《生物化學(xué)》課程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)驗(yàn)指導(dǎo)供口腔、護(hù)理、藥學(xué)各專業(yè)用（第一版）佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院編2008年6月編寫說明分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)是一門集生物化學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)、科研探索和醫(yī)學(xué)應(yīng)用于一體的全新的綜合性實(shí)驗(yàn)課程。其實(shí)驗(yàn)技術(shù)反映現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展趨勢。分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要組成部分，是醫(yī)學(xué)各本科專業(yè)的專業(yè)基礎(chǔ)必修課。課程內(nèi)容包括分子醫(yī)學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及綜合和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)等部分。課程的主要目的一是強(qiáng)化基礎(chǔ)知識教育，突出基本技能訓(xùn)練，是使學(xué)生能掌握分子醫(yī)學(xué)的經(jīng)典理論和基本實(shí)驗(yàn)，二是培養(yǎng)學(xué)生綜合性素質(zhì)，開發(fā)學(xué)生的科研潛能和創(chuàng)新思維。開設(shè)分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)的目的在于：1、驗(yàn)證和

2、鞏固理論知識，加深對理論知識的全面理解，加強(qiáng)記憶。2、通過實(shí)驗(yàn)，掌握分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)的基本操作技術(shù)，掌握層析法,電泳法,分光光度法和生物大分子制備等常用的實(shí)驗(yàn)方法的基本原理，熟悉分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般知識。3、培養(yǎng)學(xué)生觀察、比較、思考及分析問題和解決問題的能力，使學(xué)生具備一定的動手操作能力、創(chuàng)新能力培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真工作態(tài)度及理論聯(lián)系實(shí)際、實(shí)事求是的工作作風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)11個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目涵蓋了分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)中沉淀、離心、層析、電泳、分光光度測定等分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本方法，可依實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間作合理組合實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和教學(xué)安排適時(shí)開課。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1 實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和相關(guān)理論知識，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

3、原理、預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)，計(jì)劃安排實(shí)驗(yàn)工作時(shí)間。2 穿白大衣準(zhǔn)時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，保持實(shí)驗(yàn)室整潔安靜，不得談笑和大聲說話，不準(zhǔn)做與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的事情。3 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)持“三嚴(yán)”作風(fēng)態(tài)度嚴(yán)謹(jǐn)、思維嚴(yán)密、操作嚴(yán)格。實(shí)驗(yàn)中認(rèn)真、仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)過程中的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果，及時(shí)如實(shí)的做好原始記錄。實(shí)驗(yàn)失敗須重做。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析，寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告，交指導(dǎo)教師批閱。4注意安全，不得擅自離開。使用易燃、易爆、有毒試劑和材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，防止火災(zāi)、中毒、污染、觸電等事故發(fā)生，一旦發(fā)生，果斷處理并立即報(bào)告教師5愛護(hù)公物，防止損壞，若有損壞及時(shí)報(bào)告原因并登記。公用儀器就原處使用，了解使用方法

4、及遵守操作規(guī)程，使用后必須在儀器登記本上登記并簽名。公用試劑就近量取、用畢隨時(shí)放回原處。要節(jié)約水、電、煤氣及試劑藥品6實(shí)驗(yàn)結(jié)束，洗凈器材，清整實(shí)驗(yàn)室，打掃衛(wèi)生，檢查門、窗、水、電和煤氣的安全。實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)室基本知識和技術(shù)（5）實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)濃度測定（雙縮脲法）（21）實(shí)驗(yàn)三醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)（23）附：電泳技術(shù)（27）實(shí)驗(yàn)四血漿清蛋白的分離純化與鑒定（35）附：層析技術(shù)（37）實(shí)驗(yàn)五胰島素及腎上腺素對血糖濃度的影響（45）實(shí)驗(yàn)六脫氧核糖核酸（DNA的提取及成分鑒定（48）實(shí)驗(yàn)七質(zhì)粒DNA提取與純化（51）實(shí)驗(yàn)八DNA重組質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（54）實(shí)驗(yàn)九凝集試驗(yàn)（61）實(shí)驗(yàn)十肝功能組合實(shí)驗(yàn)

5、（65）附1：血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定附2：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）實(shí)驗(yàn)十一免疫血清的制備（71）實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)室基本知識和技術(shù)(Thebasicknowledgeandtechnologyoflab【目的和要求】1 .掌握各種基本的生化技術(shù)、常用儀器的分類、使用及注意事項(xiàng)2 .熟悉生化實(shí)驗(yàn)室規(guī)則3 .清點(diǎn)洗刷實(shí)驗(yàn)用具。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1 .實(shí)驗(yàn)室規(guī)則2 .生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)各種基本技術(shù)3 .722型分光光度計(jì)的使用4 .實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告【儀器、設(shè)備】1 .燒杯2 .試管3 .刻度吸量管4 .離心管5滴管6攪棒7 .槍式移液器及其配適吸頭8 .混勻器9 .恒溫水浴箱10 .離心機(jī)11 .7

6、22型分光光度計(jì)，721型分光光度計(jì)第一部分基本知識與操作一、常用的玻璃儀器（一）分類：常用的玻璃儀器分類有量器和容器，“量器”主要包括：量筒、量杯、容量瓶、吸管等?！叭萜鳌敝饕袩?、燒杯、試管、試劑瓶、離心管等。量器有量入式和量出式兩種形式?！傲咳胧健庇谩癟C”、“E”、“入”表示，定量標(biāo)記由下往上遞增，測量注入量器中的液體；“量出式”用“TD”、“A”表示；定量標(biāo)記由上而下遞增；測量從量器中傾出的液體。（二）玻璃儀器的洗滌、干燥1、洗滌液：洗潔精，肥皂水，洗衣粉。玻璃儀器專用洗滌液：主要成份為中性稀氯氧化劑，上海日化研究所出品2、洗滌的要求與步驟：要求：潔凈的玻璃器皿表面應(yīng)不掛任何水滴。

