木瓜蛋白酶提取實(shí)驗(yàn)PPT

1、超濾法（實(shí)驗(yàn)室條件不支持，得率較低）鹽析法（純度相對(duì)較高，但大量的鹽，降低了木瓜蛋白酶的活性）絮凝法（酶純度不高，雜質(zhì)含量較高。）超聲波法、親和膜色譜法、雙水相萃取（實(shí)驗(yàn)室條件不支持、且耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)難度較高）因此根據(jù)酶的理化性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室的條件、操作可行性、時(shí)間等條件綜合考慮，提取本實(shí)驗(yàn)方案，力求最大限度利用現(xiàn)有資源。來(lái)達(dá)到較高活力回收、高純度的分離純化的目的。實(shí)驗(yàn)原理取木瓜乳汁過(guò)濾粗提（酶液1）20硫酸銨一次純化45硫酸銨二次純化（酶液4）60乙醇純化（酶液9）透析除鹽（酶液9）60乙醇純化（酶液5）20硫酸銨一次純化45硫酸銨二次純化（酶液8)透析除鹽(酶液8)硫酸銨+乙醇乙醇+硫酸銨粗提粗

2、提 取木瓜乳汁5ml，加蒸餾水至100ml攪拌1小時(shí)紗布過(guò)濾 3500轉(zhuǎn)/min離心15min,留上清2020硫酸銨硫酸銨一次純化一次純化4545硫酸銨硫酸銨二次純化二次純化 取20ml上清加2ml酶保護(hù)劑，加飽和硫酸銨5.5ml使其達(dá)到飽和度的20%12.5ml,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min，取上清 加飽和硫酸銨12.5ml使其達(dá)到飽和度的45%,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min,取沉淀，10ml蒸餾水稀釋?zhuān)?060乙醇純乙醇純化化透析透析 加入1ml眉保護(hù)劑，加18.6ml的冷無(wú)水乙醇使其濃度達(dá)到60%，調(diào)節(jié)PH為6.0，靜置過(guò)夜 4000轉(zhuǎn)離心30min，取沉淀，加1

3、0ml蒸餾水稀釋 透析，將稀釋液裝入處理好的透析袋中，透析袋置于裝蒸餾水的大燒杯中，在搖床上震搖，每半小時(shí)更換一次蒸餾水，至燒杯中蒸餾水滴加到氯化鋇溶液中無(wú)白色沉淀生成，取出透析袋里的酶液，測(cè)濃度及酶活粗提 取木瓜乳汁5ml，加蒸餾水至100ml攪拌1小時(shí)紗布過(guò)濾 3500轉(zhuǎn)/min離心15min,留上清60乙醇純乙醇純化化 取20ml上清加2ml酶保護(hù)劑，33ml冷無(wú)水乙醇使其濃度達(dá)到60% 調(diào)節(jié)PH為6.0，4攝氏度靜置過(guò)夜2020硫酸銨硫酸銨一次純化一次純化4545硫酸銨硫酸銨二次純化透二次純化透析析 4000轉(zhuǎn)離心30min，取沉淀，加10ml蒸餾水稀釋 加1ml酶保護(hù)劑，加飽和硫酸銨

4、2.55ml使其達(dá)到飽和度的20%,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min，取上清 加飽和硫酸銨5.68ml使其達(dá)到飽和度的45%,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min,取沉淀，10ml蒸餾水稀釋 透析。將稀釋液裝入處理好的透析袋中，透析袋置于裝蒸餾水的大燒杯中，在搖床上震搖，每半小時(shí)更換一次蒸餾水，至燒杯中蒸餾水滴加到氯化鋇溶液中無(wú)白色沉淀生成，取出透析袋里的酶液，測(cè)濃度及酶活y = 0.0391x + 0.01448R2 = 0.9902100.10.20.30.40.50.60.70.80.90.05.010.015.020.025.0吸光度值蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ug/ml）考馬斯

5、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶活力單位（U U）定義：每分鐘水解酪蛋白生成 1酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U U）。酪蛋白ml酶液ml三氯乙酸ml酶液ml吸光度待測(cè)液5.0150度水預(yù)熱10min5.050度水預(yù)熱10min/靜置10min充分過(guò)濾，濾液以水為對(duì)照在275nm處側(cè)吸光值A(chǔ)空白對(duì)照5.0/5.01.0A0酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液取酪氨酸溶液，以蒸餾水為空白，測(cè)定吸光度An編號(hào)吸光度值稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得值濃度（ug/ml)測(cè)得蛋白質(zhì)濃度(ug/ml)體積(ml)蛋白質(zhì)（酶）含量(mg)硫酸銨+乙醇10.676 50016.91 8455.0 20.00 169.1 粗提20.615 50015

