-病原細菌課件

1、-病原細菌第五章第五章 昆蟲昆蟲(knchng)病原細菌病原細菌昆蟲因細菌侵染而引起的疾病稱為細菌病。昆蟲病原細菌是指其代謝產(chǎn)物或菌體本身對宿主昆蟲有致病或致死效應的細菌類群，通常也稱為殺蟲細菌。細菌殺蟲劑還具有以下一些特點： 具有一定的特異性和選擇性的殺蟲作用，不殺傷天敵，對人、畜安全，不污染環(huán)境； 易于和其他生物學手段相結合來進行害蟲綜合治理，能維持生態(tài)平衡； 由于殺蟲活性蛋白的多樣性，昆蟲產(chǎn)生抗性較緩慢或不易產(chǎn)生抗性； 可以通過發(fā)酵法生產(chǎn)，具有相對(xingdu)較低的生產(chǎn)成本； 可以通過生物技術途徑篩選或構建優(yōu)良性能的菌株來滿足生產(chǎn)與應用。 第一頁，共九十頁。-病原細菌一、昆蟲病原細菌

2、的主要(zhyo)類群Bucher（1960）曾把昆蟲病原細菌分為4個類型，但實際上這些類型可以大致劃分為3類：專性病原體（obtigate pathogens）：在自然界中只能在特定的寄主昆蟲體內(nèi)增殖，很難在人工培養(yǎng)基上正常生長增殖。一般經(jīng)口服感染，寄主范圍較窄；如金龜子芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌。兼性病原體（facultative pathogens）：可在昆蟲內(nèi)增殖，也能在人工培養(yǎng)基上正常生長發(fā)育的細菌；Bt、Bs。潛在病原體（potential pathogens）：通常生活(shnghu)在昆蟲的消化道內(nèi)，通常情況下極少引起疾病，但一旦進入昆蟲體腔，則可表現(xiàn)出較強的致病力。假單胞菌屬、腸

3、桿菌屬。 第二頁，共九十頁。-病原細菌據(jù)報道，殺蟲細菌約有100多種，且新分離的殺蟲細菌種類還在不斷增加。 伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊所劃分的33個細菌類群中，有9個類群的部分細菌種類具有殺蟲活性。目前(mqin)已知的殺蟲細菌主要有： 芽孢桿菌屬（Bacillus） 梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium） 假單胞菌屬（Pseudomonas） 賽氏桿菌屬（Serratia） 鏈球菌屬（Streptococcus） 發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus） 致病桿菌屬（Xenorhabdus）第三頁，共九十頁。-病原細菌二、主要昆蟲病原(bngyun)細菌的生物學特性（一）芽孢桿菌屬（Bacillu

4、s）蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cerues）： 是一種分布廣泛的兼性腐生細菌，廣泛分布于土壤中，從發(fā)病幼蟲中也可分離到。 其形態(tài)學特征與蘇云金芽孢桿菌很相似，但不形成伴胞晶體。 營養(yǎng)細胞大小為0.50.6 m1.56.0 m。寄主范圍廣泛，可侵染鞘翅目、膜翅目和鱗翅目等30余種昆蟲。 蠟狀芽孢桿菌可產(chǎn)生(chnshng)-毒素（磷脂酶C），從而破壞宿主中腸細胞，使菌體進入昆蟲血腔而引起敗血癥。另外，蠟狀芽孢桿菌還能產(chǎn)生蠟樣菌素（cerecine） 和多種外毒素，對人和許多動物也有致病作用。第四頁，共九十頁。-病原細菌2側胞芽孢桿菌（Bacillus laterosporus） 是一種好氧

5、芽孢桿菌，可從蜜蜂幼蟲、蠐螬、土壤和水中分離到。在上世紀初即發(fā)現(xiàn)該菌可引起蜜蜂幼蟲發(fā)生歐洲腐爛病，后又發(fā)現(xiàn)該菌對黃腹側蠅、煙草(ynco)甲幼蟲有殺蟲活性，而我國學者則首次報道了該菌對雙翅目蚊幼蟲的殺蟲活性。 徐婉學和范云六（1983）報道側胞芽孢桿菌AS 1.864菌株對三帶喙庫蚊、尖音庫蚊、一種庫蚊、白紋伊蚊和中華按蚊的殺蟲活性。Favret和Yousten（1985）進一步證實側胞芽孢桿菌對蚊幼蟲以及一種蚋（Simulium bivittatum）的殺蟲活性，但發(fā)現(xiàn)該菌對粉紋夜蛾無毒性，而該菌對蚊幼蟲的毒性又可分為病原性菌株和非病原性菌株。該菌的殺蟲活性與其伴胞體無關，而與其細胞壁和原生

6、質(zhì)膜有關。第五頁，共九十頁。-病原細菌Toxic activities of B.laterosporus 921 and 615 for larvae of mosquitoesStrainSpores/ml (107)LC50 for: AedesaegyptiAnophelesstephensiCulexpipiens 9214.05.6 103 (0.4 103-11.9 103)7.7 103 (6.9 103-8.4 103)5.6 102 (4.6 102-13.5 102) 6152.45.3 103 (4.0 103-6.5 103)0.11 103 (0.05 103-0.

