生物相容性分離介質在樣品前處理中的應用

1、生物相容性別離介質在樣品前處理中的應用潘加亮胡玉玲李攻科【摘要】生物樣品基體復雜,蛋白質等生物大分子的干擾給樣品前處理帶來很大的困難.近年來,生物相容性別離介質在樣品前處理中的應用特別引人注目.本文綜述了生物相容性別離介質及其在固相萃取、固相微萃取、微透析樣品前處理中應用的進展.【關鍵詞】生物相容性,別離介質,樣品前處理,綜述1引言近年來,無溶劑或少溶劑的樣品前處理技術開展迅速,如固相萃取(Solidphaseextraction,SPE)、固相微萃取(Solidphasemicroextraction,SPME)及微透析(Microdialysis,MD)等,其中別離介質的選擇是實現(xiàn)分析物采

2、樣、別離、富集的關鍵,因此開展選擇性高、富集水平強的別離介質成為樣品前處理技術的研究熱點.在生物樣品前處理過程中,復雜基體對別離介質的干擾和破壞,以及分離介質對生物體的影響(如致毒、免疫排斥),是普遍存在的問題.因此,開展生物相容性別離介質對生物樣品采樣、別離分析具有重要意義.在生物醫(yī)學領域,生物相容性是指醫(yī)用或藥用材料與生物體相容的性質,即材料在實際應用中產生的材料反響和宿主反響的性質.材料和生物機體的相互作用主要表現(xiàn)在兩方面：一是材料反應,即活體對材料的作用,包括生物環(huán)境對材料的腐蝕、降解、磨損和性質退化,甚至破壞；二是宿主反響,即材料對活體系統(tǒng)的作用,包括局部和全身反響,如炎癥、細胞毒性

3、、凝血、過敏、致癌、致畸和免疫反響等.當材料進入機體后,在一段時間內會發(fā)生材料反響和宿主反響,反響后材料不失去其根本功能,也不引起機體的不良反響,那么可認為該段時間內材料具有良好的生物相容性1.在分析化學領域,別離介質的生物相容性是指別離介質在生物環(huán)境中仍保持良好的別離與富集水平,同時不引起生物體免疫排斥等不良反響的性質.在生物樣品前處理中,采用生物相容性別離介質,能防止蛋白質等大分子的在介質外表的吸附2,減少基體的干擾、延長介質的壽命,有望實現(xiàn)生物體的原位采樣及在線檢測.生物樣品中蛋白質等生物大分子通常是引起干擾的主要基體.因此,生物相容性介質必須具備兩個條件：有親水的外表,能防止蛋白質變性

4、和吸附；孔徑足夠小,使蛋白質等大分子排阻在孔穴外.作為別離介質,還必須對分析對象具有別離、富集水平.2生物相容性別離介質2.1 吸附型生物相容性別離介質2.1.1 限進介質(Restrictedaccessmedia,RAM)限進介質的研究從20世紀80年代中期開始,是目前在生物樣品前處理中使用最廣泛的生物相容性別離介質.RAM外外表經過親水修飾且具有適宜的孔徑,使得生物樣品中蛋白質等大分子不能進入介質的內孔,防止發(fā)生不可逆吸附；內孔外表通常具有反相萃取劑或離子交換萃取劑的性質,能吸附小分子,如圖1所示2.烷基二醇硅膠(Alkyldiolsilica,ADS)外外表鍵合有高度親水的二醇基,內孔

5、外表鍵合C4,C8,C18或苯基等基團,既能排阻分子量大于15000的蛋白質等大分子,也能萃取生物樣品中低極性的小分子,是目前最常用的RAM材料.圖1限進介質顆粒示意圖2Fig.1Schematicrepresentationofrestrictedaccessmedia(RAM)particle21.1.2 聚(甲基丙烯酸擬乙二醇二甲基丙烯酸酯)聚(甲基丙烯酸擬乙二醇二甲基丙烯酸酯)(Poly(methacrylicacid以ethyleneglycoldimethacrylate),Poly(MAA擬EGDMA)是指酸性單體甲基丙烯酸(MAA)和雙功能基交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDM

6、A)的共聚物,其生物相容性良好,在生物醫(yī)學領域使用廣泛.該聚合物具有疏水的骨架以及酸性的側基,對堿性物質具有很好的吸附作用,且在較寬的pH范圍內性質穩(wěn)定,適合用作固相萃取或管內固相微萃取的固定相.1.1.3 分子印跡聚合物(Molecularimprintpolymer,MIP)分子印跡聚合物是指將待別離的目標分子與功能單體通過共價或非共價作用進行預組裝,再與交聯(lián)劑共聚得到的聚合物.除去目標分子后,聚合物中形成與目標分子空間互補并具有預定作用位點的空穴,因此對目標分子的空間結構有記憶效應,能夠高選擇性地識別復雜樣品中的印跡分子.高選擇性是MIP的特點,但能否防止蛋白質等大分子的吸附,取決于聚合

7、物本身的性質.目前,常見的MIP是以MAA為功能單體,EGDMA為交聯(lián)劑,與Poly(MAA擬EGDMA)有類似的性質,作為吸附劑廣泛應用于固相萃1.1.4 免疫吸附劑(Immunosorbents,ISs)免疫吸附劑是一種基于抗體和抗原相互作用原理而實現(xiàn)高選擇性萃取的別離介質.將針對被測物的特異性抗體固定在載體上,制得免疫吸附劑.多克隆抗體可通過把抗原或半抗原擬載體蛋白結合物注入實驗動物體內產生,單克隆抗體那么必須通過培養(yǎng)某種特定的雜交瘤細胞來制備.前者成本較低,抗體成分復雜,專一性差；后者價格昂貴,抗體成分單一,專一性強.載體主要是瓊脂糖、纖維素和硅膠等生物惰性的材料.相比其它生物相容性別

8、離介質,ISs選擇性高,在蛋白質等生物大分子的別離純化方面具有獨特的優(yōu)勢.1.1.5 其它吸附型生物相容性別離介質聚二甲基硅氧烷Polydimethylsiloxane,PDMS作為商用的固相微萃取涂層材料,已被廣泛使用,有報道用于魚組織的原位采樣3.聚口比咯Polypyrrole,PPY是導電聚合物,通過電化學方法合成,有良好的生物相容性和導電水平,應用于血管組織工程、生物傳感領域,如PPY鍍在金屬外表,能改善金屬支架材料的生物相容性.聚乙二醇Polyethyleneglycol,PEG屬于水溶性高分子,在水中的界面自由能很低,有較好的抗血栓性,血液相容性良好.聚丙烯睛Polyacrylon

9、itrile,PAN用于別離生物體系亞微米級別的顆粒,在透析和超濾方面有廣泛的應用.在高通量透析治療中,能濾去低中分子量的蛋白質,是一種生物相容性優(yōu)良的聚合物.但聚乙二醇和聚丙烯睛萃取性能并不好,通常與其它別離介質結合使用.2.2 生物相容性膜膜是一種具有選擇性透過功能的非吸附型別離介質.應用最廣泛的生物相容性膜是高分子材料,主要由天然高分子材料與合成高分子材料兩大系統(tǒng)組成.多糖和纖維素是常見的生物相容性天然高分子.殼聚糖、甲殼素等多糖類高分子可生物降解,不容易導致蛋白質失活、變性,常作為藥物載體、硬組織修復材料使用,亦可用于固定酶、抗體等蛋白質.纖維素以其良好的組織相容性和血相容性,成為第一

