(暨實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)改革探討)

1、蛋白質(zhì)組學(xué)-方證研究的新思路（暨實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)改革探討）沈蕓上海中醫(yī)藥大學(xué)（上海 201203）關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué) 方證 一蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用 分子生物學(xué)在最近20 年中經(jīng)歷了革命性的發(fā)展,目前已有50 多種生物的基因組序列被測(cè)定完畢,生命科學(xué)的研已有50 多種生物的基因組序列被測(cè)定完畢,生命科學(xué)的研列還不能了解基因的全部?jī)?nèi)含,只有直接研究蛋白質(zhì)在特定條件下的表達(dá)情況,才能更深入地了解蛋白質(zhì)的表達(dá)、分布、加工修飾及相互作用等信息,也才能更深入地了解各種生命現(xiàn)象的機(jī)制。同時(shí)，基因組的研究已經(jīng)極大的促進(jìn)了疾病機(jī)制的研究及藥物的研究與開發(fā), 基因治療及基因工程藥物在近幾年內(nèi)得到了飛速發(fā)展,但疾病的發(fā)

2、生及治療主要發(fā)生在蛋白質(zhì)水平,僅僅依據(jù)基因的信息在很多時(shí)候還不能有效的開發(fā)新型藥物和完全解釋藥物在生物體內(nèi)的作用機(jī)制,研究細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)不僅有助于藥物的開發(fā)及疾病的治療，。 1994 年澳大利亞的Wilkins 和Williams 首先提出了蛋白質(zhì)組(proteome) 的概念:即基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì),或指細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定時(shí)間和空間所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)表達(dá)隨機(jī)體生理狀態(tài)的改變而改變,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組應(yīng)該是動(dòng)態(tài)的。比較患病細(xì)胞與正常細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,或者比較患病細(xì)胞與藥物處理后的細(xì)胞中蛋白，的表達(dá)變化,有可能發(fā)現(xiàn)一些新的藥物靶點(diǎn)及藥物。在隨后的幾年中,蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病

3、機(jī)制的研究及藥物開發(fā)中將占有越來越重要的作用。在新藥研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)可以提供細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度,通過比較病態(tài)與正常態(tài)時(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,有可能找到有效的藥物或者是藥物靶點(diǎn)。同時(shí)，通過比較正常細(xì)胞、病態(tài)細(xì)胞及藥物處理后的病態(tài)細(xì)胞的蛋白表達(dá)豐度的變化,也可以分析藥物候選者的潛在作用。例如,應(yīng)用二維凝膠電泳技術(shù)分析調(diào)血脂藥物洛伐他汀作用后的蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果,表明洛伐他汀影響了與膽固醇代謝相關(guān)的一些蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而更加明確其藥理作用。蛋白質(zhì)組學(xué)的另一應(yīng)用就是研究藥物的毒理作用。比較正常細(xì)胞與藥物處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化可以提示藥物的毒性作用機(jī)制。Steiner 等利用二維凝膠電

4、泳研究了環(huán)孢素A(cyclosporin A CsA) 對(duì)小鼠腎臟的毒性。比較正常狀態(tài)與CsA 作用后的腎臟蛋白的二維凝膠圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在CsA 作用后的腎臟蛋白二維凝膠圖譜中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異蛋白質(zhì),經(jīng)鑒定為鈣結(jié)合蛋白(calbindin) ,這種蛋白質(zhì)存在于腎小管中,參與鈣離子的結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)。現(xiàn)在已經(jīng)證明CsA 的毒性在于與小管內(nèi)鈣化有關(guān),而導(dǎo)致鈣結(jié)合蛋白不能降解。 蛋白質(zhì)組的研究流程大體可分為分離、鑒定、分析三步。即先從組織或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì),進(jìn)行雙向電泳以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離;然后進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品顯色,切下待分析的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),用胰蛋白酶膠內(nèi)消化;接著,對(duì)消化后得到的多肽片段進(jìn)行生物質(zhì)譜分析測(cè)定,

