六六六微生物降解途徑的研究進(jìn)展1

1、六六六微生物降解途徑的研究進(jìn)展曹禮 張浩 黃科 谷濤 洪青* 李順鵬(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京210095)摘要：六六六是一種曾在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的有機(jī)氯殺蟲劑，具有高毒性和長(zhǎng)殘留性,在發(fā)達(dá)國(guó)家被限制或禁止使用，但是一些發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)仍然被繼續(xù)使用。即使在一些停用六六六多年的國(guó)家，六六六的殘留依然存在。本文概述了六六六的各同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)、六六六降解菌的多樣性和六六六四種主要同分異構(gòu)體（-、- 、-、-HCH）的微生物降解的最新研究進(jìn)展，為六六六污染地區(qū)進(jìn)行經(jīng)濟(jì)可行的生物修復(fù)提供參考。關(guān)鍵詞：六六六；降解途徑；lin基因；高殘留Advances inmi

2、crobialdegradation pathway of hexachlorocyclohexaneCao Li Zhang Hao Huang Ke Gu TaoHong Qing*Li Shunpeng(Department of Microbiology, Key Lab of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)Abstract：Hexachl

3、orocyclohexane (HCH) is anotorious halogenated organic insecticide，which was once used widely throughout the world for agricultural and public health purposes. Hexachlorocyclohexane (HCH) is a broad spectrum insecticide still used as a cheap but effective insecticide in some of the developing countr

4、ies, though developed countries have banned or curtailed its use because of its high toxicity and recalcitrant persistence in the environment. Even in those countries where the use of HCH has been discontinued for a number of years, the problem of residues of all isomers of HCH remains because of it

5、s persistence. In this article, we summarized the configuration of HCH-isomers，the diversity of microorganisms degrading HCH， the current progress regarding mainly four HCH-isomers（-, -, - and -HCH） biodegradation pathway.Key words: Hexachlorocyclohexane；Degradation pathway；lin genes；High persistenc

6、e基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 31070099); *通訊作者：洪青，Tel: 86-25-84398685, E-mail: hongqing作者簡(jiǎn)介：曹禮(1977- ) ，男，安徽阜陽(yáng)人，博士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)與環(huán)境工程。E-mail: caolicldr六六六又名六氯環(huán)己烷（hexachlorocyclohexane，HCH），是一種有機(jī)氯殺蟲劑，在上個(gè)世紀(jì)七十年代前在世界范圍內(nèi)被廣泛使用1-5。六六六在環(huán)境中的自然降解緩慢，在環(huán)境中的半衰期長(zhǎng)達(dá)幾十年，甚至上百年，所以六六六的三種異構(gòu)體(-, 和 - HCH )于2010年被聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署（United Na

7、tions Environment Programme，簡(jiǎn)稱UNEP）列入持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，簡(jiǎn)稱POPs)名單6。在工業(yè)上，六六六通過苯和氯氣在紫外線照射下合成而得，它是一種含有各種異構(gòu)體的混合物，被稱為工業(yè)級(jí)六六六3。工業(yè)級(jí)六六六理論上有8種同分異構(gòu)體，圖1為-、-、-、-、-、- 和-HCH的結(jié)構(gòu)，這些異構(gòu)體由于氯原子在環(huán)己烷環(huán)上不同的空間排列而有不同的性質(zhì)7。但是我們通常所說的六六六異構(gòu)體一般包括五種異構(gòu)體，即-HCH (6070%), -HCH (512%), - HCH(1012%) ，-HCH(610%)和- HCH (3

8、 4%)6，其他三種異構(gòu)體因?yàn)楹繕O少又不重要，一般不包括在所謂的六六六總量?jī)?nèi)。圖1 六六六七種主要的異構(gòu)體的氯原子在環(huán)己烷環(huán)上的空間排列FIG. 1Axial versus equatorial arrangements of chlorine atoms in the five major isomers of HCH plus the less common- and-isomers. Notethat a -HCH also exists in two enantiomeric (and) forms.六六六的廣譜毒性和長(zhǎng)殘留性引起世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注。Weber等5科學(xué)家在2008年估

