通過L型鈣通道抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖活力

1、Urocortin通過L-型鈣通道抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖活力本課題為江蘇省衛(wèi)生廳教育研究室科研項目（J200410）。羅惠媛1，2，陶金1（1南京醫(yī)科大學藥理系 2. 江蘇省揚州環(huán)境資源職業(yè)技術學院醫(yī)學系）摘要 目的:探索Urocortin對大鼠血管平滑肌細胞增殖活力抑制作用的機制。方法:分離、培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞，加入不同濃度的UCN以及藥物培養(yǎng)，運用MTT法實驗，觀察UCN對血管平滑肌細胞增殖活力的抑制作用及相關機制。結(jié)果:UCN能夠濃度依賴性地降低大鼠血管平滑肌細胞的活力，且UCN 能抑制Bay K8644對細胞活力的增強作用。結(jié)論:UCN通過阻斷L-型鈣通道而濃度依賴性地抑制血管

2、平滑肌細胞的增殖活力。關鍵詞 Urocortin 血管平滑肌細胞（VSMC） L-型鈣通道 MTT法INHIBITION OF UROCORTIN ON THE VIABILITY OF ADULT RAT VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS VIA L-TAPE CALCIUM CHANNELSLUO Hui-yuan1,2， TAO Jin1( 1. Department of Pharmacology, Nanjing Medical University, 210029; 2. Medical Department, Yangzhou environment an

3、d resources vocational college )Abstract: Objective：To investigate the mechanisms of urocortin(UCN) on the viability of adult rat vascular smooth muscle cells(VSMC). Methods：Rat aortic VSMC were isolated from rats thoracic aorta .VSMC treated with different concentrations of UCN and other drugs. By

4、using the MTT assay, we investigated the effects of UCN on the viability of VSMC and the relative mechanisms. Results：UCN significantly inhibited the viability of VSMC and pre-treatment of the cells with UCN could markedly reduce the effect of Bay K8644, which could increase the viability of VSMC. C

5、onclusion：UCN reduces the viability of adult rat vascular smooth muscle cells via inhibiting L-type calcium channels.Key Words: Urocortin; vascular smooth muscle cells(VSMC); L-type calcium channels ; MTT assayUrocortin（UCN）是機體內(nèi)分泌的一種40個氨基酸多肽，它屬于促腎上腺皮質(zhì)激素（CRF）類家族，與CRF 在氨基酸序列上有45%的同源性。起初發(fā)現(xiàn)于大鼠腦組織中1，然后在人

6、體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)其存在2。UCN廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)等，是具有生物活性的神經(jīng)肽，可激活腺苷酸環(huán)化酶使細胞內(nèi)的cAMP聚集3 。它與表達在心臟和血管上的2型CRF受體有高度親和力1，4，具有心血管保護作用。在血管方面，UCN能引導內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性血管松馳作用5，6。提示UCN可能直接影響血管平滑肌細胞（VSMC）的功能。近幾年關于UCN 與離子通道的關系也成為研究的熱點。有研究表明，在大鼠離體基底動脈中，UCN介導的血管松馳作用與K+通道開放有關系7。UCN還能通過激活大鼠肺動脈的鋇敏感性的鉀通道起到舒張肺動脈的作用8。最近研究報道，UCN能

7、夠通過L-型Ca2+通道降低鈣內(nèi)流，起心臟保護作用9。一方面，VSMC在血管重構（VR）中起重要作用10，11。另一方面，血管松馳或重構與Ca2+內(nèi)流高度相關12，13。眾所周知，L-型鈣通道是VSMC中主要鈣通道類型。Ca2+內(nèi)流主要通過L-型鈣通道。雖然VSMC在血管生理病理中非常重要，然而，關于UCN對VMSC的作用很少知道。本實驗室在以往實驗中已發(fā)現(xiàn)UCN具有抑制血管平滑肌細胞增殖的作用14,但缺乏對其作用與鈣離子通道的關系的研究。本實驗旨在運用法測定UCN對VSMC活性的影響并對其作用與鈣通道的關系進行研究，以進一步闡明UCN對血管重構的作用。一、材料和方法1.動物和藥品成年Spra

8、gue-Dawley(SD)公鼠，重約200-300g。Urocortin,Astressin,Verapamil,Glybenclamide,Bay K8644分別購自Sigma公司。胰蛋白酶購自AMRESCO公司。小牛血清購自HYCLONE公司。DMEM培養(yǎng)液購自GIBCO公司。2.試劑配制D-HanKs 溶液成份：8g/L NaCl, 0.4g/L KCl, 0.06g/L Na2HPO4, 0.06g/L KH2PO4, 0.35 g/L NaHCO3, pH用NaHCO3溶液調(diào)至7.4。PBS溶液組成：8g/L NaCl, 0.2g/L KCl, 2.85g/L Na2HPO4, 0