10、代透析膜材料,包括再生纖維素如銅氨纖維素、皂化纖維素、粘膠纖維素以及纖維素衍生物如醋酸纖維素、羥甲基纖維素.與天然高分子膜相比,合成高分子膜具有更優(yōu)良的物理性能和化學穩(wěn)定性,廣泛用于人工器官、血液透析和藥物緩釋.聚碉、聚醍碉、聚芳醍碉、聚丙烯睛、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亞胺等都是常用的膜材料.高分子膜材料的外表改性是提升生物相容性的主要途徑,目前已成為生物醫(yī)用材料學科最活潑、最引人注目和開展最迅速的領域之一4.3生物相容性別離介質在樣品前處理中的應用3.1 生物相容性別離介質在固相萃取中的應用3.1.1 限進介質固相萃取技術RAM擬SPE商品化的固相萃取吸附劑如C8、C18、離子交換樹脂等的生物

11、相容性差,選擇性低.在富集分析物的同時,大量的基體和干擾物質也被富集,導致后續(xù)分析困難.蛋白質與吸附劑形成不可逆吸附,嚴重影響SPE材料的使用壽命.RAM能去除蛋白質、核酸和腐植酸等大分子的干擾,是理想的SPE吸附劑.RAM擬SPE柱通過柱切換裝置與分析柱連接,與高效液相色譜HPLC在線聯(lián)用5,6,RAM擬SPE以HPLC集樣品凈化、富集、別離、檢測于一體,是實現(xiàn)生物流體直接進樣、快速自動化分析的有效方法7.RAM擬SPE主要應用于生物體液的分析,涉及的樣品有牛奶、血液、血漿、血清、尿液等,測定對象主要是藥物及其代謝物.近年來,關于RAM擬SPE毛細管柱,包括填充柱8和整體柱9已有報道.其與毛

12、細管液相色譜cLC在線聯(lián)用,適于微量生物流體的直接進樣分析.富集倍數(shù)低和選擇性差是目前RAM存在的主要問題,需要開展新型RAM材料的研究.Wa等10在硅膠的內孔固定抗體,首次制備了免疫親和擬限進介質IA擬RAM,該材料對游離的熒光素有良好的選擇性,能在2s內到達吸附平衡且該時間段內根本不吸附與蛋白結合的熒光素,有望應用于藥物擬蛋白質相互作用的研究.3.1.2 分子印跡固相萃取技術MI擬SPE自1994年Sellergren首次報道在SPE中使用MIP材料以來11,分子印跡固相萃取技術開展迅速,并且已經實現(xiàn)商品化.相比RAM擬SPE,MI擬SPE能有效減少小分子物質對測定的影響,但抗大分子基體干

13、擾的水平并不顯著.RAM柱與MIP柱協(xié)同萃取是同時實現(xiàn)大分子排阻與小分子選擇性富集的有效途徑.文獻1214報道了限進介質擬分子印跡多維固相萃取的方法,即RAM擬SPE和MI擬SPE多柱在線聯(lián)用,適用于復雜樣品的痕量分析.研制對大分子具有限進作用的MIP即RAM擬MIP是提升MIP生物相容性的有效方法.Haginaka等15采用多步溶脹法制備MIP微球,并在聚合過程中參加1,2擬丙二醇單甲基丙烯酸酯和1,2擬丙二醇雙甲基丙烯酸酯,對微球表面進行親水修飾,首次制得RAM擬MIP,應用于血清、河水的直接進樣分析1521.如何對MIP外表進行親水修飾是制備技術的關鍵.最近Puoci等22使用甲基丙烯酸

14、環(huán)氧丙酯作為MIP的共聚單體,在聚合完成后用高氯酸處理,使外表的環(huán)氧基團開環(huán)生成鄰二醇,既獲得親水的外表,又防止了羥基對印跡效果的影響.RAM擬MIP應用前景廣闊,但生物樣品通常是富水樣品,而MIP水相選擇性較差,制約了RAM擬MIP的開展.研制具有水相印跡功能的MIP,并與RAM技術相結合是今后研究的主要方向.3.1.3 免疫親和固相萃取技術IA擬SPE基于抗體擬抗原特異性識別作用的免疫親和固相萃取技術,集凈化、富集于一體,適合于復雜生物樣品中大分子的別離純化以及小分子的痕量分析.主要分析對象有真菌毒素如黃曲霉素23、赭曲霉素24、藥物如克侖特羅25、獸殘農殘如苯基月尿類除草劑26和神經肽2

