細胞培養(yǎng)技術(shù)

1、細胞培養(yǎng)技術(shù)p 細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù)。p 通過細胞培養(yǎng)得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細胞得來，所以細胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。術(shù)。什么是細胞培養(yǎng)？什么是細胞培養(yǎng)？主要內(nèi)容主要內(nèi)容 實驗設(shè)備實驗設(shè)備 試劑及耗材試劑及耗材 清洗及滅菌清洗及滅菌 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) （細胞生長過程，細胞來源，細胞復蘇、傳代及凍存，細胞計數(shù)，活力測定，細胞污染）一一實驗設(shè)備實驗設(shè)備超凈工作臺，生物安全柜CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡離心機電熱恒溫水槽 液氮罐純水儀壓力蒸汽消毒器電熱干燥箱 超凈臺超凈臺 生物安全柜生物安全柜 酒精燈（酒精燈（），離開要熄滅），離開要熄滅 ！

2、 酒精燈（酒精燈（）CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37，5CO2 。倒置顯微鏡倒置顯微鏡純水儀純水儀 壓力蒸汽滅菌器壓力蒸汽滅菌器 電熱干燥箱電熱干燥箱由工作人員操作，注意安全！由工作人員操作，注意安全！小結(jié)一小結(jié)一實驗設(shè)備及功能實驗設(shè)備及功能超凈工作臺，生物安全柜-操作平臺CO2培養(yǎng)箱-細胞生長的空間倒置顯微鏡-觀察細胞離心機-離心收集細胞電熱恒溫水槽-加熱 液氮罐-凍存細胞純水儀-制備一級水壓力蒸汽消毒器-滅菌電熱干燥箱 -烘干器皿（酒精燈安全）（酒精燈安全）二二試劑及耗材試劑及耗材 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 緩沖液緩沖液 消化液消化液 血清血清 其他其他o 耗材耗材 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 供給

3、細胞營養(yǎng)和促使細胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。成分及作用：成分及作用： 氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位 碳水化合物：能量來源 無機鹽：幫助細胞維持滲透壓平衡 維生素：維持細胞生長的生物活性物質(zhì)，在細胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用培養(yǎng)基分類培養(yǎng)基分類 DMEM（高糖高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纖維、上皮細胞（293），一些實體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元 DMEM（低糖低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：間充質(zhì)干細胞，單抗細胞融合 RPMI 1640： 血液細胞（HL60）、一些實體瘤細胞（BT474）酚紅：酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）；酚紅可以模擬固醇類激素

4、的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導的實驗，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。 ATCC美國模式培養(yǎng)物集存庫緩沖液（洗滌細胞）緩沖液（洗滌細胞） PBS：磷酸緩沖鹽溶液具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液 （常規(guī)實驗皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學方面的研究。 Hanks：平衡鹽溶液無機鹽和葡萄糖濃度接近大部分動植物細胞的水平，可作為動植物細胞短期培養(yǎng)(幾個小時)。 D-Hanks：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時） 。消化液消化液 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 使細胞間蛋白質(zhì)水解、細胞離散。使用濃度0.25%

5、。 配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清對胰酶產(chǎn)生抑制作 用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hanks）。 EDTA溶液溶液 一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+ 、Mg2+來保持其完整性，EDTA可以螯合這些離子，可使細胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制 。 膠原酶溶液膠原酶溶液 主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼提供結(jié)

6、合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細胞的起到某些保壁免受機械損傷、對培養(yǎng)中的細胞的起到某些保護作用。護作用。 保存血清最好的方法？保存血清最好的方法？ 建議血清保存在-20。解凍后存放于4時，請勿超過一個月。 （分裝） 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損? 建議從冷凍箱取出后，置于28冰箱使之緩緩慢解凍、融解慢解凍、融解。使用時，必須將解凍的血清充分充分混勻混勻，并且勿將血清置于37太久。 血清血清青霉素青霉素- -鏈霉素溶液鏈霉素溶液 青霉素的工作濃度為100 U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1 mg/ml。 分別阻止細菌細胞壁合成及

7、細菌蛋白質(zhì)的組成，達到抑制細菌生長的作用，防止污染，對真菌和支原體無效。其他實驗所需的試劑其他實驗所需的試劑：藥物（如ATRA）、檢測試劑（如MTT）、細胞因子（如SCF）等試劑標注規(guī)范試劑標注規(guī)范 試劑名稱 NaCl 配制濃度 0.5 mM 配制人 張三 配制日期 耗材耗材 培養(yǎng)皿、瓶、孔板 離心管、移液管 槍尖 其他小結(jié)二小結(jié)二試劑及耗材的分類及用途試劑及耗材的分類及用途 培養(yǎng)基（成分、分類） 緩沖液 （PBS、Hanks等） 消化液（分類及應(yīng)用） 血清（作用、存儲及解凍方法） 試劑標簽要規(guī)范o耗材（分類、用途） 在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞

8、對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均均能影響培養(yǎng)細胞的生長能影響培養(yǎng)細胞的生長 微生物產(chǎn)品附帶雜物 上次細胞殘留物 非營養(yǎng)成分的化學物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 （包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個步驟）三三清洗及滅菌清洗及滅菌消毒滅菌方法消毒滅菌方法 物理消毒滅菌法物理消毒滅菌法 Co60輻射（輻射（射線）射線）：破壞生物大分子（塑料制品） 紫外線（紫外線（200-300 nm）：）：30min，阻止，阻止細菌、病毒細菌、病毒核酸合成。（細胞室：核酸合成。（細胞室：用于空氣，操作臺表面等）用于空氣，操作臺表面等） 濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：