9、.28g/L KH2PO4。細胞培養(yǎng)液: 13.4g/L DMEM細胞培養(yǎng)基, 3.7g/L NaHCO3, 10%小牛血清(FBS), 100U/ml青霉素, 100ug/ml鏈霉素, pH用HCl或NaOH調(diào)至 7.3。3.VSMC分離、培養(yǎng)采用組織貼塊法。于無菌狀態(tài)下急性取大鼠胸主動脈，浸于PBS液中。謹慎去內(nèi)皮，將中層平滑肌剪成2mm2大小，內(nèi)膜面向下等距離粘于培養(yǎng)瓶壁。8小時后加入含10%小牛血清的DMEM，置于潮濕的37孵育箱內(nèi)（95%空氣和5%CO2）培養(yǎng)。應用光鏡、免疫組化法鑒定血管平滑肌細胞，用0.1胰蛋白酶消化成細胞懸液，傳代、繼續(xù)培養(yǎng)。第4-5代細胞種于96孔培養(yǎng)板，用于

10、實驗。4.MTT法實驗VSMC接種在96孔平板上（每孔200l）。沉淀后加入不同濃度的UCN（10-10-10-5M）或者UCN與其它藥物，六孔為一組。六個對照組中加入培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時。然后每孔加MTT液20l，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液150l，輕搖十分鐘，再在酶標儀上以波長570nm進行比色測定OD值（樣本的吸光度）。5.數(shù)據(jù)分析實驗數(shù)據(jù)以均值標準誤(MeanS.E.M)表示。采用One-way ANOVA統(tǒng)計學處理。二、結(jié)果1.UCN對VSMC增殖活力的抑制作用如Fig.1所示，UCN顯著抑制VSMC的增殖活性，該抑制作用呈濃度依賴性。在10-10、10-9

11、、10-8M時，UCN不能明顯影響細胞增殖活力，而當濃度上升至10-7M時，UCN顯著抑制VSMC的活力，其吸光度下降率達26.41.4%（N=6，P0.01）。2.Astressin,Glybenclamide,Bay K8644和Verapumil對UCN抑制VSMC活力作用的影響如Fig.2,3,4所示,當VSMC先與CRF受體阻滯劑Astressin（10-6M）作用，加入UCN（10-7M）培養(yǎng)后，吸收率從1.100.01降至0.80 0.02 (n =6, P 0.05)，能抑制VSMC的增殖活力，但與不加Astressin無明顯差異。這表示Astressin不能影響UCN對VSM

12、C 的抑制作用。KATP通道阻滯劑，Glybenclamide(10-5M)，單獨作用于細胞不能影響VSMC的活力，同樣它也不能影響UCN的抑制作用。而特殊的L-型鈣通道激動劑，BayK8644(10-6M)，一方面能增加VSMC的活力，而且UCN能顯著降低BayK8644對細胞活力的增強作用（n=6,p0.01）。L-型鈣通道阻滯劑，Verapamil(2.510-6M)，能降低VSMC的活力，然而，在UCN（10-7M）的作用下，Verapamil不能進一步降低細胞的活性。Fig. 102040608010-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5UCNMInhibition

13、 on the viability of VSMC#* (% of control)Fig.1: Effect of UCN on the viability of VSMC. Values were represented as mean S.E.M. Data were analyzed with t-test .*P0.05, compared to control; #P0.01, compared to control (n=6).Fig. 2 Astressin UCN UCN+Astressin0510152025Inhibition on the viability(% of

14、Control)#*Fig.2: Effects of Astressin(10-5M) on VSMC viability (n=6).#P0.05 vs. UCN(10-7M). Fig.3 Gly UCN UCN+Gly0510152025Inhibition on the viability(% of Control)#*Fig.3: Effects of Gly (10-5M) on VSMC viability in the absence and presence of UCN (10-7M) (n=6). #P0.05 vs. UCN (10-7M).Fig.4 Control