7、步驟：不凈的器皿T洗衣粉或肥皂水刷洗自來水沖凈達(dá)到要求？是浸入洗液（數(shù)/*時(shí)至過夜）I自來水沖凈蒸儲水涮洗23次1（其目的是去除自來水中的雜質(zhì)，故應(yīng)少量多次，全面充分）I烤干或晾干、備用注息：對使用過的儀器應(yīng)養(yǎng)成及時(shí)清洗的習(xí)慣，特別是血液分析時(shí)用以吸取血液樣本的吸管，用過后應(yīng)當(dāng)立即用水將所沾的血液沖去，否則放置過久，血液干燥硬結(jié)，就很不容易清除。新購置的玻儀：合成洗滌劑洗刷一一0.2mol/L鹽酸浸泡（去除游離堿）26小時(shí)一一自來水沖洗一一DS沖洗23次。一般容器：如試管、燒杯、三角燒瓶等。流水沖洗一一合成洗滌劑洗刷一一自來水多次沖洗一一DS沖洗。容量分析儀器：如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。

8、使用后立即浸泡水中。自來水多次沖洗一一瀝干一一銘酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)一一自來水多次沖洗一一DS沖洗23次。（不能刷洗）比色杯：用畢立即用DS反復(fù)沖洗。洗不凈時(shí)，用鹽酸沖洗，再用自來水沖洗和蒸儲水沖洗。避免用堿液或強(qiáng)氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙紙?jiān)嚥?、玻璃儀器的干燥一般的玻璃儀器均可洗凈后倒置架上，讓其水分蒸發(fā)自然干燥，如需迅速干燥者應(yīng)按儀器的不同類型按下述不同方法處理：試管、離心管、燒杯、燒瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100105C烘烤少量儀器如需急用也可在電爐上或酒精燈上烘烤。烘烤時(shí)應(yīng)將器皿時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)動，務(wù)使受熱緩慢且均勻，并將管口（或杯口）傾斜向下，以便水蒸氣冷凝成水滴，順口流出，不致使水滴接觸

9、烘熱了的器壁而使儀器爆裂。使用電吹風(fēng)干燥一般玻璃儀器也很便利常用。下列玻璃儀器應(yīng)避免烘烤：各種計(jì)量玻儀：不可烘烤，自然干燥（容易造成器壁變形而致容量不準(zhǔn)）。常用定量吸管很難自然干燥，可在80至100C烘箱烤干。厚壁玻儀（研缽、量筒比色杯：等）及結(jié)構(gòu)復(fù)查的玻儀：易在烘烤時(shí)發(fā)生破裂，不可烘烤，自然干燥。（自然干燥適應(yīng)于不急于使用和各種計(jì)量玻儀；烘烤干燥除結(jié)構(gòu)復(fù)雜、厚壁及計(jì)量玻儀外，均可。溫度在120C,刻度吸管溫度應(yīng)小于100C。）二、常規(guī)操作技術(shù)及注意（一）移液操作用于移液操作的有奧氏吸管、移液管、刻度吸管三種吸量管及槍式移液器。三種吸量管比較奧氏吸管移液管刻度吸管特點(diǎn)管中有一球形膨起管中有棱形

10、膨出直筒狀只什-個刻度只什-個刻度有多個刻度準(zhǔn)確度最高次之再次之應(yīng)用適用于吸取標(biāo)準(zhǔn)液吸取標(biāo)準(zhǔn)液生化實(shí)驗(yàn)中廣泛使用或粘稠性血標(biāo)本管尖液吹不吹吹（完全流出式）停留15秒不吹（不完全流出式）流速愈慢愈好慢流出快流出1、吸量管的使用吸量管的選擇： 在一次完成轉(zhuǎn)移的前提下，應(yīng)選用容量較小的吸量管 對于同一次實(shí)驗(yàn)中同一種試劑的移取，應(yīng)選用同一支吸量管操作（見圖11） 用洗耳球?qū)⒁后w吸至超過標(biāo)線 移開洗耳球，迅速用食指壓緊管口 必要時(shí)將管尖端外圍拭凈 調(diào)液面至標(biāo)線 放開食指，使液體流入容器 將最后液滴沿器壁而下或吹出讀數(shù)（見圖12） 吸量管保持垂直 視線與液面應(yīng)水平 管中液面與刻度線應(yīng)呈切線使用注意：持管方

11、式；管尖插入液面的深度；吸液；讀數(shù)（認(rèn)刻度，準(zhǔn)確讀數(shù)，注意無色液與有色液讀數(shù)之區(qū)別）；放液（吹與不吹之分，注：對于刻度由上至下的吸量管應(yīng)盡量使用上端刻度管尖殘液是否需吹出，看清標(biāo)記）。2、槍式定量移液器的使用搶式移液器的結(jié)構(gòu)（見圖3）（1.液體吸放鈕2.體積選取鈕3.體積、顯示4.槍頭排放鈕5.槍頭排放器6.槍頭接嘴）其內(nèi)部柱塞分2段行程，第1檔為吸?C第2檔為放液，手感十分清楚。種類：固定式和可調(diào)式規(guī)格：0.510000U1不等*重1-1使用嚶量者的姿勢圖1-2定量稱液管的讀效方法圖】-3枇式移液器的結(jié)構(gòu)操作(見圖14) 正式使用之前，要連續(xù)按動數(shù)次，使管內(nèi)空氣同工作環(huán)境空氣交換，保持管內(nèi)工

12、作負(fù)壓恒定 調(diào)體積選取鈕至所需值，在移液管下端插上塑料吸嘴，輕輕扭轉(zhuǎn)以保證所密 垂直持握槍式移液器外殼，按下大拇指至第1檔 將吸嘴垂直地浸入所需取樣液內(nèi)，深度為23毫米，徐徐松開大拇指，使之返回原來位置。 停留12秒，平緩地將移液管取出，同時(shí)應(yīng)避免吸嘴與任何東西碰撞。 將吸液嘴移至加樣容器壁上，緩慢按動按手至第一檔，將液體排了。停留1秒(粘性較高的溶液停留時(shí)間可長些)。緊接著再將按手按至第二檔，排出吸嘴里的全部液體。(要求動作連)。 完全排出液體后，小心地連同吸嘴沿著容器壁向上滑動取出。 再放松按手，使之返回原來位置，即完成一次操作。如需移取另一樣品，按槍頭排放鈕，更換槍頭注息： 移液器是精密