7、2 103)4.6 102 (3.3 102-10.4 102)a Strains were grown in Nickerson broth at 30C for 72 h with shaking. b LC50s are presented as FWC dilutions. The data are averages of four or five assays, with 95% confidence limits, as determined by probit analysis, in parentheses. 第六頁，共九十頁。-病原細菌3. 森田芽孢桿菌（Bacillus m

8、oritai）由日本的鲇沢啟夫（1962）從蠅體中分離得到，是一種對多種蠅類幼蟲致病的芽孢桿菌。 營養(yǎng)細胞桿狀，能運動，其芽孢囊明顯膨大。 森田芽孢桿菌幼蟲的毒殺作用可能與菌體生長繁殖過程中產(chǎn)生的毒素無關，而是菌體在蟲體內(nèi)(t ni)繁殖的結果。在日本，森田芽孢桿菌制劑已作為商品用于衛(wèi)生害蟲的防治，商品名Labillus。防治家蠅，每克幼蟲飼料中有107個芽孢，可抑制96%99%的成蟲羽化。第七頁，共九十頁。-病原細菌4. 幼蟲芽孢桿菌（Bacillus larvae） 是一種革蘭氏染色陰性的兼性厭氧菌。營養(yǎng)細胞桿狀，通常(tngchng)單個存在或呈鏈狀排列，可運動。大小0.50.8 m2.

9、05.0 m。 形成芽孢時產(chǎn)生一種抗菌素，對其他種類細菌有抑制作用。 幼蟲芽孢桿菌是蜜蜂的專性病原菌，感染蜜蜂只是在幼蟲飼喂時期，當敏感昆蟲幼蟲取食芽孢后，在24 h內(nèi)芽孢即可萌發(fā)生長。其營養(yǎng)細胞通過溶解中腸細胞壁而進入血腔，并大量繁殖，從而導致幼蟲發(fā)病直至死亡。幼蟲感染的第一個癥狀是蟲體失去正常的白色而變?yōu)榈稚?。第八頁，共九十頁?病原細菌5. 其他芽孢桿菌(gnjn) 堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）對鱗翅目昆蟲有致病作用 蜂房芽孢桿菌（Bacillus alvei）對蜜蜂幼蟲和幾種蚊幼蟲有致病作用短芽孢桿菌（Bacillus brevis）對蚊幼蟲有致病作用堅強芽孢(y

10、bo)桿菌（Bacillus firmus）第九頁，共九十頁。-病原細菌（二）梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）梭狀芽孢桿菌一般簡稱為梭菌，是一類專性厭氧芽孢桿菌，其形態(tài)學上的突出特征是由于芽孢囊的膨大而使菌體呈梭形。營養(yǎng)細胞一般為直桿狀，兩端鈍圓，單個或成短鏈存在。運動或不運動。Bucher等（1957，1961）首次報道分離到對昆蟲有致病性的兩種梭菌，即縮短梭菌（Clostridium brevifaciens）和天幕毛蟲梭菌（Clostridium malacosomae）?？s短梭菌：大小(dxio)為0.91.3 m320 m，其芽孢囊不膨大，革蘭氏染色陰性，其芽孢被昆蟲取食后僅

11、在中腸繁殖，不侵入血腔，蟲體死后收縮變短，干燥而僵化?？s短梭菌的芽孢在昆蟲中腸內(nèi)經(jīng)1624 h萌發(fā)成營養(yǎng)體，24 h后形成芽孢，36 h可在蟲體糞便中觀察到營養(yǎng)體和芽孢。目前尚不能在人工培養(yǎng)基上形成芽孢。天幕毛蟲梭菌：營養(yǎng)體不運動，大小為1.0 m47 m；芽孢囊約呈紡錘形，專性寄生于加州天幕毛蟲。 第十頁，共九十頁。-病原細菌（三）假單胞菌屬（Pseudomonas）是一類專性好氧的革蘭氏陰性桿菌。該屬具殺蟲活性的有銅綠假單胞（Pseudmonas aeruginosa）、熒光假單胞菌（Pfluorescens）、惡臭假單胞菌（Pputida）和敗血性假單胞菌（Pseptica），它們均為昆

12、蟲的潛在病原菌。普遍存在于土壤、水、植物以及昆蟲消化道中。 銅綠假單胞菌俗稱綠膿桿菌，是一種廣泛分布于昆蟲體內(nèi)的革蘭氏陰性小桿菌，其細胞大小為0.50.6 m1.5 m，無芽孢，單個或兩個相連，或多個串連成短鏈狀，具13根極生鞭毛，可運動。該菌可以產(chǎn)生多種對昆蟲有毒性的胞外酶，不過(bgu)該菌在昆蟲中腸中的侵染能力較差，但一旦進入血腔，則致病性很強。銅綠假單胞菌對雙帶黑蝗、透翅蝗、蘋天幕毛蟲等多種昆蟲有致病性，其病原性與其產(chǎn)生的蛋白酶有關。敗血性假單胞菌主要對一些金龜子幼蟲和家蠅有致病作用。 第十一頁，共九十頁。-病原細菌（四）賽氏桿菌屬（Serratia） 是廣泛分布于水域、土壤、牛奶及其

13、他食品中的一類革蘭氏陰性桿菌，其中對昆蟲有致病作用的有粘質(zhì)賽氏桿菌（S. marcescens）、嗜蟲賽氏桿菌（S. entomophila）、液化賽氏桿菌（S. liquefaciens）等幾個種。粘質(zhì)賽氏桿菌是已知的最小的桿菌種類之一，由于在常溫培養(yǎng)(piyng)下能產(chǎn)生一種深紅色的靈桿菌素，故又稱為靈桿菌。據(jù)報道，該菌可侵染直翅目、鞘翅目、膜翅目等6個目的70多種昆蟲。第十二頁，共九十頁。-病原細菌Serratia entomophila嗜蟲賽氏桿菌可引起新西蘭牧場(mchng)的一種主要害蟲草地蠐螬（Costelytra zealandica）發(fā)病，感染幼蟲在幾天內(nèi)停止進食，消化道變空

