萊克多巴胺檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

1、浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布2005-03-17實(shí)施2005-02-17發(fā)布飼料中萊克多巴胺的測(cè)定Determination of ractopamine in feedstuffsDB33/T 5392005DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 65.120B 46備案號(hào)：前 言本標(biāo)準(zhǔn)是在參閱了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)我國(guó)技術(shù)發(fā)展水平研究制定的，采用了酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜熒光檢測(cè)法和氣相色譜-質(zhì)譜法。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)起草，浙江一星集團(tuán)飼料有限責(zé)任公司參與起草。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳慧華、吳平谷、應(yīng)永飛、任玉琴、屈健、周文

2、海、陳勇、浦琴華。飼料中萊克多巴胺的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以酶聯(lián)免疫（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法檢測(cè)飼料中萊克多巴胺的方法，規(guī)定GCMS法為仲裁法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料和飼料添加劑中萊克多巴胺的測(cè)定。酶聯(lián)免疫（ELISA）法為篩選方法，檢測(cè)限為0.01mg/kg，高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法為定量方法，定量限HPLC法為0.1mg/kg、GCMS法為0.05mg/kg。線性范圍：酶聯(lián)免疫（ELISA）法為0.005ng-0.05ng，高效液相色譜（HPLC）法為2.5ng-10ng，氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法為0.05ng-1

3、.0ng。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T 14699.1 飼料采樣方法3 試樣制備按GB/T 14699.1抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取約200g，粉碎至過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。第一法 酶聯(lián)免疫法4 原理與方法4.1 原理本測(cè)定方法是酶聯(lián)免疫法中的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法，其

4、主要原理是：吸附在孔內(nèi)的萊克多巴胺與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的萊克多巴胺競(jìng)爭(zhēng)性地與萊克多巴胺抗體相結(jié)合，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品相結(jié)合的萊克多巴胺抗體被洗滌去除后，只剩下與微孔內(nèi)藥物相結(jié)合的抗體，其再與加入的酶標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合，酶底物在酶作用下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，吸光度的高低與樣品中萊克多巴胺的含量成反比。4.2 方法采用萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒或類似產(chǎn)品，按試劑盒的使用說明操作。5 試劑和溶液5.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。5.2 PBS緩沖液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮PBS緩沖液。5.3 工作洗液：用水20倍稀釋廠商提供的濃縮洗液。5.4 乙酸乙

5、酯。5.5 碳酸鹽緩沖液：稱取4.3g碳酸鈉（Na2CO310H2O），2.9g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水至1000mL，搖勻，調(diào)節(jié)pH值至9.5。5.6 提取液：取10mL甲醇，加90mLPBS緩沖液，搖勻。5.7 甲醇。5.8 第二抗體工作液：用第二抗體稀釋液2500倍稀釋第二抗體。6 儀器與設(shè)備6.1 微孔板酶標(biāo)儀(帶450nm濾光片)。6.2 振蕩器。6.3 冷凍離心機(jī)。6.4 微量加樣器及配套吸頭：20L, 50L, 100L, 200L 。6.5 冰箱。6.6 洗板機(jī)。6.7 生化培養(yǎng)箱。6.8 氮吹儀。6.9 分析天平：感量0.01g。7 測(cè)定步驟7.1 注意事項(xiàng)不同品牌的試

6、劑盒其操作步驟可能略有差別，具體操作步驟可根據(jù)試劑盒使用說明書略作調(diào)整。7.2 試樣處理取3g試樣于50mL離心管中，加入6mL提取液（5.5），上下手搖數(shù)次，加入6mL碳酸鹽緩沖液（5.4），再加入8mL乙酸乙酯（5.3），振蕩30min；以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，移取2.0mL上層有機(jī)相至另一新試管中，氮吹至干。加入50L甲醇（5.6）溶解殘余物后，再加入450L PBS緩沖液（5.1），即為供試溶液，取50L進(jìn)行ELISA測(cè)定。7.3 測(cè)試程序7.3.1 根據(jù)所測(cè)定樣品及標(biāo)準(zhǔn)數(shù)，計(jì)算出所需微孔條數(shù)，將微孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)孔的平行重復(fù)，記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。7.3.