13、量取，不允許將移液器直接與液體接觸。 不使用時(shí)也應(yīng)插上塑料吸嘴，以免液體或染色液吸入移液器內(nèi)，導(dǎo)致阻塞。 移取過程中應(yīng)控制速度，力度。 塑料吸嘴可經(jīng)受100c高溫高壓消毒。(二)混勻操作(1)旋轉(zhuǎn)法：手持容器，使溶液作離心旋轉(zhuǎn)(2)指彈法：一手執(zhí)試管上端，另一手輕彈試管下部，：使其中液體作渦旋運(yùn)動。(3)攪動法：使用玻璃棒攪邊；多用于溶解燒杯中的固體?；靹蚱鞣ǎ簩⒃嚬苤糜诨靹蚱鞯恼駝颖P上，逐漸用力下壓，使內(nèi)容物旋轉(zhuǎn)。(5)倒轉(zhuǎn)混勻：適用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞離心管等。操作時(shí)，將容器反復(fù)倒轉(zhuǎn)。試管內(nèi)的液量太多，也可利用倒轉(zhuǎn)混勻法，外面包以玻璃紙塞住管口，然后用手指按住橡皮塞將試管

14、反復(fù)倒轉(zhuǎn)，溶液即可充分混勻。（6）吸管混勻法：用吸管將溶液反復(fù)吸吹數(shù)次，以達(dá)到混勻的目的。（三）加熱與保溫操作1、加熱（見圖15;圖16）2、保溫使用恒溫水浴箱，調(diào)節(jié)溫度設(shè)定鈕至需要的溫度。水浴箱中水要足量。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)隨時(shí)監(jiān)測溫度，并及時(shí)調(diào)節(jié)。他下匯沁叟等1-4檢式移液器操作圖直接加熱水浴加熱圖1-5直接加熱（曾口切勿對著自己或他人）圖1-6水浴加熱（加熱用水要適量）（四）離心操作離心沉淀法：當(dāng)顆粒小而不均一，沉淀粘稠或容積小又需精確定量時(shí)，往往采用離心沉降法。1、離心前檢查：取出所有套管，起動空載的離心機(jī)，看是否轉(zhuǎn)動平穩(wěn)。檢查套管有無軟墊，是否完好，內(nèi)部有無異物。離心管與套管是否匹配。2、

15、平衡：將一對離心管放入套管，置于天平兩側(cè)，用滴管較輕一側(cè)的離心管與套管之間加水至兩側(cè)平衡（離心管及其內(nèi)溶液量不能差別過大）3、離心：將等重的兩管置于離心機(jī)中的對稱位置，調(diào)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)鈕，逐漸增加轉(zhuǎn)速至所需值，計(jì)時(shí),離心結(jié)束后，將套管中的水倒凈，所有套管放回離心機(jī)中。4、使用注意根據(jù)需要選擇合適的轉(zhuǎn)速、時(shí)間；選擇合適的離心管，做到對稱平衡；啟動時(shí)應(yīng)由低速慢慢加至所需速度離心結(jié)束關(guān)機(jī)后，應(yīng)讓其自然停止，不可用手或其它物品強(qiáng)迫停止（五）點(diǎn)收儀器根據(jù)儀器清單，逐項(xiàng)查點(diǎn)是否完好（如有缺損向教師聲明及時(shí)補(bǔ)充更換）第二部分分光光度法當(dāng)光線通過透明溶液介質(zhì)時(shí)，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透過，所以光線射出溶

16、液介質(zhì)之后光能被減少。對溶液來說，溶液呈現(xiàn)不同的顏色，是由于溶液中的質(zhì)點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光所引起的。如果各種顏色的透過程度相同，這種物質(zhì)就是無色透明的，若只讓一部分波長的光透過，其它波長的光被吸收，則溶液就呈現(xiàn)出透過光的顏色，并與被吸收的光的顏色完全互補(bǔ)。任何一種溶液，對不同波長的光的吸收程度是不相等的，一些有色物質(zhì)可以選擇性地吸收一部分可見光區(qū)的光的能量而呈現(xiàn)不同顏色，一些物質(zhì)卻能特征性地選擇吸收紫外線的能量。物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長的光可形成特定的吸收光譜。由于物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且在一定條件下其吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比，所以可利用物質(zhì)的特定吸

17、收光譜對其進(jìn)行定性和定量分析。分光光度法是利用各種物質(zhì)所具有的這種吸收特征所建立起來的分析方法。一、分光光度分析法的基本原理勞伯比爾定律(Lambert-Beerlaw)是討論吸收光能與溶液濃度和溶質(zhì)層厚度之間關(guān)系的基本定律，是分光分析的理論基礎(chǔ)。勞伯一比爾定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體圖27光線遞過幫版介質(zhì)示更圖(一)Lambert氏定律一束單色光通過透明溶液介質(zhì)時(shí)，光能被吸收一部分，被吸收光能的量與溶液介質(zhì)厚度有一定比例關(guān)系(見圖21)。表達(dá)式為(1)log4=kL這里I0為入射光強(qiáng)度I為通過溶液介質(zhì)后的光強(qiáng)度L為溶液介質(zhì)的徑長(pathlength)k為吸光系數(shù)(ab

18、sorptioncoefficient)(g-cm-1)(二)Beer氏定律以溶液介質(zhì)濃度變化代替溶液介質(zhì)厚度的改變，光能的吸收與濃度改變有類同的關(guān)系，即一束單色光通過溶液介質(zhì)時(shí)，光能被溶液介質(zhì)吸收一部分，吸收多少與溶液介質(zhì)濃度有定的比例關(guān)系。(2)log-r=kC得出下式：這里C(Concentration)為溶液介質(zhì)的濃度(g-L-1)將Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即和(2)合并為令A(yù)=l/亍T=y*UHAS-lOgT或A=kCLHEiEiEf(4)式中A(Absorbance)為吸光度T(Transmittance)為透光度.(4)式也可表達(dá)為A=eCb式中e(epsilo