14、，中腸變?yōu)殓晟?，并?6周內(nèi)死亡。由于具有較高的殺蟲活性，且對非目標生物和環(huán)境影響較小，因此，由該菌研制的商品Invide在新西蘭獲準登記，并用于草地蠐螬的防治。第十三頁，共九十頁。-病原細菌第十四頁，共九十頁。-病原細菌（五）鏈球菌屬（Streptococcus） 該屬有代表性的昆蟲病原細菌為糞鏈球菌（Sfaecalis），為一種機會致病菌，其有毒菌株與無毒菌株的血清型不同。該菌對舞毒蛾幼蟲有致病作用。舞毒蛾幼蟲吞食該菌后，12日便停止進食，蟲體收縮，在315天內(nèi)死亡。死蟲干僵脫水(tu shu)，但不腐爛。 第十五頁，共九十頁。-病原細菌（六）發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus）和致病

15、桿菌屬（Xenorhabdus）發(fā)光桿菌屬和致病桿菌屬的細菌幾乎都是昆蟲病原線蟲的共生菌。其中致病桿菌屬與斯氏屬線蟲（Steinernema）共生。發(fā)光桿菌屬與異小桿線蟲（Heterorhabditis）共生。二者的共同特征是均為革蘭氏陰性、周生鞭毛、兼性厭氧、能運動的桿狀細菌。大小約為0.32 m210 m。這些共生菌均具有兩型現(xiàn)象，分別稱為初生型（或型）和次生型（或型）共生菌。初生型細菌能支持線蟲的大量繁殖(fnzh)，而次生型細菌不能與線蟲共生，也不支持線蟲在昆蟲體內(nèi)生長。初生型細菌不穩(wěn)定，體外培養(yǎng)時極易轉化為次生型。共生菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種物質(zhì)參與病原線蟲對昆蟲的致死作用，包括蛋白毒素、

16、蛋白酶、抗生素類以及脂多糖等。該類共生菌既能產(chǎn)生對昆蟲具有注射活性的殺蟲蛋白，還可以產(chǎn)生具有口服活性的蛋白。Bowen等（1998）從P. Luminescens中分離到4種毒素蛋白Tca、Tcb、Tcc和Tcd，其中Tca和Tcd在對煙草天蛾的殺蟲活性中占主導地位。 第十六頁，共九十頁。-病原細菌第十七頁，共九十頁。-病原細菌第十八頁，共九十頁。-病原細菌三、蘇云金芽孢三、蘇云金芽孢(y bo)(y bo)桿菌桿菌第十九頁，共九十頁。-病原細菌蘇云金芽孢桿菌：（Bacillus thuringiensis, Bt）分布廣泛，革蘭氏陽性，芽孢桿菌。1901年，石渡（S. Ishiwata）從患

17、病的家蠶幼蟲(yuchng)分離得到。 猝倒桿菌 Bacillus sotto Bt猝倒亞種1911年Berliner從德國蘇云金地區(qū)谷倉中患病的地中海粉螟幼蟲體內(nèi)分離到類似的細菌。1915年才正式命名為 Bacillus thuringiensis。此后分離出與蘇云金桿菌類似的產(chǎn)生晶體的芽孢桿菌，被陸續(xù)命名為蘇云金桿菌的各個亞種。 第二十頁，共九十頁。-病原細菌（一） Bt的分類 Bt的分類系統(tǒng)是由Barjac（1973）把鞭毛抗原作為分類標準(biozhn)而建立起來的，還以酯酶型、生理生化反應等指標，現(xiàn)在以RAPD、Ap-PCR等方法進行分類。 Bt分成27個血清型，7個亞型； 1994

18、年45個血清型，13個亞型，58個亞種； 1996年發(fā)現(xiàn)55個血清型； 2002年70個血清型，83個亞種，我國11個血清型。第二十一頁，共九十頁。-病原細菌第二十二頁，共九十頁。-病原細菌第二十三頁，共九十頁。-病原細菌第二十四頁，共九十頁。-病原細菌（二） Bt發(fā)育(fy)的三個階段： 營養(yǎng)體 芽孢囊 晶體和芽孢釋放 殺蟲結晶蛋白（Insecticide Crystal Proteins，ICPs）或蘇云金桿菌毒蛋白(Bt toxin) 第二十五頁，共九十頁。-病原細菌第二十六頁，共九十頁。-病原細菌第二十七頁，共九十頁。-病原細菌第二十八頁，共九十頁。-病原細菌 （三）（三）BtBt的活

19、性：的活性： BtBt產(chǎn)生的生物活性成分：胞內(nèi)、胞外產(chǎn)生的生物活性成分：胞內(nèi)、胞外 蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)：（-endotoxin、-exotoxin V Vegetative Insecticidal Proteins，Vip） 核苷類：核苷類：（-exotoxin ） 氨基多元醇：氨基多元醇：（Zwittermicin A ，ZwA）對動物對動物(dngw)(dngw)中的節(jié)肢動物中的節(jié)肢動物(dngw)(dngw)門、扁形動物門、扁形動物(dngw)(dngw)門、線形動物門、線形動物(dngw)(dngw)門以及原生動物門以及原生動物(dngw)(dngw)門中的門中的600多種有害種類有選擇

20、殺滅活多種有害種類有選擇殺滅活性。性。 （鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等昆蟲）昆蟲）對癌細胞有殺滅活性。對癌細胞有殺滅活性。對微生物中的細菌、真菌等有活性。對微生物中的細菌、真菌等有活性。 第二十九頁，共九十頁。-病原細菌 蘇云金素蘇云金素 又稱乙體外毒素（-exotoxin）、熱穩(wěn)定外毒素、蠅毒素，或簡稱外毒素。McConnell等于(dngy)1959年首次發(fā)現(xiàn)，具有熱穩(wěn)定性質(zhì)，經(jīng)12015min不失活性，能溶于水，可透析。蘇云金素不是蛋白質(zhì)，而是一種核苷酸類物質(zhì)。在菌體生長過程中先于芽孢和晶體產(chǎn)生，在24h達到最高量。該毒素包含兩種核苷酸