7、2 加入50L的標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行重復(fù)。7.3.3 加入100L第一抗體溶液到每一個(gè)微孔中，在37孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250L，重復(fù)操作兩遍。最后用吸水紙吸干。7.3.4 加入150L稀釋的酶標(biāo)記的第二抗體（5.7）37孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250L，重復(fù)操作兩遍。最后用吸水紙吸干。7.3.5 加入100L酶底物液到微孔中，充分混合并在室溫孵育5-10min

8、。7.3.6 加入50L反應(yīng)終止液到微孔中，混合后在450nm處測(cè)量吸光度值。8 結(jié)果計(jì)算以空白（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）吸光度值為100%計(jì)算，折算出各標(biāo)準(zhǔn)和樣品的相對(duì)吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值(或樣品) 相對(duì)吸光度值（%） = 100 空白的吸光度值計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)吸光度值繪成為一個(gè)對(duì)應(yīng)濃度(ng/L)的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000ng/L范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度(ng/L)可以從校正曲線上讀出。第二法 高效液相色譜法9 方法原理用2氨/甲醇溶液提取試樣中的萊克多巴胺，經(jīng)固相萃取柱凈化，濃縮后用2乙酸溶液定容，用高效液相色譜熒光檢測(cè)法分離測(cè)定。 10 試劑和

9、溶液10.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。10.2 乙腈：色譜純。10.3 甲醇。10.4 乙腈。10.5 乙酸乙酯。10.6 冰醋酸。10.7 無水硫酸鈉。10.8 戊烷磺酸鈉：色譜級(jí)。10.9 正己烷。10.10 氨水。10.11 50乙腈/乙酸乙酯溶液：取250mL乙腈加乙酸乙酯至500mL，混勻。10.12 50甲醇/乙酸乙酯溶液：取250mL甲醇加乙酸乙酯至500mL，混勻。10.13 2乙酸溶液：取5mL冰醋酸加水至250mL，混勻。10.14 固相萃取柱固相萃取柱的填充料為聚苯乙烯。）：每根柱填料量為500mg，柱體積5

10、mL。10.15 2氨/甲醇溶液：取20mL氨水加甲醇至1000mL，混勻。10.16 戊烷磺酸鈉溶液：取800mL水，加20mL冰醋酸和0.87g戊烷磺酸鈉（C5H11O3SNaH2O），混勻。10.17 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液10.17.1 萊克多巴胺貯備液（250g/mL） 精密稱取萊克多巴胺對(duì)照品25mg，置100mL容量瓶中，用甲醇（10.2）溶解并定容至刻度，置-20冰箱中，可保存3個(gè)月。10.17.2 萊克多巴胺稀釋液 (5g/mL) 精密量取1mL萊克多巴胺貯備液（10.16.1），置50mL棕色容量瓶中，用甲醇（10.2）稀釋并定容至刻度，為萊克多巴胺工作液。10.17.3 萊克

11、多巴胺工作溶液 分別準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液（10.16.2），用2乙酸溶液（10.12）稀釋、定容，配制成濃度為0.10g/mL、0.20g/mL、0.50g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL、5.0g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。11 儀器設(shè)備11.1 高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器）。11.2 冷凍離心機(jī) 能達(dá)到5000rpm。11.3 振蕩器。11.4 離心管 50mL，10mL。11.5 微孔濾膜 0.45m。11.6 渦旋混合器。11.7 分析天平 精度0.0001g。11.8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。11.9 雞心瓶 50mL。11.10 氮吹儀。12 測(cè)定步驟12.1 試樣提取稱取試樣3.0g，準(zhǔn)