15、 UCN Bay BAY+UCN Ver Ver+UCN00.20.40.60.811.21.41.61.8Absorbance(At 570 nm)#*Fig.4: Effects of UCN (10-7M), BayK8644 (10-6M), and verapemil (2.510-6M) on VSMC viability (n=6). #P0.01 vs. control; *P0.01 vs. BayK8644 (10-6M).三、討論高血壓病是目前世界上最常見、發(fā)病率最高的疾病，是冠心病和腦血管疾病的主要危險因素。VR的過程包括VSMC的內(nèi)皮損傷、移行、增生15。特別是增生被

16、認為是VR的重要因素16，17，所以針對VR發(fā)生機制以逆轉(zhuǎn)VR是防治高血壓及其靶器官損害的關鍵12。UCN是一種由四十個氨基酸組成的多肽，屬于CRF家族，它通過自分泌和旁分泌途徑發(fā)揮其廣泛的生理、藥理作用18，19。UCN對心血管系統(tǒng)和其它系統(tǒng)如子宮、淋巴細胞、大腦的作用，已被普遍研究。它與表達在心臟和血管上的2型CRF受體有高度親和力1，4。有報道，UCN能劑量依賴性地提高心率、心輸出量、冠脈血流4，20。在體外試管實驗中，UCN在缺氧前和再供氧時均能保護新生大鼠的心臟細胞，同時在離體試驗中，UCN能減少缺血/再灌注損傷的成年大鼠的心肌梗死面積21，22。在血管方面，UCN能介導內(nèi)皮依賴性和

17、非內(nèi)皮依賴性血管松馳作用，表明UCN與VSMC之間有一定關系。在以往的實驗中，我們使用了3H-thymidine 滲入法實驗證實了UCN對大鼠VSMC增殖具有抑制作用，但在該實驗中沒有對其作用機理作充分研究14。本實驗運用MTT法進一步觀察了UCN對VMSC增殖活力的影響，并對其作用機理進行了探討。MTT全名四甲基偶氮唑鹽。細胞特別是增殖期活細胞可通過線粒體能量代謝中的琥鉑酸脫氫酶的作用使淡黃色的MTT分解，形成藍色結(jié)晶物沉淀在細胞中，形成量與細胞增殖狀況成正比。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含結(jié)晶物的量成正比。再在酶標儀上以波長570nm進行比色測定OD

18、值（樣本的吸光度）。有標準曲線顯示：細胞數(shù)與MTT吸收率呈正相關（R=0.983），因此，MTT法是一種通過測定細胞能量代謝水平來間接反映細胞增殖情況的檢測方法，可以用它來測定VSMC的活力15。本實驗結(jié)果顯示：UCN能夠濃度依賴性抑制VSMC的增殖活力，這表明UCN可能是VR中有益的血管活性因子。為進一步闡明其作用機理，本實驗發(fā)現(xiàn)，KATP阻滯劑（GLY）不能影響UCN對VSMC 的抑制作用。CRF阻滯劑（Astressin）也不能影響UCN的抑制作用。Ca2+通道激動劑(Bay K8644)，能夠增加VSMC的增殖活力，并且UCN能顯著降低Bay K8644 的這一作用。Bay K8644

19、（10-6M），是電壓門性鈣通道激動劑，能夠增強Ca2+內(nèi)流,從而增加VSMC的增殖活力。細胞被UCN(10-7M)作用后，能減少Bay K8644介導的鈣內(nèi)流,使Bay K8644的作用受抑制。這一現(xiàn)象證明UCN可能通過電壓門性鈣通道抑制鈣離子內(nèi)流從而抑制細胞的增殖活力。本實驗室還用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)觀察到不同濃度UCN(10-7-10-5M)能夠減弱Bay K8644介導的細胞內(nèi)Ca2+熒光密度（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。L-型Ca2+通道屬電壓依賴型鈣通道，經(jīng)L-型Ca2+通道產(chǎn)生的內(nèi)向鈣電流是內(nèi)鈣釋放觸發(fā)的主要機制，所以L-型Ca2+通道的激活對細胞內(nèi)的鈣濃度升高有著極其重要的意義。

20、我們的結(jié)果顯示UCN通過Ca2+通道對VSMC起抑制作用。本實驗結(jié)果提供了有力的證據(jù)：UCN對VSMC 的增殖抑制作用和L-型鈣通道有關。基于VSMC增殖是VR的重要機制15。我們的數(shù)據(jù)進一步表明，UCN這一內(nèi)源性多肽可能與VR及其他病理過程如鈣超載作用有著密切的關系。 參考文獻1Donaldson CJ, Sutton SW, Perrin MH, et al. Cloning and characterization of human Urocortin. Endocrinology. 1996; 137: 2167-21702Vaughan J, Donaldson C, Bittenc

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