21、衍生物，為蘇云金菌素A（thuringiensin A）和蘇云金菌素B（thuringiensin B）。兩者都含有一個腺嘌呤、一個核糖、一個磷酸、一個葡萄糖和一個別粘酸。羧基在菌素A是游離的，而在B則結合為內(nèi)脂。實際上菌素B是菌素A的內(nèi)脂。菌素A可加熱失水而成B，而菌素B則可由堿水解而成A。無水的菌素A分子量是701，含水的為755。對家蠅毒力A大于B約8倍。 第三十頁，共九十頁。-病原細菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins, VIP）：是最近幾年發(fā)現(xiàn)的在某些Bt菌株營養(yǎng)生長期分泌的一類殺蟲蛋白，對鱗翅目夜蛾科害蟲具有廣譜高效的殺蟲活性。到目前為

22、止，VIPs主要分為VIP1、VIP2和VIP3三種，它們的殺蟲作用特征不同，其中VIP3蛋白的研究較多。VIP3是一類新型殺蟲蛋白，組織病原學試驗表明，敏感昆蟲小地老虎喂食VIP3A 24h后，中腸上皮細胞發(fā)生變化；48h后，細胞嚴重受損，但仍然與基膜相連；72h后，與基膜完全脫離，細胞核溶解，細胞質(zhì)膨脹、空泡化，昆蟲中腸形成孔洞。在致病機理方面，VIP3與殺蟲晶體蛋白ICPs完全不同，它以可溶性蛋白的形式存在于害蟲中腸，與中腸上皮細胞上的受體結合，形成穩(wěn)定(wndng)的離子通道，破壞中腸形成孔洞，造成昆蟲死亡。受體現(xiàn)在已被分離，它與一類胞外糖蛋白具有同源性，是分子量為80kDa或100k

23、Da左右的蛋白。 第三十一頁，共九十頁。-病原細菌雙效菌素（Zwittermicin A，簡稱ZwA）是近年來在蘇云金芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種(y zhn)具有抑菌和殺蟲雙重作用的多元醇類物質(zhì)。對多種真菌和細菌都有抑制效果，對昆蟲的毒性非常低，但對蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白具有顯著的增效作用，可以使Cry1Cry6類的毒素蛋白增效1.51000倍，并且隨著濃度的提高其增效作用也隨之提高。 第三十二頁，共九十頁。-病原細菌 其他(qt)毒素： 甲體外毒素（-exotoxin）、 丙體外毒素（-exotoxin） 輔助蛋白（helper proteins） 腸毒素（enterotoxin） 芽孢第三

24、十三頁，共九十頁。-病原細菌殺蟲晶體蛋白（ICP） 基因的定位： ICP基因 cry基因 基因的克隆(k ln) 基因的分類 基因的結構 殺蟲機制 應用第三十四頁，共九十頁。-病原細菌殺蟲晶體蛋白基因(jyn)的定位 1953年發(fā)現(xiàn)殺蟲活性與伴孢晶體有關(yugun) 伴孢晶體由蛋白質(zhì)組成： 殺蟲晶體蛋白，晶體蛋白，毒蛋白，-內(nèi)毒素 基因定位：大質(zhì)粒、染色體 質(zhì)粒消除、接合轉移、分子雜交 Bt質(zhì)粒：多樣性、112個、2200kb第三十五頁，共九十頁。-病原細菌殺蟲晶體蛋白基因(jyn)的克隆1981年美國的年美國的Schnepf和和Whiteley年克隆了第一個殺蟲晶體蛋年克隆了第一個殺蟲晶體

25、蛋白基因后，白基因后，1989年命名為年命名為cryIAa（cry1Aa1），對鱗翅目昆蟲），對鱗翅目昆蟲(knchng)有活性。有活性。1984年年Ward等克隆了對雙翅目昆蟲有毒的等克隆了對雙翅目昆蟲有毒的cyt1A基因?；?。1987年克隆對鞘翅目昆蟲有活性的年克隆對鞘翅目昆蟲有活性的cryIIIA（cry3A）。）。近年，發(fā)現(xiàn)一些具有特殊活性（對同翅目、膜翅目以及線形動物近年，發(fā)現(xiàn)一些具有特殊活性（對同翅目、膜翅目以及線形動物門和原生動物等具有活性）的門和原生動物等具有活性）的cry基因?；颉５谌?，共九十頁。-病原細菌克隆的克隆的Bt殺蟲基因的數(shù)量殺蟲基因的數(shù)量(shling)

26、：1981 第一個第一個cry基因基因 1990年年 461995年年 107 2000年年 198 2007年年 374 我國（我國（2000年至今）年至今） 61個個 , 28%第三十七頁，共九十頁。-病原細菌蘇云金桿菌毒蛋白(dnbi)基因的分類 1989年Hfte and Whiteley建立cry基因的分類系統(tǒng)(xtng)，以cry基因產(chǎn)物的殺蟲譜和基因序列相似性為依據(jù)，將發(fā)現(xiàn)的42種基因分為5類，13個小組： cryI 鱗翅目 130kDa cryII 鱗翅目和雙翅目 70kDa cryIII 鞘翅目 70kDa cryIV 雙翅目 70、130kDa cyt(cytolytic

27、crystal protein coden gene)， 27kDa第三十八頁，共九十頁。-病原細菌1995年，年，Crickmore 28屆無脊椎動物病理學年會屆無脊椎動物病理學年會 分類分類(fn li)命名原則：命名原則： 氨基酸同源性氨基酸同源性 第一等級第一等級 小于小于45% 第二等級第二等級 45%-78% 第三等級第三等級 78%-95% 第四等級第四等級 95%以上以上第三十九頁，共九十頁。-病原細菌殺蟲晶體蛋白的結構殺蟲晶體蛋白的結構(jigu)Cry1AaCry3AaDomain I 7個個- 螺旋穿孔，毒性螺旋穿孔，毒性(d xn)區(qū)區(qū)Domain II 3個個- 折疊