19、n)稱之摩爾吸光率(Molarabsorptivity)(mol/L-1cm-1)C(concentration)濃度(mol/L)b(pathlength)溶液樣品的長度cm(或比色皿內(nèi)徑長cm)(5)式為lambert-Beer定律的物理表示式，其含義為一束單色光通過溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。此式為分光分析法的基本計(jì)算式。如果實(shí)驗(yàn)中溶液厚度b=lcm則A=eC透光度與溶液濃度的關(guān)系透光度苛溶液濃度的關(guān)系吸光度與港灌費(fèi)度的關(guān)系t方格里標(biāo)紙)(半對數(shù)型標(biāo)舐1 “f方格空株紙)® 2-2吸叱度(A)、透光度(T和溶液液度(C)的關(guān)系圖22表明，在溶

20、液介質(zhì)厚度一定的情況下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介質(zhì)濃度(C)之間的關(guān)系。摩爾吸光率(£)實(shí)際上是物質(zhì)在單位濃變和單位厚度下對入射光的吸光度，在一定波長下，e越大表示物質(zhì)對光的吸收越強(qiáng)。二、分光光度法的定性定量方法許多對光有吸收的物質(zhì)可以直接用分光光度法進(jìn)行定量分析：一些對光，包括紫外、可見或近紅外都無吸收的物質(zhì)亦可通過和某些化學(xué)試劑作用而呈色，在一定的反應(yīng)條件下和一定的濃度范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺(對光吸收的程度)和該溶液中顯色物質(zhì)的濃度呈正比。(一)測定波長的選擇表2-2越定波長的選擇待謝溶液顏色選用分光波長范23(nm)I,待測溶液顏色i選用分光波長范圍(nm)綠i400

21、420；紫青540-560綠帝黃一430-44A,藍(lán)570-600«440-450二一.|藍(lán)若綠600-630悔紅_450-480；廣綠帶董630760紅490-5301使用分光法測定溶液中物質(zhì)的含量，首先要選擇最適單色波長，因?yàn)橹挥幸阅鼙蝗芤何盏墓馐鳛槿肷涔獠拍芊螸ambert-Beer定律。測定有色物質(zhì)時(shí)，不同顏色的待測溶液，則應(yīng)選擇不同波長的單色光束。在分光光度計(jì)上，單色光波長的選擇原則一般是使被測溶液的單位濃度的吸光度變化最大，同時(shí)還要具有最小的空白及干擾讀數(shù)，借以獲得最高的靈敏度和正確性。最理想的辦法是對每種物質(zhì)的測定都應(yīng)先傲它的光譜吸收曲線及有關(guān)干擾物的吸收曲線，根

22、據(jù)這些光譜吸收曲線來選擇最佳測定波長。表22可供波長選擇的參考。（二）分光光度法定量方法1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物含量最適波長選定以后可進(jìn)行溶液物質(zhì)含量的測定。通常都采用對比測定法，即以巳知精確含量的待測物質(zhì)的溶液作為參考標(biāo)準(zhǔn)物下、同時(shí)進(jìn)行測定，讀取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度 質(zhì)和未知物質(zhì)是同一物質(zhì)，其摩爾吸光率（Cs）和未知待測樣品（Cx）用同一方法，在同一條件（As）和未知含量的樣品吸光度（Ax）,由于標(biāo)準(zhǔn)物（巨）相同和進(jìn)行測定用的比色皿內(nèi)徑長（b）相同即bs=bx,根據(jù)A=eCb式，可得到As=Cs換算成下式Ax=Cx式中Cs是標(biāo)準(zhǔn)管中物質(zhì)的實(shí)際含量，是標(biāo)準(zhǔn)液的濃度與實(shí)際用量的乘積；Cx是測定管中物

23、質(zhì)的實(shí)際含量。還應(yīng)換寫到法定單位mmol/L、mg/m1。2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)的溶液（至少五個）按測定管同樣方法處理顯色，在選定的波長分別測定各管的吸光度（A）,以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后在同樣條件下進(jìn)行測定時(shí)，測定被測溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可找出相應(yīng)的濃度。根據(jù)LambertBeer定律，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度呈直線關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線是這種直線關(guān)系的描述，一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測定物濃度的一半到二倍之間，并使吸光度在0.051.0范圍內(nèi)為宜。還須注意：曲線制作與測定管的測定應(yīng)在同一儀器上進(jìn)行，

24、由于曲線的建立與實(shí)驗(yàn)室當(dāng)時(shí)的條件如溫度，濕度和氣壓及電壓穩(wěn)定性等有關(guān)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線常因各種變化而需校正或重做。3、摩爾吸光率e求取測定物濃度當(dāng)濃度為1M/L時(shí)，溶液厚度為1cm,吸光率用£表示，在已知測定物的£,則可根據(jù)下式求得測定物的物質(zhì)濃度。此計(jì)算法常用于紫外吸收，如核甘酸溶液含量測定，如UTP在262nm具有最大吸收峰，利用已知UTP在262nm時(shí)的摩爾吸光率e,讀取待測UTP溶液吸光度A,即可求出該UTP濃度。二種以上被測物的混合液，也可利用不同e進(jìn)行定量測定。例如a,b兩種物質(zhì)在波長入1時(shí)，摩爾吸光率分別為£a1和eb1:,在波長入2時(shí)摩爾吸光率分別為&

25、#163;a2和eb2,a和b混合的溶液在入1時(shí)吸光度為Al,在入2時(shí)的吸光度為A2（圖23）,各自濃度分別為Ca和Cb,則A)=calCa+電CbA產(chǎn)ta3Ca+eb2cb解上式,得%b兩物濃度_&-*3ACa=-飛一一工EAitb)-Wtlbs如有三種以上成分的混合液，也可通過三種不同波長情況下的吸光度，以各自特有的£值，依據(jù)三元一次方程，同樣可求出未分離的三種混合物的各自濃度-'（三）、物質(zhì)的定性分析以不同波長的單色光作為入射光，測定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波長為橫軸，各相應(yīng)的吸光度為縱軸作圖，可得到溶液的吸收光譜曲線。吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征性曲線