5、得到肽質(zhì)量指紋圖譜;最后,數(shù)據(jù)庫檢索對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及功能分析。涉及到雙向凝膠電脈、質(zhì)譜和生物信息學(xué)的應(yīng)用。二將蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于方證研究和實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)目前，中醫(yī)藥的客觀化/現(xiàn)代化是中醫(yī)藥能否走向國(guó)際，能否作到國(guó)際化的瓶頸問題之一。運(yùn)用的現(xiàn)代科學(xué)的研究手段驗(yàn)證和闡明方劑的配伍原則和作用原理，探討方證的關(guān)系亦是十分重要的課題。中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程已經(jīng)走了進(jìn)20年，其中有經(jīng)驗(yàn)也有教訓(xùn)，但客觀的說，作為一門學(xué)科，它越來越成熟了。不僅能更快更好地運(yùn)用最新的科技手段和方法，同時(shí)重要的是，能理性地，客觀地使用這些研究方法，將中醫(yī)辨證論治的思維精髓用于研究的指導(dǎo)思想中，真正作到科學(xué)運(yùn)用。“證”是中醫(yī)辨證的基礎(chǔ)，也

6、是中醫(yī)的精華所在，而方劑則是臨床辨證論治的產(chǎn)物，任何一首方劑的產(chǎn)生都是以辨證為依據(jù)的，是針對(duì)具體病證作出的針對(duì)性治療用藥方案。中醫(yī)的證候是疾病過程中某一階段機(jī)體對(duì)內(nèi)外致病因素的綜合反應(yīng),在宏觀上表現(xiàn)為特定的癥狀、體征及舌脈的組合;證候具有整體性,包括了體質(zhì)特征、臟腑經(jīng)絡(luò)氣血、陰陽等的失衡及相互間的關(guān)系,它反映了疾病的病因、病機(jī)及正邪斗爭(zhēng)的概括和趨勢(shì);證候具有時(shí)相性,即動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)非常重視人體的統(tǒng)一性和完整性及其與自然界的相互關(guān)系。構(gòu)成人體的各個(gè)組成部分之間,在結(jié)構(gòu)上是不可分割的,在功能上是相互協(xié)調(diào)、相互為用的,在病理上是相影響的。中醫(yī)的證候是宏觀、綜合性的全身評(píng)價(jià),同時(shí)又是復(fù)雜的。證

7、候的這個(gè)特點(diǎn)大大增加了研究的難度與復(fù)雜性。目前的部分研究結(jié)果認(rèn)為，中醫(yī)證本質(zhì)的含義是指引起證發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些物質(zhì)決定著證的發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化過程，是在證的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的特殊物質(zhì)（群）。這其實(shí)是一個(gè)相當(dāng)含糊的解釋，難免給研究者帶來困惑。利用方證相應(yīng)/方證結(jié)合的方法不僅為尋找證的物質(zhì)基礎(chǔ)帶來新的研究途徑，也為多層面闡釋方劑作用原理提供了客觀介質(zhì)。但由于中藥方劑一般由多味中藥組成，其組成成分復(fù)雜，藥理作用又是多靶點(diǎn)，多環(huán)節(jié)，多層次的整體性調(diào)節(jié)方式，對(duì)機(jī)體各個(gè)組織器官都有著廣泛的調(diào)節(jié)作用。雖然知道方劑進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮其藥理作用過程所糾正的物質(zhì)應(yīng)是存在于機(jī)體個(gè)組織器官的蛋白質(zhì)，但由于其中存在藥

8、物分子與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)雜的直接或間接的相互作用，以往的蛋白質(zhì)研究技術(shù)確實(shí)很難加以研究，而蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的出現(xiàn)為方證客觀化研究提供了一個(gè)可操作的平臺(tái)。有學(xué)者提出“證候基因組學(xué)(zhenghou genomics) ”、“證候蛋白質(zhì)組學(xué)( zhenghou pro teomics) ”,試圖在分子水平描繪中醫(yī)證候本質(zhì)的全貌。利用蛋白質(zhì)組的雙向凝膠電泳，能有效分離蛋白質(zhì)，其第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離, 第二向則按分子量的不同用SDS PAGE 分離,把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開?，F(xiàn)在, 雙向凝膠電泳的一塊膠板(16cm ×20cm) 可分出3 , 000