15、7等,涉及樣品有血液、尿液、腎臟、肝臟、肌肉、毛發(fā)以及植物組織.由于IA擬SPE的凈化水平強,后續(xù)分析簡單,通常與高效液相色譜、高效毛細管電泳在線聯(lián)用28,易于實現(xiàn)自動化.也有報道IA擬SPE與基質輔助激光解析電離飛行時間質譜MALDI擬TOF擬MS聯(lián)用2931,免去色譜別離過程,縮短分析時間.免疫吸附劑的高選擇性不利于IA擬SPE進行多對象的同時分析.文獻32,33采用三通閥串聯(lián)多根含有不同抗體的IA擬SPE柱,實現(xiàn)了單一樣品多成分的同時萃取.此外,制備多抗體的免疫吸附劑也是拓展IA擬SPE應用范圍的有效途徑34,35.目前,毛細管和芯片是IA擬SPE微型裝置的兩種主要形式,微型化的IA擬S

16、PE省時低耗,在微流體別離分析方面有較大的應用潛力36,37.3.2 生物相容性別離介質在固相微萃取中的應用3.2.1 限進介質固相微萃取技術RAM擬SPME文獻2,3842報道了一系列以限進介質作為SPME涂層材料的相關研究.主要有ADSC18和離子交換二醇硅膠Ionexchangediolsilica,XDS兩種RAM涂層,均可省去沉淀蛋白質的步驟,用于生物體液的直接萃取.ADS擬SPME與HPLC在線聯(lián)用,應用于血樣、尿樣中苯并二氮類藥物的分析38,38,42;XDS擬SPME與HPLC/MS聯(lián)用,分析全血中的血管緊縮素1,檢出險為8.5pmol/L40.這兩種涂層用于胰蛋白酶的消化物和

17、生物體液中縮氨酸的定性分析,在不需經其它純化處理的條件下,RAM擬SPME與納噴霧質譜在線聯(lián)用,檢出限到達50pmol/L41,方法快速靈敏,易于自動化,有望應用于蛋白質組學的研究.如何提升吸附容量是RAM在微萃取中應用中必須解決的問題,除了研制新型的RAM材料外,開展適宜的RAM擬SPME形式也是有效的方法.最近,Jarmalaviciene等43將RAM擬SPME小柱嵌入毛細管中,與區(qū)帶毛細管電泳CZE實現(xiàn)在柱聯(lián)用inline,不需要柱切換裝置,直接進樣分析牛血漿中的咖啡因,靈敏度比CZE方法提升1000倍.Lambert等44報道了基于RAM的攪拌棒吸附萃取技術RAM擬SBSE,RAM擬

18、SBSE與SPME探針相比,吸附容量大、平衡速度快,能防止攪拌器的競爭吸附,是RAM擬SPME技術的延伸.3.2.2 基于聚甲基丙烯酸擬乙二醇二甲基丙烯酸酯的管內固相微萃取技術PolyMAA擬EGDMA擬intube以SPMEFan等45用損甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷對石英毛細管進行硅烷化處理,然后通入聚合溶液MAA為單體、EGDMA為交聯(lián)劑、偶氮二異丁睛為引發(fā)劑、十二醇與甲苯為致孔劑,直接在毛細管內壁進行聚合,制得管內固相微萃取毛細管柱.管內固相微萃取與高效液相色譜4649、毛細管區(qū)帶電泳50,51、毛細管液相色譜以及加壓毛細管電色譜52在線聯(lián)用,直接進樣分析人體血液、尿液、唾液中的堿性