26、，它和分子結(jié)構(gòu)有嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系故可作為定性分析的依據(jù)。不同的物質(zhì)，分子光度A結(jié)構(gòu)不同，其吸收光譜曲線也有其特殊形狀（圖24）。圖2-4維生素B|工水溶液的吸收光譴在吸收光譜中，往往可以找到一個或幾個吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長（入max）。物質(zhì)不同，它們的波長（nm）最大吸收波長也往往不同，圖14為維生素B12溶液的吸收光譜曲線。物質(zhì)用分光分析定性主要依據(jù)吸收光譜存在的特征吸收。比較吸收光譜曲線，在相同情況下，吸收光譜曲線不同，表明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，因?yàn)椴煌奈镔|(zhì)有各自的特征性曲線。如ATP和GTP都屬于核甘酸，它們的溶液在紫外光區(qū)均有吸收，但由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不很一樣，它們的吸收光譜就

27、有差別。需要注意的是在不同條件（如選擇不同溶劑）下，即使是同一物質(zhì)也可呈現(xiàn)不同的吸收光譜。比較最大的吸收波長。不同的物質(zhì)可有不同的最大吸收波長（kmax）。如ATP、GTP、CTP和UTP的入max分另為259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax可作為物質(zhì)定量測定的最適波長，此時(shí)測定靈敏度最高。有些物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，可產(chǎn)生相同的入max,但它們的吸收系數(shù)都不一致，可據(jù)此鑒別之。比較吸光度比值。可根據(jù)物質(zhì)兩個或幾個不同波長的吸光度比值來鑒別不同的物質(zhì)，同時(shí)也可檢查物質(zhì)的純度。如DNA溶?夜kmax為260nm。在260nm的吸收度和在280nm的吸收度比值為1.8。但溶液中混進(jìn)了

28、蛋白質(zhì)，則比值會降低（蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收）。三、分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)與使用分光光度計(jì)的類型很多，最常用的是可見分光光度計(jì)和紫外一可見分光光度計(jì)。各種類型的分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和原理基本相同，一般包括光源、單色器、比色杯、檢測器和顯示器幾大部分。光源-一單色器-鍬縫吸收杯一一檢測器f顯示器鹵鴇燈濾光片玻璃杯將光信號檢流計(jì)氫燈棱鏡石英杯轉(zhuǎn)換為電信號微安表光柵（光電管和數(shù)字顯示器光電倍增管）圖工用校度嚴(yán)塵單色光B92光度詞或分比光;度“結(jié)構(gòu)峽那（一）光源一個良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高、光亮穩(wěn)定、光譜范圍廣和使用壽命長等特點(diǎn)?？梢姽夥止夤舛扔?jì)常用的光源是采用穩(wěn)壓調(diào)控的鴇燈（tungstenla

29、mp）,能發(fā)射出350nm2500nm波長范圍的連續(xù)光譜，適用于340-900nm范圍的光源?，F(xiàn)在常用的鹵鴇燈。紫外光光度常用氫燈（hydrogenlamp）作光源，其發(fā)射波長的范圍為150nm400nm。它適用于做200-360nm的紫外分光分析。（二）單色器將來自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。分光光度法測定某一物質(zhì)的吸光度需要在某一特定波長下進(jìn)行，單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長范圍的單色光。在實(shí)際工作中欲選擇出單個某波長的光線是困難的。所謂單色光是指在此波長有最大發(fā)射,而在相鄰較長和較短波長范圍內(nèi)的發(fā)射能量較少而言。單色光的波長范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，測量

30、的結(jié)果愈可靠。單色器可分為濾光片、棱鏡和光柵。濾光片可分為吸收濾光片、截止濾光片、復(fù)合濾光片和干涉濾光片。棱鏡是用玻璃或石英材料制成的一種分光裝置。其原理是利用光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，光的波長不同在棱鏡內(nèi)的傳播速度不同，其折射率不同而將不同波長的光分開。見圖24通過單色光器的發(fā)射光的強(qiáng)度可能過強(qiáng)也可能過弱不利于進(jìn)一步檢測。狹縫是由一對隔板在光通路上形成的狹縫。通過調(diào)節(jié)狹縫的大小來調(diào)節(jié)入射單色光強(qiáng)度并使入射光形成平行光線，以適應(yīng)檢測器的需要。光電比色計(jì)的狹縫是固定的,而光度計(jì)和分光光度計(jì)的狹縫大小是可調(diào)的。（三）比色杯比色杯又吸收杯，是光度測量系統(tǒng)的最重要部分之一。在可見光范圍內(nèi)測量時(shí)選用

31、光學(xué)玻璃吸收杯，在紫外線范圍內(nèi)測量時(shí)要選用石英吸收杯。比色杯的光徑0.110cm，一般為1cm。注意保護(hù)比色杯的質(zhì)量是取得好的分析結(jié)果的重要條件之一。不得用粗糙、堅(jiān)硬物質(zhì)接觸吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光學(xué)面；用后要用水及時(shí)沖洗，不得殘留測定液，尤其是蛋白質(zhì)和核酸溶液。（四）檢測器硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來作為受光器，將通過比色杯的光信號轉(zhuǎn)變成電信號。進(jìn)一步再用適當(dāng)?shù)姆椒y量所產(chǎn)生的電流。（五）顯示器顯示器是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。常用的顯示器是有檢流計(jì)、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器。四、幾種常用的國產(chǎn)分光光度計(jì)（一）721型分光光度計(jì)該機(jī)光譜范

32、圍在360800nm（可見光區(qū)），該機(jī)靈敏度較高，而且結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，可用于有色物質(zhì)溶液的測定。1、721型分光光度計(jì)光路圖和外形圖光源打光電Bill根利F 1 .波長選擇鈕2J0”電位鈕3.TOO"電位鈕4.比色杯拉桿5.靈敏選擇鈕6.電源開關(guān)7.電源指示燈8.睛箱血9,讀數(shù)表10-波長讀數(shù)窗2 .使用方法(1)接通電源.打開機(jī)器開關(guān)，打開箱像,預(yù)熱10分鐘；(2)將空白液或?qū)φ找?往往是溶解測定物質(zhì)的溶劑)及測定液分別裝入比色杯(3/4體積并用軟紙擦清外型,放入樣品室內(nèi)。(3)調(diào)節(jié)電流計(jì)上零點(diǎn)調(diào)節(jié)器,使讀數(shù)盤上指針的吸光度為8或透光率為。，謖節(jié)測定所用波長，(4)蓋上箱蓋,光