6、.35 7675.0 27.50 211.1 硫酸銨一次純化上清40.292 5007.09 3545.0 10.00 35.5硫酸銨二次純化沉淀90.228 5005.46 2730.0 10.00 27.3乙醇沉淀編號(hào)編號(hào)稀釋倍稀釋倍數(shù)數(shù)待測(cè)管吸待測(cè)管吸光度光度對(duì)照管吸對(duì)照管吸光度光度絡(luò)氨酸標(biāo)準(zhǔn)液酶酶活活(u)(u)蛋白質(zhì)（酶）蛋白質(zhì)（酶）含量含量(mg)酶酶比活比活(u/mg)(u/mg)硫酸銨硫酸銨+ +乙乙醇醇110000.0 1.348 0.328 0.57968,911.9169.1410.0 粗提213750.0 0.270 0.226 57,469.80211.1270.0

7、硫酸銨一次純化上清4 5000.0 0.274 0.193 38,471.535.51090.0 硫酸銨二次純化沉淀9 5560.0 0.479 0.308 62,850. 127.32300.0 乙醇沉淀95560.0 0.433 0.314 70,314.027.32570.0 透析硫酸銨硫酸銨+ +乙醇乙醇編號(hào)吸光度值稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得值濃度（ug/ml)測(cè)得蛋白質(zhì)濃度(ug/ml)體積(ml)蛋白質(zhì)（酶）含量(mg)乙醇+硫酸銨10.676 50016.91 8455.0 20.00 169.1粗提50.762 50019.11 9555.0 10.00 95.6乙醇沉淀60.633

8、 50018.28 9140.0 12.50 114.3硫酸銨一次純化上清80.173 5004.06 2030.0 10.00 20.3硫酸銨二次純化沉淀編號(hào)編號(hào)稀釋倍稀釋倍數(shù)數(shù)待測(cè)待測(cè)管管 吸光度吸光度對(duì)對(duì)照管照管 吸光度吸光度絡(luò)氨酸標(biāo)絡(luò)氨酸標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)液酶酶活活(u)(u)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（酶（酶） 含量含量(mg)酶酶比活比活(u/mg)(u/mg)乙醇乙醇+ +硫酸銨硫酸銨1100001.3480.3280.57968911.9169.1410.0 粗提550000.2840.20139421.4 95.6410.0 乙醇沉淀669400.5330.43231643.5114.3280.0

9、硫酸銨一次純化上清873000.4370.39720,737. 520.3102 0.0硫酸銨二次純化沉淀8 73000.4380.38240,954. 520.32020.0透析乙醇乙醇+ +硫酸銨硫酸銨SDS-PAGE電泳樣品處理 每孔點(diǎn)樣量20l。取酶液15l于1.5EP管，加5l上樣緩沖液，至沸水中煮沸10min，冷卻后可點(diǎn)樣。電泳 開(kāi)始用80V恒壓電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠界面后改用120V繼續(xù)電泳，至可見(jiàn)的藍(lán)色染液條帶已接近膠板底部約1-2cm處停止電泳，總用時(shí)約1.5h。脫色 關(guān)閉電源取下膠，放在染色液中染色30min左右，再放入脫色液中脫色(不斷換脫色液)至可以清楚的看到條帶為止。 1：酶液1（粗提）；硫酸銨+乙醇 4:酶液4（硫酸銨沉淀）； 9:酶液9(乙醇沉淀)； 9:9透析過(guò)后乙醇+硫酸銨 5:酶液5(乙醇沉淀); 8:酶液8(硫酸銨沉淀)； 8: 8透析過(guò)后基于本實(shí)驗(yàn)硫酸銨+乙醇相比較而言更好，提出的酶比活更高硫酸銨對(duì)酶的活性可能存在抑制酶保護(hù)劑、硫酸銨和乙醇的條件選擇、離心轉(zhuǎn)速、反應(yīng)時(shí)間、PH等多種因素均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。蛋白質(zhì)含蛋白質(zhì)含量（量（mgmg）酶活（酶活（u u）酶比活酶比活(u/mg)(u/mg)乙醇乙醇+ +硫