28、，受體特異結合區(qū)折疊，受體特異結合區(qū)Domain III 2個個- 折疊，毒性保護區(qū)折疊，毒性保護區(qū)第四十頁，共九十頁。-病原細菌Bt殺蟲晶體蛋白的保守殺蟲晶體蛋白的保守(boshu)區(qū)域區(qū)域第四十一頁，共九十頁。-病原細菌殺蟲晶體蛋白的殺蟲機制(jzh)伴孢晶體的溶解：伴孢晶體的溶解： 昆蟲腸道環(huán)境昆蟲腸道環(huán)境(hunjng) pH原毒素的激活：原毒素的激活： 蛋白酶消化蛋白酶消化 60kDa核心片段核心片段與受體結合與受體結合 BBMV（刷狀緣膜囊）（刷狀緣膜囊）穿孔和離子通道穿孔和離子通道 發(fā)夾結構，發(fā)夾結構，“刀狀刀狀”模型模型 腸細胞破壞而死亡腸細胞破壞而死亡 離子梯度，細胞裂解離子

29、梯度，細胞裂解第四十二頁，共九十頁。-病原細菌第四十三頁，共九十頁。-病原細菌第四十四頁，共九十頁。-病原細菌第四十五頁，共九十頁。-病原細菌 世界上第一批蘇云金桿菌(Bt)制劑的工業(yè)產(chǎn)品于1958年誕生于美國。 目前已有60多個國家生產(chǎn)120多種商品，并成為世界上產(chǎn)量最大、防效最好、應用最廣的微生物殺蟲劑，廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲、林業(yè)害蟲、醫(yī)學昆蟲和倉貯害蟲。 在微生物農(nóng)藥行業(yè)(hngy)中蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑成為支柱產(chǎn)業(yè)之一。 優(yōu)點：選擇性強，對人畜、天敵、植物都十分安全，堪稱“無公害”農(nóng)藥。Bt的應用的應用(yngyng)第四十六頁，共九十頁。-病原細菌第四十七頁，共九十頁。-病原細菌第四

30、十八頁，共九十頁。-病原細菌第四十九頁，共九十頁。-病原細菌 第一代第一代Bt殺蟲劑的缺點：殺蟲劑的缺點： 殺蟲蛋白類型比較單一、殺蟲譜較窄：殺蟲蛋白類型比較單一、殺蟲譜較窄：雖然發(fā)現(xiàn)Bt可以(ky)殺死節(jié)肢動物門昆蟲綱中的鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等，還可以(ky)殺死線形動物門、扁形動物門、原生動物門等，但就某一個菌株或亞種來說，它的殺蟲譜還是比較窄，使用對象主要限于鱗翅目害蟲。 毒蛋白晶體易分解：毒蛋白晶體易分解：受自然環(huán)境影響，特別經(jīng)紫外線照射極易分解破壞，田間殺蟲效果通常僅能維持34天。 第五十頁，共九十頁。-病原細菌Bt的基因工程(jyn gngchng) Bt基因工程(jyn

31、 gngchng)微生物的構建 抗蟲轉Bt基因植物第五十一頁，共九十頁。-病原細菌Bt 工程(gngchng)微生物 廣譜Bt工程菌的構建(u jin) 高效表達Bt工程菌的構建 延長持效期工程菌的構建 延緩抗性Bt工程菌的構建 多功能Bt工程菌的構建第五十二頁，共九十頁。-病原細菌 (1) 質(zhì)粒的接合轉移質(zhì)粒的接合轉移 為了增強Bt的殺蟲范圍，可消除毒蛋白表達水平較低的質(zhì)粒而保留表達水平較高的質(zhì)粒，或?qū)⒉煌瑏喎N、不同菌株中的質(zhì)粒通過接合作用加以復合。 美國Ecogen公司1991年注冊的生物殺蟲制品Foilo F的有效成分EG2424。 EG2424在孢子形成期產(chǎn)生cryA和cryA(c)蛋

32、白，形成菱形和雙金字塔形晶體(jngt)，對玉米螟與馬鈴薯甲蟲害蟲均有殺傷作用，已應用到土豆、茄子及其它農(nóng)作物的生物防治中 。廣譜(un p)Bt工程菌的構建第五十三頁，共九十頁。-病原細菌cryIIIAcryIA(c)cryIIIAcryIIIAcryIA(c)EG2424 (Foilo F)Bt.kurstakiHD-263-8Bt.morrisonEG2158第五十四頁，共九十頁。-病原細菌（2） 殺蟲蛋白基因的體外重組殺蟲蛋白基因的體外重組重組DNA技術的迅速發(fā)展，為構建新Bt工程菌提供了更大的靈活性。許多殺蟲蛋白基因不能通過接合作用進入一個新的受體細胞，因為并不是每一種(y zhn)

33、質(zhì)粒都可以通過接合進行轉移。另外，對于幾種昆蟲特異的ICPs可能定位在同一質(zhì)粒上。第五十五頁，共九十頁。-病原細菌 Crickmore等（1990將對鞘翅目昆蟲有效(yuxio)的擬步行甲亞種tenibrionis亞種的毒蛋白基因cryIIIA導入對雙翅目有效的isreal亞種，新菌株不僅對鞘翅目以及雙翅目蚊幼蟲有毒外，還產(chǎn)生了一種新的殺蟲活性，對鱗翅目的菜青蟲也具有一定的殺蟲活性。 Gamel and Piot把鞘翅目特異的cryIII基因利用載體導入Bt subsp. kurstaki，轉基因菌株不僅表達了高水平的鞘翅目殺蟲活性，而且保持了對鱗翅目昆蟲的殺傷作用。第五十六頁，共九十頁。-病

