癬菌的

1、瓊脂柱法測(cè)定抗真菌藥物對(duì)皮膚癬菌的MIC中華皮膚科雜志 1998年第5期第31卷 技術(shù)與方法作者：李少平劉維達(dá)王紅單位：210042 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚 病研究 所李少平(楊森培訓(xùn)計(jì)劃高級(jí)進(jìn)修醫(yī)師，現(xiàn)在天津長(zhǎng)征醫(yī)院)劉維達(dá)(指導(dǎo)者)王紅因抗真菌藥物敏感 性測(cè)定(MIC)影響因素多而難以標(biāo)準(zhǔn)化，尤其是接種菌的精確定量一直未能解決。最近But ty等 1推薦一種瓊脂柱法，我們參照此方法并做了改進(jìn)，獲滿意的結(jié)果， 現(xiàn)報(bào)道如下。一、材料和方法(一)材料：1.菌株：20株受試皮膚癬菌菌株由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心提供。其中 有8株紅色毛癬菌為臨床新分離株。菌株的鑒定主要依

2、據(jù)菌落特征及鏡下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。2.培養(yǎng)基：沙堡氯霉素瓊脂(SDA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。3.藥物：酮康唑粉由南京第二制藥廠提供，批號(hào)94037，生產(chǎn)日期1994年4月，含量99.71% 。4.藥敏板：直徑2cm的24孔Nanclon細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥產(chǎn))，一次性使用或消毒后重復(fù)使用。(二)方法：1.挑取純菌落點(diǎn)種在直徑9cm SDA(瓊脂含量分別為1%、2%)和PDA平皿的中心，28保濕培養(yǎng) 15天。2.稱取6.4mg酮康唑粉，溶于500l二甲基亞砜中作為母液，然后用去離子水按19比例稀 釋，再做10級(jí)倍比稀釋，分別與一定量不同硬度SDA及PDA培養(yǎng)基在50水浴混勻，最終獲工 作濃度6.4

3、0.012g/ml。3.取不同稀釋度含藥瓊脂(50)1ml，分別注入細(xì)胞培養(yǎng)板的孔洞中，同時(shí)做對(duì)照(溶媒及空 白對(duì)照)。冷凝后用直徑0.6cm打孔器在培養(yǎng)板孔內(nèi)瓊脂中央打孔洞。4.同上述方法，用同直徑的打孔器在長(zhǎng)有菌落的瓊脂上打孔，位置約在平皿菌落中心至邊緣 距離的外1/3處，將覆有菌落的瓊脂柱小心置入培養(yǎng)板孔的等徑小洞中。5.接種后的藥敏板置28培養(yǎng)，于第3天和第7天觀察結(jié)果。3天后，對(duì)照孔接種的瓊脂柱邊 可見(jiàn)接種菌呈花冠樣毛邊生長(zhǎng)，其它含藥孔若呈此種特征判為陽(yáng)性，否則判為陰性，其開(kāi)始 孔濃度即為MIC。培養(yǎng)7天后，菌落直徑等于或大于0.8cm(即接種菌生長(zhǎng)直徑)判為陽(yáng)性，否 則判為陰性。6

4、.按照Butty等1方法將帶菌瓊脂柱接種在平皿內(nèi)含藥的瓊脂 空洞中，空洞距平皿邊緣2cm，彼此相距2cm，余同上。7.將本法所測(cè)的MIC與微量稀釋法進(jìn)行比較，探討瓊脂硬度及不同培養(yǎng)基對(duì)MIC的影響。二、結(jié)果1.不同皮膚癬菌在SDA的瓊脂柱上于接種后第7天菌落大小明顯不同，在本實(shí)驗(yàn)中，若菌落直徑1.5cm(如絮狀表皮癬菌等)，接種后7天觀察結(jié)果，其余在3天后觀 察(如紅色毛癬菌)。2.改良瓊脂柱法結(jié)果見(jiàn)圖1。A和B為須癬毛癬菌，C和D則為犬小孢子菌，A6、B6、C6 、D6為兩菌株的空白對(duì)照。藥物濃度按A5、C5B5、D5A4、C4順序由0.0 12g/ml倍比增加。須癬毛癬菌和犬小孢子菌的MI

5、C孔分別為B2和D3，即MIC值為1.6 g/ml和0.8g/ml。圖1將接種菌瓊脂柱接種在含藥24孔Manclon板上，7天生長(zhǎng)情況(改良法)3.20株皮膚癬菌用兩種方法及不同瓊脂硬度在體外對(duì)酮康唑的敏感性測(cè)定結(jié) 果見(jiàn)附表。從中可知瓊脂柱法測(cè)定MIC值一般比微量稀釋法高12個(gè)稀釋度；2% SDA MIC值高于1 % SDA。PDA由于在第7天仍無(wú)菌落生長(zhǎng)而未能記錄。附表20株皮膚癬菌體外對(duì)酮康唑敏感性測(cè)定結(jié)果(MIC，g/ml)菌種菌株方法瓊脂硬度瓊脂柱法微量稀釋法1% SDA2% SDA紅色毛癬菌90.128*0.067*0.803*0.108*許蘭氏毛癬菌10.100.050.100.0

6、2紫色毛癬菌10.400.100.200.40斷發(fā)毛癬菌10.800.400.400.80須癬毛癬菌21.60*0.40*0.80*1.60*鐵銹色毛癬菌10.200.200.200.20石膏樣小孢子菌20.30*0.20*0.30*0.40*犬小孢子菌10.800.200.200.40奧杜盎小孢子菌10.400.200.400.40絮狀表皮癬菌10.800.400.800.80均值200.5530.220.3480.531*為均值三、討論關(guān)于絲狀真菌的藥物敏感性測(cè)定，目前常用的方法有瓊脂稀釋法和液體稀釋法，其共同不足 之處 是接種物不易準(zhǔn)確定量，分生孢子與菌絲比例不易控制。本文方法的最大優(yōu)點(diǎn)是在不 改變接種真菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)的前題下定量取材，保證菌絲與分生孢子間比例一致，較好地解 決了上述問(wèn)題。我們對(duì)Butty等報(bào)道方法1 所做的改進(jìn)是用24 孔培養(yǎng)板(見(jiàn)圖1)代替培養(yǎng)皿作為藥敏試驗(yàn)載體，將同一藥物濃度不同菌種的傳統(tǒng)模 式(紙片法)改為同一菌種不同藥物濃