33、徑開關(guān)自動打開。轉(zhuǎn)動光量調(diào)節(jié)器使空白對照管的吸光度為0,或透光率為100%,待讀數(shù)指針穩(wěn)定后,逐步拉出樣品套滑桿，通過讀數(shù)的指針，讀取測定管上的吸光度e有時(shí)需調(diào)節(jié)靈敏度開關(guān)，才能正確讀得吸光度。此時(shí)應(yīng)重新轉(zhuǎn)動零點(diǎn)調(diào)節(jié)器至吸光度為鞏(5)讀物完畢,打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈。(二)72-2型分光光度計(jì)該機(jī)光度范BI在360-800nm,將用單光束、衍射光柵光學(xué)系統(tǒng).靈敏度高中1.72- 2型分光光度計(jì)光路圖例外形圖對££大器1 .敬字顯示器2.消光零旋鈕3.選攆開美機(jī)吸光度調(diào)斜率電位器工洗度旋鈕6.光源室7.電源開關(guān)8.波長手兼見波長刻度窗10.擅樣架拉手11.

34、100%T旋鈕12.0%T旋鈕13.靈敏度調(diào)節(jié)箕鈕14.干燥器2、使用方法開啟電源，指示燈亮，選擇開關(guān)置于“T”，波長調(diào)置測試用波長。儀器預(yù)熱20分鐘。打開試樣室蓋（光門自動關(guān)閉）。調(diào)節(jié)“0”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”蓋上試樣室蓋，將比色皿架處于蒸儲水校正位置，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率“100%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”。將選擇開關(guān)置于“A”。調(diào)節(jié)消光零旋鈕，使得數(shù)字顯示為“000”，然后將被測樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度的值。如果大幅度改變測試波長時(shí)，在調(diào)整“0”和“100%”后稍等片刻，（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新

35、調(diào)整“0”和100%即可工作。每臺儀器所配套的比色皿，不能與其它儀器上的比色皿單個調(diào)換。換一波長測試時(shí)，應(yīng)將選擇開關(guān)置“T”，重復(fù)（2）和（3）操作。測試完畢，關(guān)閉開關(guān)，電源，將比色皿沖洗干凈。(三)UV-75-4型紫外分光光度計(jì)1、UV754紫外分光光度計(jì)光路圖:由光源發(fā)出的連續(xù)輻射光線，經(jīng)濾光片和球面反射鏡至單色器入射狹縫處聚焦成像，光束通過入射狹縫，經(jīng)平面反射鏡到準(zhǔn)直鏡，產(chǎn)生平行光射至光柵。在光柵上色散后，又經(jīng)準(zhǔn)直鏡聚焦在出射狹縫上成一連續(xù)光譜，由出射狹縫射出一一定波長的單色光，通過標(biāo)準(zhǔn)溶液再照射到光電管上。光源切換與波長移動相對應(yīng)200nm-290nm需點(diǎn)亮笊燈290nm360nm需同

36、時(shí)點(diǎn)亮笊燈和鴇燈360nm-850nm需點(diǎn)亮鴇燈單色器采用自準(zhǔn)式系統(tǒng)，衍射光柵使用該廠自制1200條/nm的復(fù)制閃躍光柵2、測試準(zhǔn)備(1)打開電源開關(guān)之前，檢查一下測試樣品室。(2)試樣槽置“參考”位置。(3)打開電源開關(guān)。如果波長工作在200nm300nm時(shí)需按笊燈觸發(fā)按鈕。(4)顯示器顯示“754”后，數(shù)顯為“100.0”，則表明儀器已通過自檢程序。此時(shí)按A/C鍵，儀器自動進(jìn)入“0.000"吸光值狀態(tài)，測試“連續(xù)”及“自動”打印狀態(tài)；(5)儀器預(yù)熱三十分鐘。3、測試數(shù)顯“0.000"穩(wěn)定后，即可把試樣槽置于“樣品”位置進(jìn)行測試(即拉一下樣品室滑桿)。待第一個數(shù)據(jù)自動打印

37、完畢后，再可將試樣槽置于第二個“樣品”位置測試(即再拉一下樣品室滑桿)。(2)每當(dāng)需要調(diào)換波長時(shí)，必須把試樣槽置于“參考”位置，重新調(diào)零，現(xiàn)將測試操作順序如下：測試開始試棒槽置“參考”位置調(diào)W長置所需波長II顯示器顯示0.000(A)或j100.0(T)I，i拉動滑桿.試樣槽置“樣品位置讀數(shù)，自動送出打印測定值重第注意：樣品號超過99號，打印數(shù)復(fù)位至00繼續(xù)計(jì)數(shù)下去。(四)分光光度計(jì)和紫外分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng) .光度計(jì)的光電管或光電池對不同濃度的光敏度不一樣，應(yīng)注意每換一次波長，即應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)整到0。 .溶液定量測定，應(yīng)注意吸光度在0.05-1.0范圍，濃度太大時(shí)應(yīng)該適當(dāng)稀釋。 .