9、4 ,000 個(gè)、甚至10 ,000 個(gè)可檢測(cè)的蛋白斑點(diǎn)。換句話說，它可以同時(shí)分辨生物體的某一組織或細(xì)胞中的上萬種蛋白。同時(shí)利用的質(zhì)譜技術(shù)快速而準(zhǔn)確地鑒定出這些蛋白質(zhì)。 根據(jù)以上技術(shù)，有人方證研究提出這樣的研究路線，根據(jù)方證相應(yīng)的原理，首先制造出某一證候的動(dòng)物模型，給該證候的模型相應(yīng)的經(jīng)典方劑治療后，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法觀察相關(guān)組織的表達(dá)差異蛋白。將不同狀態(tài)下不同動(dòng)物的雙向電泳圖譜相互比較，得到的表達(dá)差異蛋白的信息可以提示：1.證本質(zhì)蛋白質(zhì)，即機(jī)體在出現(xiàn)該證時(shí)異常表達(dá)的蛋白；2. 中藥和造摸方法造成的異常表達(dá)蛋白；3.中藥方劑作用后表達(dá)的蛋白；這樣的的話，不僅能同時(shí)觀察機(jī)體在出現(xiàn)某證時(shí)復(fù)雜的蛋

10、白變化，還能排除實(shí)驗(yàn)操作時(shí)由于造模藥物和中藥不良反應(yīng)引起的表達(dá)差異蛋白質(zhì)，從而是結(jié)果更客觀，更可靠。實(shí)時(shí)多層面，多角度的觀察機(jī)體蛋白質(zhì)變化，對(duì)于方劑復(fù)雜的作用靶點(diǎn)來說，顯得更實(shí)效。以往的方劑作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)利用Weston技術(shù)，每塊膠一次觀察少數(shù)幾個(gè)蛋白的變化，為了全面闡釋復(fù)方作用機(jī)理，往往需要多次重復(fù)不同的實(shí)驗(yàn)以得到所需數(shù)據(jù)。將蛋白質(zhì)組的多系統(tǒng)研究方法運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)的意義和優(yōu)勢(shì)也在于此，作為一項(xiàng)新技術(shù)，它能帶給學(xué)生更多的知識(shí)和信息，同時(shí)激發(fā)學(xué)生更濃厚的研究興趣，充分培養(yǎng)其動(dòng)手能力。一個(gè)完整的方證研究/蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)于準(zhǔn)確揭示方劑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的作用和作用機(jī)理是幾個(gè)類似的簡(jiǎn)單的方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)都不能達(dá)到的。三存在的問題和解決辦法由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室和研究人員的要求較高，同時(shí)其實(shí)驗(yàn)試劑和相應(yīng)的質(zhì)譜技術(shù)較為昂貴，需要大量的資金支持才能開展和保證正常運(yùn)轉(zhuǎn)。所以蛋白質(zhì)組學(xué)在方證研究中的應(yīng)用難以在各個(gè)高等院校普遍開展。同時(shí)由于該技術(shù)開展的時(shí)間并不長(zhǎng)，勢(shì)必在研究過程中存在重復(fù)性和穩(wěn)定性的問題，而對(duì)于方證體系這樣一個(gè)多系統(tǒng)，多器官并處于動(dòng)態(tài)變化過程中的體系，怎樣運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)深入闡釋，確實(shí)任重道遠(yuǎn)。但中醫(yī)藥研究需要發(fā)展，需要運(yùn)用一些可能現(xiàn)代科技手段，以揭示其奧妙的內(nèi)在機(jī)理，