19、藥物.方法精密度良好,動態(tài)范圍大局部可達3個數(shù)量級或以上.由于該聚合物整體柱較強的抗干擾水平以及良好的化學穩(wěn)定性,在管內固相微萃取原位衍生化方面有較大的應用潛力53.3.2.3 免疫親和固相微萃取技術IA擬SPMEYuan等54采用戊二醛連接抗體和石英纖維用氨丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)劑處理,實現(xiàn)茶堿抗體在纖維外表的固定,首次制得免疫親和固相微萃取涂層,應用于尿液中茶堿的分析,省去繁瑣的前處理步驟和后續(xù)色譜別離過程.Lord等55,56用相同的方法在硼酸硅鹽玻璃棒外表固定苯并二氮類化合物的抗體,應用于加標尿樣中氟硝西泮的代謝物7擬硝基氟硝西泮56以及其它苯并二氮類藥物的分析55.與IA擬SPE技術相

20、比,IA擬SPME操作簡單,低耗省時,但方法線性范圍窄不超過2個數(shù)量級,富集水平差,需要更靈敏的后續(xù)檢測手段,這與涂層活性位點的密度和面積較小有關55.提升涂層有效面積和抗體的密度是制備技術亟需解決的問題.Queiroz等57用類似的方法把抗體固定在熔融石英毛細管內,制得固相微萃取小柱,與HPLC/MS聯(lián)用,分析血清中的氟西汀,檢測限達5pg/LRSD低于5%.商品化的抗體種類眾多,選擇范圍寬,因此IA擬SPME具有廣闊的應用前景.溶液的pH值與離子強度對抗體蛋白結構有較大的影響,是制約涂層萃取性能的兩個重要因素,不利于生物樣品的原位采樣.3.2.4 分子印跡固相微萃取技術MI擬SPMEMI擬

21、SPME結合了MIP的高選擇性與SPME易于聯(lián)用的優(yōu)勢,近年來備受關注.目前MI擬SPME裝置有3種形式：1纖維外表涂漬MIP.Koster等58首次報道了在SiO2纖維外表涂漬MIP,一次涂漬厚度達75pm,厚度的偏差小于10%.本研究組采用屢次涂漬的方法制備了MIP涂層,與高效液相色譜在線聯(lián)用,分析生物樣品中痕量的三嗪類除草劑59,60、四環(huán)素類抗生素61以及心得安類©以受體阻滯劑62,除草劑和抗生素檢出限均低于歐盟要求的最大限量,心得安檢測靈敏度滿足人體血液或血漿痕量監(jiān)測的要求.2管內MI擬SPME.Mullett等63首次報道管內MI擬SPME的研制,分析血清中的心得安,方法

22、檢出限為0.32mg/L,RSD<5.0%.這種MI擬SPME形式與高效液相色譜在線聯(lián)用時,解吸溶劑和色譜流動相通常較難匹配.3纖維狀MIP作為固相微萃取涂層.Turiel64與Djozan6567等各自報道了一種纖維狀MIP固相微萃取涂層的制備方法：以石英或玻璃毛細管為模具,通入聚合溶液,反響結束后用化學腐蝕或物理破壞的方法去除MIP外表的局部石英或玻璃,裸露出一定長度的MIP,制得纖維狀固相微萃取涂層.這種方法操作簡單,厚度容易限制,但由于涂層局部沒有底材支持,僅適用于具有一定韌性與硬度的MIP材料.受制備方法的限制,目前的涂層大局部是機械性能較好的MIP,如MAA擬EGDM