34、原細菌 pHT315 (6.5kb) Err Ampr ori1030 plac ori of Ecoli Bam HI Eco RI Hin cII Hin dIII Kpn I Pst I Sac I Sal I Sma I Xba I 第五十七頁，共九十頁。-病原細菌 pLG28 (14.8kb) Err Ampr ori1030 Cry1Abori of Ecoli Eco RI Hin dIII KpnI Pst I Sac I Sal I Xba I 第五十八頁，共九十頁。-病原細菌第五十九頁，共九十頁。-病原細菌高效(o xio)表達Bt工程菌的構建（1）在無芽孢 (Spo-)

35、或經(jīng)消除 (或部分消除) 質(zhì)粒的受體菌中表達ICP基因cry1、cry2和cry11類基因是依賴于芽孢形成的ICP基因，它們的表達受到芽孢形成過程(guchng)的調(diào)控。cry3A是一類不依賴于芽孢形成過程的ICP基因。Cry3A蛋白在無芽孢的菌株中的產(chǎn)生量是野生菌株的2.5倍。通過質(zhì)粒消除使菌株的毒力得以提高。第六十頁，共九十頁。-病原細菌（2）增加ICPs基因拷貝數(shù) 基因拷貝數(shù)對表達量的影響 將cry3Aa基因連接于在細胞中有15個拷貝的載體上的表達量，明顯高于僅4個拷貝的載體的表達量。（3）增加ICP基因的穩(wěn)定性 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，外源質(zhì)粒DNA對宿主DNA的影響。Kalman等 運用轉化

36、與轉導相結合的方法將cry1C基因經(jīng)HD-73整合到庫斯塔克亞種菌株的染色體上，結果表明，所得到(d do)的工程菌株中cry1C基因能高效表達，同時穩(wěn)定性增加。第六十一頁，共九十頁。-病原細菌（4）對啟動子結構加以改造(gizo) 對ICP基因啟動子區(qū)域的改變，有可能是提高ICP基因表達量的一種有效方法。 沉默基因的表達 表達載體（5）利用輔助蛋白的增效作用 27kDa、20kDa (P20)蛋白質(zhì)能顯著增加殺蟲蛋白基因的表達量，在Bt中對cytA表達及晶體形成具有增強作用。利用輔助蛋白的增效作用，可以構建高效表達工程菌。第六十二頁，共九十頁。-病原細菌延長(ynchng)持效期工程菌的構建

37、 1991年Mycogen公司利用生物囊 (biopacking) 技術將Bt毒蛋白基因轉化熒光假單胞菌，經(jīng)發(fā)酵使工程菌大量產(chǎn)生毒蛋白，再采用加熱與浸碘工藝將菌體細胞殺死，滅活的菌體細胞壁便形成一種微囊將毒蛋白包裹其中研制了一種Cellcap包囊(bo nn)系統(tǒng)，由于形成了包囊(bo nn)毒蛋白的有效保護包囊(bo nn)，延緩了Bt毒蛋白降解，殺蟲持效提高了23倍。M-One，M-Trak，MVP等系列產(chǎn)品 第六十三頁，共九十頁。-病原細菌第六十四頁，共九十頁。-病原細菌第六十五頁，共九十頁。-病原細菌延緩(ynhun)害蟲抗性工程菌 昆蟲對不同種類ICP的抗性越來越引起人們的重視，抗性

38、可能成為限制Bt殺蟲劑發(fā)展的一個主要障礙。許多昆蟲尤其(yuq)對Cry1類蛋白容易產(chǎn)生抗性 。以色列亞種產(chǎn)生的CytA蛋白具有顯著的減緩害蟲對Cry4類蛋白的抗性 。多種殺蟲蛋白基因的協(xié)同作用。 Cry1與Cry2第六十六頁，共九十頁。-病原細菌多功能Bt工程菌的構建(u jin) 殺蟲防病工程菌的構建中國農(nóng)科院植保所將Bt基因轉入熒光(ynggung)假單胞菌p303菌株，構建三價（cry1Ab、cry1Ac、cry2Aa）的轉基因工程菌。 玉米螟 小麥全蝕病 殺蟲固氮工程菌的構建慢生根瘤菌 雙翅目昆蟲將攜帶Bt以色列亞種ICP基因的質(zhì)粒轉移到慢生根瘤菌IG3554菌株并獲得表達，從而構建

39、成功一種具有殺蟲和固氮雙重功能的工程菌株。利用多寄主質(zhì)粒pRK311將cry3A基因?qū)胲俎８鼍羞M行表達，也獲得具有固氮和殺馬鈴薯甲蟲活性的工程菌株。第六十七頁，共九十頁。-病原細菌 藍細菌 E. coli 農(nóng)桿菌 蠟狀芽孢桿菌 枯草(k co)芽孢桿菌 多粘芽孢桿菌 巨大芽孢桿菌 Clavibater xyli subsp. cyanodontis（CXC） 狗牙根木質(zhì)部的一種共生細菌 昆蟲桿狀病毒 啤酒酵母第六十八頁，共九十頁。-病原細菌轉轉Bt基因基因(jyn)植物植物第六十九頁，共九十頁。-病原細菌1987年，首次將Bt毒蛋白基因(jyn)導入煙草中表達。最初殺蟲晶體蛋白在植株上的