9、濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121，20min，破壞微，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作）部分塑料耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作） 干熱：干熱：160, 2 小時，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品） 過濾：過濾：m濾膜過濾除菌（少量試劑）消毒滅菌方法消毒滅菌方法 化學消毒滅菌法化學消毒滅菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機玻璃） 1新潔爾滅 主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破

10、壞細胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。清洗的步驟滅菌的方法： -紫外線（超凈臺、生物安全柜） -高壓蒸汽滅菌（準備好放在準備室502） -75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火） 小結(jié)三小結(jié)三清洗及滅菌清洗及滅菌四四細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 生長類型 細胞來源 細胞復蘇 細胞傳代o 細胞凍存o 細胞計數(shù)o 活力測定o 污染種類細胞的生長類型細胞的生長類型 n 粘附型細胞粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。（絕大多數(shù)正常細胞及實體瘤細胞）n 懸浮型細胞懸浮型細胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。（主要是白血病細胞等）小

11、鼠單核巨噬細胞白血病細胞細胞貼壁過程細胞貼壁過程每代貼壁細胞的生長過程每代貼壁細胞的生長過程 游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細胞質(zhì)回縮，細胞游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細胞質(zhì)回縮，細胞體圓球形）體圓球形） 貼壁期（細胞平均在貼壁期（細胞平均在10分鐘分鐘4小時貼壁，底物：膠原、玻小時貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等）璃、塑料、其它細胞等） 潛伏期（有生長活動，而無細胞分裂，一般為潛伏期（有生長活動，而無細胞分裂，一般為624小時小時 對數(shù)生長期（細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳。對數(shù)生長期（細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳。 最適合進行實驗研究）最適合進行實驗研究）

12、停止期（平臺期）（細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再停止期（平臺期）（細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性）分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性）（懸浮細胞沒有貼壁過程）（懸浮細胞沒有貼壁過程） 國內(nèi)可以買到細胞株的地方有哪些？國內(nèi)可以買到細胞株的地方有哪些？n ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理n ECACC（歐洲細胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigman 中國科學院細胞研究所n 中國醫(yī)學科學院（協(xié)和醫(yī)科大學）基礎(chǔ)醫(yī)學部n 武漢大學冷藏中心等 細胞來源細胞來源 確定細胞株的培養(yǎng)信息（確定細胞株的培養(yǎng)信息（ATCC） 配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培

13、養(yǎng)基+10%胎牛血清胎牛血清+雙雙抗）、胰酶、抗）、胰酶、PBS 無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準備無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準備準備工作準備工作細胞復蘇（快融）細胞復蘇（快融）（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。（2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。（3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。（4）隔天換液，但貼壁細胞若未貼壁則勿需處理。復蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細胞。細胞傳代細胞傳代 細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)

14、）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。細胞傳代細胞傳代1 懸浮細胞傳代懸浮細胞傳代 離心法傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶底時，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。 2 半貼壁細胞傳代半貼壁細胞傳代（Hela細胞） 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。離心 新鮮培養(yǎng)基懸浮 鋪板細胞傳代細胞傳代 3 貼貼壁壁細細胞胞傳傳代代采用酶消化法傳代。常用的的胰酶。 吸掉上清，加入PBS緩沖

15、液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。注意：開開放放式式操操作，作，小小心心謹謹慎、慎、謹謹防防污污染！染！細胞凍存（慢凍）細胞凍存（慢凍）1 細胞凍存液（細胞凍存液（1ml/管）管） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基70 胎牛血清20 DMSO 10 （二甲基亞砜，一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對細胞的損傷。）2 細胞欲冷凍保存時，細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細胞數(shù)

16、目一般為1-8x106 cells/ml 緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。細胞凍存細胞凍存3 慢凍程序慢凍程序n傳統(tǒng)方法：4 10分鐘 -20 30 分鐘 -80 1618 小時（或過夜）液氮長期保存。n程序降溫盒：利用異丙醇實現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過程中可以輔助實現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。 細胞凍存細胞凍存小結(jié)四小結(jié)四 細胞培養(yǎng)過程細胞培養(yǎng)過程 細胞生長類型及傳代方法 細胞培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程 注意無菌操作無菌操作（全程）實驗實驗 細胞信息、細胞信息、 方法方法 凍存液成分、凍存液成分、 培養(yǎng)基、耗材培養(yǎng)基、耗材 程序程序細胞計數(shù)細胞計數(shù)o 血細

17、胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞細胞計數(shù)細胞計數(shù)計算公式：細胞數(shù)/ml4大格細胞總數(shù)/ 4稀釋倍數(shù) 104細胞計數(shù)細胞計數(shù)注意事項注意事項 記上不記下，記左不記右。 吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。 鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定 細胞活力測定是體外實驗研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定1 細胞克隆形成率實驗細胞克隆形

18、成率實驗單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰?。 n 克隆形成率（克隆形成數(shù)接種細胞數(shù)）100%n 優(yōu)點：精確、可靠，適于貼壁細胞培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定2 臺盼藍法（臺盼藍法（0.4%）n 細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內(nèi)。故活細胞不被染色，死細胞染成藍色。n 用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活性。培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定3 四唑鹽（四唑鹽（MTT）比色法）比色法 四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍。 原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。 MTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