38、一般靈敏度旋鈕調(diào)置“1”檔，因其放大倍率最小，較穩(wěn)定。第三部分實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)記錄是實(shí)驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)的綜合記載，是分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果和書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告的依據(jù)。而實(shí)驗(yàn)報(bào)告是全部實(shí)驗(yàn)的根據(jù)和總結(jié)。兩者都十分重要。學(xué)生應(yīng)備有實(shí)驗(yàn)記錄本和實(shí)驗(yàn)報(bào)告本一、實(shí)驗(yàn)記錄1 .書寫整潔、字跡清楚2 .記錄實(shí)驗(yàn)中觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。原始記錄必須真實(shí)、客觀、準(zhǔn)確、祥細(xì)、清楚，切不可夾雜主觀因素3 .實(shí)驗(yàn)中使用的儀器類型、試劑規(guī)格、化學(xué)反應(yīng)、分子式及濃度，都應(yīng)記錄清楚4 .完整的實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)包括日期、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目、目的要求、操作和結(jié)果等二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理實(shí)驗(yàn)記錄，總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)報(bào)

39、告應(yīng)包括以下項(xiàng)目：(1)實(shí)驗(yàn)名稱(2)目的和要求(3)原理(簡述實(shí)驗(yàn)的基本原理)(4)操彳(可以采用流程圖的方式或以表格方式表示)(5)結(jié)果與討論描述實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，分析它們所說明的問題，探討實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。闡述對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的改進(jìn)意見等。對于定量實(shí)驗(yàn)列出算式進(jìn)行計(jì)算并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行必要的說明和分析。(6)思考題實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)濃度測定（雙縮月尿法）【目的和要求】1 .掌握本實(shí)驗(yàn)方法的原理和操作2 .掌握標(biāo)準(zhǔn)工作（AC）曲線的制作3 .熟悉蛋白質(zhì)定量測定的幾種常用方法【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1 .分光光度計(jì)的使用2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3 .血清蛋白質(zhì)含量測定【試劑與器材】1. 6mol/L氫氧化鈉溶液稱取氫氧

40、化鈉（NaOH優(yōu)級純）240g,用新鮮蒸儲水配制成1L,置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。2 .雙縮月尿試劑稱取未失結(jié)晶水的硫酸銅（CuSQ-5H20）3.0g,溶于500m1新鮮蒸儲水中，加酒石酸鉀鈉（NaKGHkQ。4H20）9.0g,碘化鉀（KI）5.0g,待安全溶解后，加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml,最后加蒸儲水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩(wěn)定6個月。3 .蛋白標(biāo)準(zhǔn)液可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標(biāo)定后，加疊氮鈉防腐（疊氮鈉的終濃度0.51.0g/L）,冰凍保存。4 .恒溫水浴箱、722（721）分光光度計(jì)、吸管、試管、坐標(biāo)

41、紙【實(shí)驗(yàn)原理】測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法；比色法主要包括雙縮月尿法、Folin-酚試劑法及染料結(jié)合法；紫外分光光度法等雙縮月尿（Biuret）法：在堿性溶液中，雙縮月尿（H2NCO-NH-CO-NH2）與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮月尿反應(yīng)。凡分子中含二個或二個以上酰胺基（一CO-NH2）,或與此相似的基團(tuán)如一CH2-NH2-CS-NH2C（NH）NH2的任何化合物，無論這類基團(tuán)直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵（一CO-NH-）,可發(fā)生雙縮月尿反應(yīng)，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正

42、比，可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。1.配制20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為70g/L,則取此液2m1,加入新鮮蒸儲水5ml,混勻即成。2.按表操作加入物（ml）空白管12345測定管20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.10.20.30.40.5蒸儲水0.50.40.30.20.10.4待測樣品液體0.1雙縮月尿試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當(dāng)血液蛋白質(zhì)(g/L)20406080100混勻，置37c水浴10min(或25c30min),用540nm波長比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制15為標(biāo)準(zhǔn)曲線管

43、，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)測定管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對應(yīng)的總蛋白濃度?！咀⒁馐马?xiàng)】1 .雙縮月尿試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuS045H20不穩(wěn)定形成Cu(0H)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuS045H20之比不低于3:1,加入KI作為抗氧化試齊I。2 .雙縮月尿試劑要封閉貯存.防止吸收空氣中的二氧化碳。3 .本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。4 .黃疸血清.嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。5 .本法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條通過原點(diǎn)的直線，在100g/L濃度之內(nèi)呈良好

44、的線性關(guān)系。思考題：1 .雙縮月尿法測定蛋白質(zhì)的原理是什么？其他還有什么方法測定蛋白質(zhì)的含量？2 .請用雙縮月尿法，設(shè)計(jì)一個測定蛋白質(zhì)含量的定量方法(除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外)。實(shí)驗(yàn)三醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)(Serumalbuminseparatedbyacetatefilmelectrophoresis【目的和要求】1掌握醋酸纖維素薄膜電泳的原理和操作方法1 了解醋酸纖維素薄膜電泳所分離的血清蛋白質(zhì)的各帶譜及其臨床意義。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】血清蛋白質(zhì)電泳醋酸纖維薄膜法1 儀器和薄膜的準(zhǔn)備2 點(diǎn)樣3 平衡和電泳4 染色5 結(jié)果判斷6 透明7 定量分析【器材】1 儀器：電泳儀、電泳槽、分光光度計(jì)或光密度儀

45、。2 材料：醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、點(diǎn)樣器、直尺、鉛筆、剪刀等?！驹噭?巴比妥巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06)。稱取巴比妥2.21克和巴比妥鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。2染色液麗春紅S染色液：稱取麗春紅SO.4g、三氯醋酸6g,用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。氨基黑10B染色液：稱取氨基黑(C22H13O12N6s3N310B0.1g,溶于20ml無水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水楊酸2.5g，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻，再以蒸餾水補(bǔ)足至100ml。稱取麗春紅S0.4克及三氯醋

46、酸6克；用蒸餾水溶解，并稀釋至100毫升。3漂洗液。(1)3%(V/V醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。(2)甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸儲水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗。4透明液取無水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。5 洗脫液(1) 0.1mol/LNaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。(2) 0.4mol/LNaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫。6 .40%(V7V)醋酸溶液?！緦?shí)驗(yàn)原理】帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場中向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負(fù)電，在

47、電場中都向陽極移動。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少及分子大小不同，所以在電場中向陽極泳動速度也不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者，泳動速度快；反之，則泳動速度慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可計(jì)算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)。以醋酸纖維薄膜（CAM為支持介質(zhì)，電泳分離后經(jīng)染色處理，可展示出清晰的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由于染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的量成正比，因此將各蛋白質(zhì)帶剪下，分別用一定量的NaOHffi溶液洗脫下來，即可進(jìn)行比色，測定出各蛋白質(zhì)區(qū)帶的相對含量。也可用一定量的有機(jī)溶劑使CAMt解制成透明膜而用光密度