40、表達量很低。1990年Monsanto公司對Bt毒蛋白基因進行修飾，改變了21的核苷酸序列，消除了不利于高效表達的因素，人工合成全長的Bt毒蛋白基因在轉基因棉花植株中獲得了高效表達，表達量從原來的占可溶性蛋白的0.001%提高到0.050.1%，比原來增加了50100倍，抗蟲能力也大大增強。隨后根據(jù)植物基因組的優(yōu)化密碼子對ICPs基因進行修飾、改造或人工全合成ICPs基因，將之導入煙草、番茄、棉花、玉米而獲得ICPs高表達植株，其ICPs占可溶性蛋白超過0.2%，先后培育出高水平表達的植物。 第七十頁，共九十頁。-病原細菌已獲得的轉已獲得的轉BtBt殺蟲晶體蛋白基因殺蟲晶體蛋白基因(jyn)(

41、jyn)植物植物植物類別轉Bt毒蛋白基因的物種糧、棉、油類水稻、玉米2、小麥、棉花2、大豆1、油菜1、花生、向日葵1果樹類蘋果1、梨、甜橙、柑桔、葡萄、越桔、洋李、胡桃1、草莓、山楂、黃實黑茶麓子、懸鉤子、酸果曼1、唐棣、番木瓜、花楸果、板栗蔬菜類番茄1、茄子1、顛茄1、牛角椒、芹菜、芥菜、萵苣、白菜1、花椰菜1、卷心菜、蕪箐、胡蘿卜、豌豆、豇豆、鷹嘴豆、石刁柏、黃瓜、甜瓜、馬鈴薯2林木楊樹1、落葉松、白云杉、楓香樹、歐洲黑楊花卉類石竹、田旋花、長春花、玫瑰、蘭花、矮牽牛、菊花其它煙草1、甜菜1、苜蓿1、桔味薄荷、三葉草、甘蔗 注：1示已進入(jnr)田間試驗，2示已商品化 第七十一頁，共九十

42、頁。-病原細菌基因轉基因植物轉化方法抗蟲測試結果cryIA(b)玉米基因槍法對玉米螟抗蟲效果明顯cryIA(b)棉花農(nóng)桿菌介導法對棉鈴蟲植株保護率7075cryIA(b)番茄農(nóng)桿菌介導法對煙天蛾0.25植株受害，對照9.5受害cryIA(c)棉花農(nóng)桿菌介導法對棉鈴蟲植株保護率7087cryIA(c)歐洲黑楊農(nóng)桿菌介導法對舞毒蛾死亡率80100cryIA(c)煙草農(nóng)桿菌介導法對煙青蟲死亡率80100cryIA(c)大豆基因槍法對蚜蟲有很強殺蟲活性cryIA(c)花生基因槍法對螟蟲死亡率66100進入(jnr)大田試驗階段的部分轉Bt基因植物的防治效果 第七十二頁，共九十頁。-病原細菌 cry2

43、cry3 cry9 cry1Ac + cry2Ab Bollgard抗蟲棉 cry1A + CpTI 雙價抗蟲棉第七十三頁，共九十頁。-病原細菌四、球形芽孢(y bo)桿菌 球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus，簡稱BS）屬芽孢桿菌屬（Bacillus），為兼性病原菌，在土壤、水和昆蟲體中廣泛存在。1965年，Kellen等首次報道球形芽孢桿菌對蚊幼蟲有毒殺作用。20世紀(shj)70年代以來，各國學者從羅馬尼亞、印度尼西亞、斯里蘭卡和尼日利亞等國家分離到對蚊幼蟲有高度致病力的球形芽孢桿菌菌株。20世紀80年代中期以來，我國學者廣泛開展了利用球形芽孢桿菌防治蚊幼蟲的研究和應用。

44、 第七十四頁，共九十頁。-病原細菌（一）形態(tài)(xngti)和生物學特性 1. 形態(tài)特征 營養(yǎng)體： 桿狀，兩端鈍圓，周生鞭毛，大小0.640.86m1.54.18m，單個或兩個相連。革蘭氏染色反應不穩(wěn)定。芽孢和伴孢體： 芽孢球形或近球形，芽孢大小0.91.1m，端生，位于孢子囊的一端，孢子囊顯著膨大呈槌狀。有的菌株在形成芽孢的同時(tngsh)，還形成具折光性的伴孢體。伴孢體形狀有菱形、不規(guī)則形、桿狀或線狀，有的菌株在一個細胞中可產(chǎn)生2個或2個以上的伴孢體。2. 培養(yǎng)特征菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上為圓形，邊緣呈細絲狀，表面光滑、濕潤而粘稠，半透明。第七十五頁，共九十頁。-病原細菌3. 生理特性 球形芽

45、孢桿菌易于在人工培養(yǎng)基上生長，能在含蛋白質(zhì)的不同培養(yǎng)基中生長。不同菌株對蛋白質(zhì)濃度(nngd)的要求水平不同，有的菌株在蛋白質(zhì)含量高的培養(yǎng)基中芽孢形成多，產(chǎn)毒能力強，而另一些菌株的產(chǎn)毒能力則被抑制。 球形芽孢桿菌缺乏糖酵解途徑和己糖磷酸化途徑的葡萄糖激酶、己糖激酶以及磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，不能利用糖類作為碳源和能源。 菌體生長還需要生物素和硫胺素。芽孢的形成，需供氧充足，還需要無機鹽和大量的氨基酸或蛋白質(zhì)作氮、碳源。 球形芽孢桿菌最適生長溫度為2428，1015菌體生長發(fā)育緩慢，超過35發(fā)育加快，但抑制芽孢的形成與毒素的產(chǎn)生。最適生長的pH為68。第七十六頁，