9、計(jì)，全世界共合成了400600萬(wàn)噸六六六釋放到環(huán)境中，在規(guī)模上相當(dāng)于其它所有持續(xù)性有機(jī)污染物（POPs）釋放數(shù)量的總和。據(jù)報(bào)道，六六六異構(gòu)體的殘留在世界許多國(guó)家的空氣、水、土壤、食物、牛奶、魚類和哺乳動(dòng)物中被檢出，甚至人的血液和脂肪組織中，也有六六六殘留8-9。即使一些遠(yuǎn)離六六六生產(chǎn)和使用基地，甚至從來(lái)沒有生產(chǎn)和使用過六六六的地方，諸如北極、南極和太平洋的環(huán)境中也被檢測(cè)出有六六六的殘留8-9。雖然六六六已經(jīng)在很多國(guó)家和地區(qū)被限制生產(chǎn)和使用，但是在印度和一些熱帶國(guó)家與地區(qū)，六六六仍然在生產(chǎn)使用6，所以它在全世界的殘留污染問題依然存在。在六六六微生物降解途徑的研究方面，主要的四種異構(gòu)體均取得了不同

10、程度的進(jìn)展。其中-HCH與-HCH的微生物降解途徑已被闡明，-HCH和-HCH微生物降解的研究是目前環(huán)境微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，而- HCH的微生物降解途徑研究較少而未見報(bào)道。1 降解六六六的微生物通過微生物對(duì)六六六污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)一直是世界各國(guó)環(huán)境工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。通過富集培養(yǎng)分離出許多能夠降解HCH的微生物,包括細(xì)菌、真菌等4，10。第一株被報(bào)道的好氧六六六降解菌是在十九世紀(jì)八十年代由日本科學(xué)家分離獲得，然后其它國(guó)家也陸續(xù)有相關(guān)菌株的報(bào)道和研究。- HCH的微生物降解研究較少，其降解微生物和降解途徑未見報(bào)道。目前好氧降解菌雖然來(lái)自全球不同，但大多數(shù)集中在Sphingobium。第一株被報(bào)

11、道的好氧降解菌是在十九世紀(jì)八十年代由日本科學(xué)家分離獲得，然后其它國(guó)家也陸續(xù)開展研究。目前大部分對(duì)六六六降解的研究主要集中在30個(gè)菌株中的三株4: 從日本分離到的Sphingobium japonicum UT2611，從法國(guó)分離到的Sphingobium francense Sp+12和從印度分離到的Sphingobium indicum B90A13（最初將這三株菌株均鑒定為Sphingomonas paucimobilis，直到2005年才將它們重新鑒定為Sphingobium屬的三個(gè)新種14）。其它六六六的降解菌，分別分離篩選于德國(guó)、西班牙、中國(guó)、日本和印度等被六六六污染的土壤中4，這些

12、六六六的降解菌，在六六六降解的早期階段有不同的底物特異性。國(guó)內(nèi)報(bào)道的六六六菌株主要有BI菌株15和Sphingomonas sp. BHC-A菌株16。2六六六的厭氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展有關(guān)六六六的厭氧降解的報(bào)道始于十九世紀(jì)六十年代，隨后厭氧降解六六六各種異構(gòu)體的微生物也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)4，10，最初認(rèn)為六六六的生物降解主要是一種厭氧的過程，并且、和異構(gòu)體的六六六的生物降解也被發(fā)現(xiàn)，由于異構(gòu)體的六六六在環(huán)境中相對(duì)而言最不穩(wěn)定，至今仍沒有報(bào)道異構(gòu)體的六六六的厭氧降解。在六六六厭氧降解途徑中，不同的異構(gòu)體通過一系列厭氧反應(yīng)最終生成苯或氯苯17-19（如圖2）。目前已有報(bào)道苯的厭氧礦化20-21，雖然

13、苯和氯苯在好氧條件下很容易被礦化，但是氯苯的厭氧礦化依然未見報(bào)道。據(jù)我們所知，沒有任何厭氧降解六六六的相關(guān)基因和酶被報(bào)道。而好氧降解六六六的相關(guān)基因（lin基因）已經(jīng)被分離并成功異源表達(dá)，并逐漸引起政府部門、企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)的關(guān)注，以發(fā)展生物修復(fù)技術(shù)去改造被六六六污染的地區(qū)。圖2 -和 -HCH厭氧代謝途徑FIG. 2 Consensus anaerobic degradation pathway of -and -HCH. Note that two intermediates that have been proposed but not yet observed empirically a

14、re shown in square brackets. The structures of TCCH and DCCH are shown in the planar format because their stereochemistries have not been established.3 -和-六六六的好氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展-HCH降解途徑及其相關(guān)基因的研究是上世紀(jì)九十年代以來(lái)微生物降解研究的熱點(diǎn)。日本學(xué)者通過近十五年的努力首先從Sphingobium japonicum UT26克隆到了16個(gè)與-HCH降解直接相關(guān)基因，在2005年提出了一條完整的-HCH降解途徑22-2