48、計(jì)進(jìn)行掃描定量。醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡便及分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定?！静僮鳌? 、電泳槽的準(zhǔn)備將巴比妥巴比妥鈉緩沖液加入電泳槽中（兩側(cè)槽內(nèi)注入等量的緩沖液），調(diào)節(jié)兩側(cè)內(nèi)的緩沖液，使其在同一水平面，液面與支架的距離約為22.5cm。支架寬度到恰好適合CAM勺長度，用34層濾紙或4層紗布搭橋。2 、CAM®備取醋纖薄膜（2厘米*8厘米）在CAM勺無光澤面（涂有醋酸纖維素）距一端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃一線（與CAM勺長軸垂直），作點(diǎn)樣標(biāo)記，將膜條編號后將無光澤面朝下浸入巴比妥一巴比妥鈉緩沖液中，待充分浸透后取出（一般約需求

49、2030min）,夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.3 、點(diǎn)樣用血清加樣器將35ul無溶血的新鮮血清均勻地點(diǎn)在劃線處，樣品應(yīng)與膜的邊緣保持一定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區(qū)帶變形。待血清滲入膜后移開點(diǎn)樣器。點(diǎn)樣應(yīng)注意，要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。4 、平衡將已點(diǎn)樣的薄膜加樣面朝下，點(diǎn)樣端置于陰極端，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直，橋的另一端垂入緩沖液中，鹽橋?qū)⒛さ膬啥伺c緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳。5 、電泳正確聯(lián)接電泳槽與整流器對應(yīng)的正負(fù)極，點(diǎn)樣側(cè)接負(fù)極，另一側(cè)接正極。開啟電源通電。調(diào)節(jié)電壓10V15V/cm膜長，電流0.40.6mA/cm膜總寬，電泳4060

50、分鐘（通常夏季需45min,冬季需60min）,待電泳區(qū)帶展開3.5cm4cm時(shí)即可關(guān)閉電源。6 、染色通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中，染色510分鐘。7、漂洗至少準(zhǔn)備34個漂洗皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復(fù)漂洗，直至背景漂白為止。此時(shí)清晰可見5條色帶。待干。-7士旦7、定量（1）洗脫比色法取六支試管，分別標(biāo)明“A、a1、a2、3、丫、空白”。將漂洗凈的薄膜剪下各區(qū)帶放入相應(yīng)的試管內(nèi)，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，根據(jù)染色不同按以下方法洗脫。氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內(nèi)加入0.4mmol/

51、LNaOH§y6ml,其余5管各加3ml,振搖數(shù)次，置37c水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度X2。麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液，加入量同上。10分鐘后，于清蛋白管內(nèi)加入40（VV）醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉，使溶液色澤加深。如出現(xiàn)沉淀，可離心取上清液比色。用520nm波長，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度X2。（2）光密度掃描法1 ）透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中35分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上（應(yīng)無氣泡），直立片刻除去過多的透

52、明液。于90100c烘箱內(nèi)烘烤510分鐘，取出冷卻至室溫。此法透明的CAM各蛋白區(qū)帶鮮明，薄膜平整，可直接掃描或作永久保存。若用十萘氫或液體石醋透明，應(yīng)將漂洗過的薄膜烘干后進(jìn)行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易發(fā)生皺折。2 ）掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動光密度計(jì)或其它光密度掃描的光路，選擇波長520nm,描記各蛋白區(qū)帶峰，并計(jì)算各蛋白成分的相對含量。8、計(jì)算定量計(jì)算時(shí)，先計(jì)算各光密度值的總和：再計(jì)算血清各部分蛋白質(zhì)所占的百分率吸光度總和（T）=2A+a1+a2+3+丫（吸光度）Ax血清各蛋白組分的相對百分?jǐn)?shù)=-X100%ATAx表示各球蛋白組分（2A+a1+a2+3+丫）的吸光度。2A3A%

53、=X100%3=X100%TTa1丫a1%=X100%丫=X100%TTa2"2%=X100%T各組分蛋白百分?jǐn)?shù)（）X血清總蛋白g/L各組分蛋白質(zhì)含量（g/L）=1009、臨床意義（1）血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：蛋白質(zhì)組分g/L占總蛋白百分比（%）白蛋白355257.068.01球蛋白1.04.01.05.72球蛋白4.08.04.911.23球蛋白5.010.07.013.0丫球蛋白6.013.09.818.2（ 2） 臨床意義電泳圖譜可為臨床疾病診斷提供依據(jù)。腎病型可見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，a2和3升高；肝硬化型可見于慢性活動性肝

54、炎、肝硬變等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，3和丫增高，可出現(xiàn)3與丫難以分離而連接在一起的“3丫”橋，此現(xiàn)象是由于肝臟纖維增生導(dǎo)致IgA增高所致；急性反應(yīng)時(shí)相型常以a1、a2增高為特征；慢性炎癥型則以Alb降低，a2、丫增高較為常見；M蛋白血癥主要見于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質(zhì)（主要是IgG或IgA）,電泳時(shí)可在3和3丫之間出現(xiàn)一條峰形狹窄的區(qū)帶，稱M區(qū)帶?！咀⒁馐马?xiàng)】1 .通電時(shí)，不得接觸槽內(nèi)的緩沖液或CAM以防觸電。2 每次電泳時(shí)應(yīng)交換電極以使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液的正負(fù)離子相互交換，以使緩沖液的PH維持在一定水平。3 .電泳緩沖液的液面要保持一定的高度，過低可能會出現(xiàn)丫球蛋白的電滲現(xiàn)象（丫球蛋白向陰極移動），同時(shí)電泳槽兩側(cè)的液面應(yīng)保持在同一水平，否則，通過薄膜時(shí)有虹吸現(xiàn)象，將會影響蛋白質(zhì)分子的泳動速度。4電泳失敗或圖譜不理想的常見原因（1）電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分不佳：點(diǎn)樣過多；點(diǎn)樣不均勻、不整齊；薄膜過濕，樣品擴(kuò)散；點(diǎn)樣速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或溫度過高致使膜面局