23、A共聚物.Prasad等6871報道一種溶膠擬凝膠制備方法,在聚甲基丙烯酸甲酯纖維外表涂布一層聚硅氧烷,MIP以聚合物刷的形式嫁接在聚硅氧烷外表,這種溶膠擬凝膠嫁接MIP的制備方法有望拓展MIP在SPME中的應用.MIP涂層的高選擇性通常只在非極性溶劑中表現(xiàn)出來,目前大多數(shù)MIP涂層只用于萃取經有機溶劑提取后的樣品,限制了MI擬SPME的應用,因此研制具有水相印跡效果的MIP涂層非常必要,使用能與模板分子存在非氫鍵作用(如疏水作用、越兀作用)的單體是有效的方法.最近,Li等72采用溶膠凝膠法,以苯基三甲氧基硅烷為功能單體,制備的MIP能在水相中識別對多澳聯(lián)苯醍.3.2.5 其它生物相容性固相微

24、萃取涂層聚毗咯(PPY)涂層是最早用于活體采樣的涂層材料73,已有報道PPY擬SPME探針插入老鼠與狗的靜脈中進行采樣7375.PPY涂層為多孔吸附介質,結合位點有限,生物體中內源性的小分子化合物與目標物存在競爭吸附,嚴重影響分析結果,導致方法線性范圍窄.與PPY相比,PEG與C18鍵合硅膠結合的固相微萃取涂層較薄,傳質速度快,萃取容量大,是更理想的生物相容性涂層7577.文獻78,79報道了一種基于聚丙烯睛(PAN)的固相微萃取涂層：將C18鍵合硅膠顆粒分散于PAN的DMSO溶液中形成漿狀物,涂漬在不銹鋼絲外表.研究說明,該涂層對蛋白質的吸附量低于RAM、PPY涂層,對安定等藥物的萃取水平分

25、別提升了50和90倍.PAN涂層的生物相容性良好,而且能夠根據(jù)分析對象的需要選擇適當?shù)奈絼┙Y合使用,在體內藥物分析領域有較大的應用潛力.生物相容性涂層研究的發(fā)展,使得SPME技術可以實現(xiàn)活體采樣、在線別離檢測,有望成為臨床分析的新手段75.選擇性高、富集水平強的生物相容性涂層的研制和應用是今后SPME技術開展的一個方向.3.3 生物相容性別離介質在微透析中的應用3.3.1 微透析技術(Microdialysis,MD)微透析技術利用滲析原理實現(xiàn)采樣.透析膜內外存在濃度梯度,透析膜外的分析物濃度高于膜內,蛋白質等大分子被透析膜截留在膜外,小分子通過擴散進入透析管,并被透析管內持續(xù)流動的灌流液不

26、斷帶出,從而到達活體組織原位采樣的目的,原理如圖2所示80.圖2微透析示意圖80Fig.2Schematicofmicrodialysis80微透析膜與生物體液、組織直接接觸,是微透裝置的關鍵部分,膜材料的生物相容性、孔徑和尺寸是影響微透析萃取效率與回收率的重要因素.目前,國際上能生產微透析膜的公司不多,如瑞典的CMA、美國的BAS及日本的EiCOM公司.常見的膜材料有聚碉、聚醍碉、銅紡膜、聚丙烯睛、聚酰胺、聚碳酸酯以及碳酸脂與醍的共聚物等.膜與小分子及蛋白質相互作用是兩個不容無視的問題.膜材料對待測物的吸附會影響微透析探針回收率的穩(wěn)定性,過多的吸附會造成探針效能在連續(xù)實驗過程中降低.如聚碉膜

27、有一定的疏水性,容易吸附小分子溶質,造成膜污染.目前微透析膜吸附蛋白質的問題仍然存在,聚合物的共混和共聚是進行膜改性的兩種途徑.2擬甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(2擬methacryloyloxyethylphosphorylcholine,MPC)聚合物生物相容性良好,與聚碉共混形成聚合物合金,制得的中空纖維膜,能有效減少蛋白質的吸附81.MPC82、PEG83及聚乙烯酰胺(Poly(ethyleneimine)84接枝共聚在透析膜上,能提升材料的生物相容3.3.2微透析技術應用進展微透析技術是一種將灌流技術與透析技術相結合的新型的生物采樣技術,主要應用于生物活體采樣,包括動物體和人體85,出現(xiàn)于20世紀70年代