12、確加入2氨/甲醇溶液（10.14）25mL，渦旋振蕩1min，超聲振蕩10min，5000rpm離心5min，取上清液10 mL 至雞心瓶中，50旋轉(zhuǎn)蒸干。12.2 試樣凈化用2mL甲醇（10.2）和2mL正己烷（10.8）溶解雞心瓶中的殘余物，重復(fù)一次，棄去上層；再加入2mL正己烷（10.8），重復(fù)一次，分出甲醇至10mL離心管中，45下氮?dú)獯蹈?。?mL乙酸乙酯（10.4）溶解，加少量無水硫酸鈉（10.6），5000rpm離心3min。洗滌液過固相萃取柱（10.13），先經(jīng)5mL乙酸乙酯潤(rùn)洗）用3mL50乙腈/乙酸乙酯溶液（10.10）洗滌柱子，然后用5mL50甲醇/乙酸乙酯溶液（10.1

13、1）洗脫收集，氮吹至干。12.3 定容用2乙酸溶液（10.12）定容到1mL，過膜，上機(jī)。12.4 測(cè)定12.4.1 高效液相色譜條件色譜柱：C18柱，長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5m，或相當(dāng)者。保護(hù)柱：C18柱，長(zhǎng)20mm，內(nèi)徑3.9mm，粒徑5m，或相當(dāng)者。流動(dòng)相：戊烷磺酸鈉溶液（10.15）：乙腈（10.1）80：20，使用前脫氣。流速：1.0mL/min。激發(fā)波長(zhǎng)：226nm。發(fā)射波長(zhǎng)：306nm。進(jìn)樣量：50L。12.4.2 上機(jī)測(cè)定萊克多巴胺對(duì)照溶液和試液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計(jì)算。13 結(jié)果計(jì)算試樣中萊克多巴胺的含量按下式計(jì)算： nAiCsVs

14、 X AsM式中：n樣品稀釋倍數(shù)；Ai樣品峰面積；As對(duì)照溶液峰面積；Vs定容體積（mL）；Cs對(duì)照溶液濃度（g/ mL）；M樣品重量（g）；X試樣中萊克多巴胺的含量（mg/kg）；測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。14 精密度14.1 重復(fù)性 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)平行測(cè)定間的相對(duì)偏差不大于10。14.2 再現(xiàn)性 實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定的相對(duì)偏差不大于15。第三法 氣相色譜-質(zhì)譜法15 方法原理試樣中萊克多巴胺先用2氨/甲醇溶液提取，甲醇和正己烷分配脫脂，然后用柱凈化，BSTFA（雙三甲基硅基三氟乙酰胺）+TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用GCMS法進(jìn)行定性定量分析。16 儀器與試劑16.1

15、氣-質(zhì)聯(lián)用儀。 16.2 烘箱。16.3 BSTFA（雙三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS （三甲基氯硅烷）。16.4 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（5mg/mL）：準(zhǔn)確稱取50mg 萊克多巴胺于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中備用。16.5 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，用甲醇稀釋至所需濃度。16.6 甲苯。16.7 其它儀器，同11。16.8 其它試劑，同10。17 測(cè)定步驟17.1 試樣提取同HPLC法12.1。17.2 試樣凈化同HPLC法12.2。17.3 試樣衍生 蒸發(fā)剩余物加0.1 mL BSTFA+1%TMCS（16.3），加蓋后于旋渦混

16、合器上震蕩，在80的烘箱中加熱1.0 h，氮?dú)獯蹈桑?.2mL甲苯（16.5）溶解。取適量的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（16.4），氮?dú)獯蹈桑c試樣同法進(jìn)行衍生化。17.4 色譜條件 色譜柱：5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30 m0.25 mm0.25m)，或相當(dāng)者。進(jìn)樣口溫度：300。柱溫程序：初溫150，保持3 min，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至280保持10min。 載氣：高純氦氣（99.999%）。流速：1.0mL/min，不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣量：1.0L。17.5 質(zhì)譜條件 EI源：源溫230。 電子能量：70eV。接口溫度：280。 電子倍增器電壓：1506V。 質(zhì)量掃描范圍：30550U。 選擇離子監(jiān)測(cè)方式（SIM）。監(jiān)測(cè)離子（m/z）：267、