15、3。如圖3，脫氯化氫酶基因（linA）；1,4-TCDN脫氯酶基因（linB）；2,5-DDOL脫氫酶基因（linC）和2,5-DDOL脫氫酶基因linX組成了-HCH生物降解的上游階段。調(diào)節(jié)基因（linR）；2,5-DCHQ還原性脫氯酶基因（linD）；氯代對(duì)苯二酚1,2雙加氧酶基因（linE）和MA還原酶基因（linF）組成了-HCH生物降解的下游階段 23。LinE和LinEb都有催化CHQ生成2,6-DCHQ的活性，但是LinE和LinEb在UT26中主要參與CHQ到2,6-CHQ的反應(yīng)24。編碼琥珀酰輔酶A :3-羰基己二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因（linGH）、-酮己二酸硫解酶基因（lin

16、J）以及參與linGH基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因linI雖然也已經(jīng)被鑒定，但是其表達(dá)類型待定23。在六六的上游代謝途徑中，有三個(gè)代謝產(chǎn)物，即2,5-DCHQ 、1,2,4-TCB 和2,5-DCP，只有2,5-DCHQ可以在下游代謝途徑中進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化，而1,2,4-TCB 和2,5-DCP不能被Sphingobium japonicum UT26進(jìn)一步降解，稱為末端死產(chǎn)物。另外，Sphingobium japonicum UT26中的脫氯化氫酶（LinA）；1,4-TCDN脫氯酶（LinB）定位在細(xì)胞的周質(zhì)空間25，而兩個(gè)末端死產(chǎn)物1,2,4-TCB 和2,5-DCP在細(xì)胞的周質(zhì)空間一旦產(chǎn)生，將對(duì)Sp

17、hingobium japonicum UT26細(xì)胞有毒害作用26。現(xiàn)在已經(jīng)證明，在UT26中有四個(gè)基因（linKLMN）編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)作為一個(gè)疏水性物質(zhì)尤其對(duì)2,5-DCP的轉(zhuǎn)運(yùn)泵來(lái)解除這種毒害27。Sphingobium indicum B90A和Sphingomonas sp. BHC-A中也存在類似Sphingobium paucimobilisUT26的-HCH降解途徑。而關(guān)于-HCH的降解，目前的報(bào)道顯示六六六的a和異構(gòu)體有相似的代謝途徑，只有第一個(gè)脫氯酶催化的反應(yīng)不同，它和-HCH采用相同的途徑28。圖3 -HCH在Sphingobium japonicum UT26中的降

18、解途徑Fig. 3 Proposed degradation pathways of -HCH in S. japonicum UT26.1, -HCH; 2, -五氯環(huán)己烯（-PCCH）；3, 1,3,4,6-四氯-1,4-環(huán)己二烯(1,4-TCDN)；4, 1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)；5, 2,4,5-三氯-2,5-環(huán)己二烯-1-醇(2,4,5-DNOL)；6, 2,5-二氯苯酚(2,5-DCP)；7, 2,5-二氯-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二醇(2,5-DDOL)；8, 2,5-二氯對(duì)苯二酚（2,5-DCHQ）；9, 氯代對(duì)苯二酚（CHQ）；10, 對(duì)苯二酚（HQ）；11

19、, 酰氯；12, -羥基己二烯二酸半醛(-HMSA)；13, 順丁烯乙酸（MA）；14, -酮己二酸；15，-酮己二酸輔酶A；16，乙酰輔酶A；17，琥珀酰輔酶A；GSH，谷胱甘肽4 -六六六的好氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展國(guó)際上對(duì)于-HCH的微生物降解的研究進(jìn)展較為緩慢。已分離出的六六六降解菌中，大多數(shù)對(duì)于和異構(gòu)體具有良好的降解效果，而對(duì)于異構(gòu)體則沒有降解效果，在少數(shù)的報(bào)道的可以降解異構(gòu)體的細(xì)菌中，大多數(shù)對(duì)于異構(gòu)體的降解又極為緩慢，例如Sphingobium japonicum UT26，在使用高濃度的細(xì)胞時(shí)才能表現(xiàn)出對(duì)異構(gòu)體極微弱的降解能力29。Sphingobium indicum B90