46、共九十頁。-病原細菌（二）球形芽孢(y bo)桿菌的分類主要(zhyo)采用H抗原血清型作為指標，DNA同源性以及對噬菌體的敏感性。目前已有49個H血清型，有活性菌株屬9個H血清型。大部分高毒力菌株屬于血清型H5、H6和H25。 菌 株來 源H-血清型殺蚊活性晶體基因MtxMtx2 Kellen K Kellen Q BS-191 SSII-1 LAB 881 LP1-G 1593 M 2362 2317-3 1691 IAB 59 312314-22297(MR4) 2173(ISPC5) IAB 872 美 國 美 國 印 度 印 度 加 勒 新加坡印度尼西亞 尼日利亞 泰 國 薩爾瓦多

47、加 勒 土耳其泰 國 斯里蘭卡 印 度 加 勒 1a la 1a 2a2b 3 3 5a5b 5a5b 5a5b 5a5b 6 9a9c 9a9b 25 26a26b 48 低 低 高 中 高 中 高 高 高 高 高 低 低 高 中 高+第七十七頁，共九十頁。-病原細菌（三）對蚊幼蟲(yuchng)的致病性及致病機理1. 球形芽孢桿菌對蚊幼蟲的致病性對庫蚊屬（Culex）、按蚊屬（Anopheles）、伊蚊屬（Aedes）和鱗蚊屬（Psorophora）的蚊幼蟲有致病性。大多數(shù)庫蚊對球形芽孢菌最敏感，按蚊中等敏感，伊蚊最不敏感。庫蚊中，淡色庫蚊、致倦庫蚊最為敏感，三帶喙庫蚊次之。2. 球形芽孢

48、桿菌產(chǎn)生的毒素產(chǎn)生兩種對蚊幼蟲具有殺蟲活性的毒素，即二元毒素（Binary Toxin，簡稱Btx）和殺蚊幼蟲蛋白（Mosquitocidal Toxin，簡稱Mtx）。二元毒素，又稱伴孢體毒素，由兩種蛋白質(zhì)P51和P42組成，其相應的編碼基因，即p51和p42，已經(jīng)證實定位于染色體上。單獨的P51和P42對蚊幼蟲無毒，二者相互(xingh)協(xié)同，才能發(fā)揮最大的毒殺作用。Mtx毒素現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)有三種，即Mtx、Mtx2和Mtx3，Mtx毒素是從Bs SSII-1中分離出來的，由870個氨基酸組成，分子量為100kDa。Mtx2和Mtx3是從Bs SSII-1中分離得到的30.8和35.8kDa蛋

49、白，Mtx毒素能被蚊幼蟲腸道蛋白酶作用而酶解為27kDa和70kDa兩個片段，相當于N端和C端區(qū)。27kDa片段包含的一個短區(qū)域?qū)谵D膜功能域；70kDa片段包括3個約90個氨基酸的重復區(qū)，但功能不詳。 第七十八頁，共九十頁。-病原細菌3. 球形芽孢桿菌的致病機理（1）致病機理： 是通過毒素或與孢子囊有關(yugun)的毒素或芽孢實現(xiàn)的。球形芽孢桿菌對敏感幼蟲的作用包括以下幾個階段： 孢晶混合物被蚊幼蟲吞食； 伴孢晶體在蚊中腸蛋白酶和高pH的雙重作用下溶解，釋放出P51（51.4kDa）和P42（41.9kDa）的蛋白； P51和P42原毒素蛋白被進一步降解為43kDa和39kDa的活性多肽

50、； 毒性肽與胃盲囊和中腸后段上皮細胞結合； 毒素進入上皮細胞通過目前尚不清楚的方式實現(xiàn)毒殺作用。（2）組織和細胞病理：致倦庫蚊感染了C3-4l菌株，組織病理變化主要發(fā)生在胃盲囊、中腸前段和后段。中腸前段上皮細胞脫落、膨脹，進而破裂瓦解，而中腸后段上皮細胞病變則是脫落、膨脹，而后出現(xiàn)空泡，最后由于細胞脫落和破壞，中腸僅剩下完整的基底膜。胃盲囊的病變發(fā)生較遲，中腸中段細胞無明顯的病變。 第七十九頁，共九十頁。-病原細菌五、金龜子乳狀病芽孢(y bo)桿菌日本金龜子芽孢桿菌（Bacillus popilliae）和緩死芽孢桿菌（Bacillus lentimorbus）是引起日本金龜子（Popill

51、ia japonica）等幼蟲乳狀?。∕ilky disease）的兩種專一性殺蟲芽孢桿菌，屬芽孢桿菌屬（Bacillus）。由于感染后菌體在幼蟲血淋巴中進行繁殖并形成芽孢，而使病蟲蟲體呈不透明的乳白色，刺破蟲體，流出的血淋巴為乳白色，故稱之“乳狀病乳狀病”。乳狀菌在世界上分布很廣，北美、澳洲、亞洲以及歐洲均有發(fā)現(xiàn)。我國自1974年以來進行金龜子芽孢桿菌的研究，先后在河北、河南、山東、山西、陜西、黑龍江、福建等省陸續(xù)(lx)發(fā)現(xiàn)和分離到我國自己的菌株和若干新變種，如從華北大黑金龜子幼蟲分出的山東變種（B. p. var. shandong）、從鰓金龜分出的蓬萊變種（B. p. var. penglai）、從麗金龜分出蒙古變種（B. l. var. mongolica）、從棕金龜分出鰓金龜變種（B. p. var. holotrichiae）等。同時進行了寄主范圍、菌劑制作、應用技術和離體培養(yǎng)等方面的研究。 第八十頁，共九十頁。-病原細菌（一）形態(tài)(xngti)特征和生物學特性1. 形態(tài)特征(tzhng) 日本金龜子芽孢桿菌營養(yǎng)體桿狀，兩端近圓形，單生或成對，不運動，活營養(yǎng)體大小為0.50.8 m1.35.2 m。革蘭氏陽性。形成芽孢時營養(yǎng)體逐漸呈紡錘形，芽孢卵圓形，大小為0.91.3 m1.82.