20、A是目前報(bào)道的具有較強(qiáng)降解能力的菌株30。最近，在研究異構(gòu)體的降解基因方面獲得了突破，研究發(fā)現(xiàn)在Sphingobium japonicum UT26中的linB基因編碼的酶LinB可以催化-HCH轉(zhuǎn)化為-五氯環(huán)己醇(PCHL)，而PCHL則作為終產(chǎn)物不能再被LinB催化降解29。Sphingomonas sp. BHC-A對(duì)六六六的四種異構(gòu)體都有很好的降解效果16，如圖4，從中克隆到的linB基因（linB2）編碼的酶LinB2不僅可以轉(zhuǎn)化-HCH為-PCHL，同時(shí)也可以繼續(xù)催化-PCHL的轉(zhuǎn)化，形成終產(chǎn)物-TDOL31。除此之外，還未見其它關(guān)于-HCH的微生物降解方面的報(bào)道。圖4 HCH在S

21、phingomonas sp. BHC-A中的降解途徑Fig. 4 Proposed initial pathway for -HCH degradation.Compounds: 1 -HCH, 2 -PCHL, 3 -TDOL5 -六六六的好氧微生物降解途徑的研究進(jìn)展在六六六四種異構(gòu)體的微生物降解方面，-HCH是目前研究的最模糊的異構(gòu)體。主要是一些在厭氧環(huán)境下降解方面的報(bào)道32-36。目前國(guó)際上已經(jīng)報(bào)道的可以降解-HCH的菌株Sphingobium japonicum UT26，Sphingobium francense Sp+和Sphingobium indicum B90A等雖然在好氧

22、條件下對(duì)-HCH均有不同程度的降解作用，但是-HCH的完整降解途徑還沒有解析，相關(guān)基因方面的報(bào)道更少。1993年Yuji Nagata報(bào)道了來(lái)源于UT26菌株的脫氯化氫酶LinA可以轉(zhuǎn)化-HCH為-PCCH37。2001年Trantirek L在研究LinA作用機(jī)理的基礎(chǔ)上再次報(bào)道了LinA可以轉(zhuǎn)化-HCH為-PCCH，并且-PCCH為L(zhǎng)inA轉(zhuǎn)化的終產(chǎn)物38。2006年Sharma等報(bào)道了Sphingobium indicum B90A中的脫氯酶LinB可以轉(zhuǎn)化-HCH為-PCCH，并繼續(xù)轉(zhuǎn)化為-TDOL39。而在Sphingomonas sp. BHC-A中，如圖5，-HCH可以被LinA

23、連續(xù)脫氯化氫，轉(zhuǎn)化為-1,4-TCDN，中間產(chǎn)生-PCCH。同時(shí)反應(yīng)體系中的這三種物質(zhì)（-HCH，-PCCH和-1,4-TCDN）又都可以作為L(zhǎng)inB2的底物，通過三種不同的脫氯反應(yīng)被LinB2轉(zhuǎn)化40。這也是-HCH到目前為止文獻(xiàn)報(bào)道的最新進(jìn)展。Fig. 5. 由LinA和LinB2組成的-HCH的降解途徑Fig 5 Proposed degradation pathway of -HCH by LinA and LinB2. 1, -六六六 (-HCH); 2, -無(wú)氯環(huán)己烷(-PCCH); 3, -1,3,4,6-四氯-1,4-環(huán)己二烯 (-1,4-TCDN); 4, 1,2,4-三氯苯

24、 (1,2,4-TCB); 5, -2,3,4,5,6-五氯環(huán)己醇(-PCHL); 6, -2,3,5,6-四氯-1,4-環(huán)己二醇 (-TDOL); 7, -2,3,5-三氯-5-環(huán)己烯-1,4-二醇 (-2,3,5-TCDL); 8, -2,4,5-三氯-2,5-環(huán)己二烯-1-ol (-2,4,5-DNOL); 9, -2,5-二氯-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二醇(-DDOL); 10, 2,5-二氯苯酚l (2,5-DCP).6結(jié)論從六六六開始使用到現(xiàn)在6070年的時(shí)間里，六六六的高毒性和長(zhǎng)期的殘留性已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。在各種去除六六六污染的措施中，通過微生物對(duì)六六六污染環(huán)境進(jìn)行的生物修

25、復(fù)因其高效、安全、成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)而具有美好的發(fā)展前景。目前，菌株Sphingobium japonicum UT26和 Sphingobium indicum B90A的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，隨著研究的深入，六六六代謝途徑的解析，尤其對(duì)-HCH和-HCH代謝途徑的徹底闡明、六六六新的降解基因的研究、以及降解酶構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)的研究等，將會(huì)有新的進(jìn)展，這將大大有助于對(duì)六六六的污染產(chǎn)品或地區(qū)開展高效而徹底的修復(fù)工作。參 考 文 獻(xiàn)1 Breivik K, Pacyna JM, Munch J. Use of -, -, - hexachlorocyclohexane in Europe,19

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