檸檬酸發(fā)酵機(jī)制

1、整理課件#檸檬酸發(fā)酵機(jī)制檸檬酸發(fā)酵機(jī)制 重點(diǎn)：檸檬酸生物合成途徑；檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。 難點(diǎn)：檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。 整理課件#一、檸檬酸簡(jiǎn)介一、檸檬酸簡(jiǎn)介v檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名-羥基丙烷三羧酸，是羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一?；瘜W(xué)名稱生物體主要代謝產(chǎn)物之一?；瘜W(xué)名稱2-羥基丙三羥基丙三羧酸，英文文獻(xiàn)俗名羧酸，英文文獻(xiàn)俗名citric acid，分子式，分子式C6H8O7。無(wú)色或白色晶體，無(wú)臭，味極酸，易溶于水和乙無(wú)色或白色晶體，無(wú)臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應(yīng)。醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應(yīng)。第一節(jié)第一節(jié) 概述

2、概述整理課件#食品工業(yè)：食品工業(yè)：酸味劑、增溶劑、抗氧化劑，除腥脫酸味劑、增溶劑、抗氧化劑，除腥脫臭劑；臭劑；醫(yī)藥工業(yè)：醫(yī)藥工業(yè)：化學(xué)工業(yè)：化學(xué)工業(yè)：美容品、化妝品美容品、化妝品 二、檸檬酸及其鹽的應(yīng)用概況二、檸檬酸及其鹽的應(yīng)用概況整理課件#三、我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)現(xiàn)狀三、我國(guó)檸檬酸生產(chǎn)現(xiàn)狀 生產(chǎn)狀況：生產(chǎn)狀況： 60年代開(kāi)始，生產(chǎn)檸檬酸年總產(chǎn)量居世界年代開(kāi)始，生產(chǎn)檸檬酸年總產(chǎn)量居世界第一，出口量一直占國(guó)內(nèi)總產(chǎn)量的第一，出口量一直占國(guó)內(nèi)總產(chǎn)量的50%以上。目前，生產(chǎn)以上。目前，生產(chǎn)廠家近百家，萬(wàn)噸級(jí)以上的有廠家近百家，萬(wàn)噸級(jí)以上的有6家。主要有家。主要有安徽豐原生物安徽豐原生物化學(xué)集團(tuán)公司化學(xué)集團(tuán)公

3、司（生產(chǎn)能力為（生產(chǎn)能力為12.0萬(wàn)噸萬(wàn)噸/年）、年）、江蘇無(wú)錫羅氏江蘇無(wú)錫羅氏中亞檸檬酸有限公司中亞檸檬酸有限公司（生產(chǎn)能力為（生產(chǎn)能力為4.0萬(wàn)噸萬(wàn)噸/年）、年）、安徽華安徽華源生物藥業(yè)有限公司源生物藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)能力為（生產(chǎn)能力為3.5萬(wàn)噸萬(wàn)噸/年）等。年）等。v存在問(wèn)題：存在問(wèn)題：出口量增長(zhǎng)過(guò)快，技術(shù)創(chuàng)新相對(duì)滯后，加出口量增長(zhǎng)過(guò)快，技術(shù)創(chuàng)新相對(duì)滯后，加上國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈，已出現(xiàn)嚴(yán)重的供大于求的局面，設(shè)上國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈，已出現(xiàn)嚴(yán)重的供大于求的局面，設(shè)備利用率不到備利用率不到60%，行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益呈滑坡態(tài)勢(shì)。，行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益呈滑坡態(tài)勢(shì)。整理課件#整理課件#第二節(jié)第二節(jié) 檸檬酸合成途徑與代

4、謝調(diào)控檸檬酸合成途徑與代謝調(diào)控 1940年，年，Krebs: TCA； 1953年，年，Jagnnathan證實(shí)黑曲霉中存在證實(shí)黑曲霉中存在EMP途途徑所有酶；徑所有酶； 1954年，年，Shu提出葡萄糖提出葡萄糖80%經(jīng)經(jīng)EMP途徑代謝；途徑代謝； 1954-1955年，年，Ramakrishman等發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存等發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在在TCA循環(huán)。循環(huán)。一、檸檬酸合成途徑的發(fā)現(xiàn)一、檸檬酸合成途徑的發(fā)現(xiàn)整理課件#二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑整理課件# 黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經(jīng)萄糖經(jīng)EMP、H

5、MP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)，另一方面經(jīng)CO2固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。縮合生成檸檬酸。 (1)生長(zhǎng)期與產(chǎn)酸期都存在生長(zhǎng)期與產(chǎn)酸期都存在EMP與與HMP途徑，前者途徑，前者EMP:HMP=2:1，后者，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在TCA循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在以糖質(zhì)原料發(fā)酵時(shí)，當(dāng)檸檬酸積累時(shí)，以糖質(zhì)原料發(fā)酵時(shí)，當(dāng)檸檬酸積累時(shí)，TCA和乙醛酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)被被阻斷或減

6、弱阻斷或減弱。 (3)由于由于TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，草酰乙酸草酰乙酸是由是由丙酮酸（丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。）羧化生成的。即由兩個(gè)即由兩個(gè)CO2固定化反應(yīng)體系，其中以丙酮酸羧化酶作用固定化反應(yīng)體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化下固定化CO2生成草酰乙酸為主。生成草酰乙酸為主。整理課件#三、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制三、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制整理課件# 1、磷酸果糖激酶（、磷酸果糖激酶（PFK）：）：（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)Mn2+濃度對(duì)磷酸果糖激酶的影響濃度對(duì)

7、磷酸果糖激酶的影響 Mn2+ 缺乏為何會(huì)使缺乏為何會(huì)使NH4+濃度升高呢濃度升高呢？ 當(dāng)培養(yǎng)基中當(dāng)培養(yǎng)基中Mn2+ 缺乏時(shí)，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸缺乏時(shí)，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），這些氨基酸的積累，意味著等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣到影響，這樣NH4+的消耗下降，的消耗下降，NH4+濃度就會(huì)升高。濃度就會(huì)升高。 整理課件#2、丙酮酸羧化酶：、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脫氫酶：、丙酮酸脫氫酶：催化生成乙酰催化生成乙

8、酰CoA整理課件#（二）三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)（二）三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)1、檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)：、檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)：檸檬酸合成酶是檸檬酸合成酶是TCA循環(huán)第一個(gè)酶。循環(huán)第一個(gè)酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。2、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)：、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)： 順烏頭酸水合酶、順烏頭酸水合酶、NAD和和NADP-異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶在檸檬酸在檸檬酸產(chǎn)生與不產(chǎn)生時(shí)，這產(chǎn)生與不產(chǎn)生時(shí)，這3種酶均存在，而當(dāng)銅離子種酶均存在，而當(dāng)銅離子0.3mg/L，鐵，鐵離子離子2mg/L和和pH2.0情況下，這情況下，這3種酶均不出現(xiàn)活力，發(fā)

9、酵中檸種酶均不出現(xiàn)活力，發(fā)酵中檸檬酸正是在這個(gè)檬酸正是在這個(gè)pH條件下積累的。條件下積累的。 順烏頭酸水合酶順烏頭酸水合酶是催化檸檬酸是催化檸檬酸順烏頭酸順烏頭酸異檸檬酸異檸檬酸正逆反應(yīng)的酶，研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線正逆反應(yīng)的酶，研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時(shí)能建立下面的平衡：粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時(shí)能建立下面的平衡：檸檬酸檸檬酸:順烏頭酸順烏頭酸:異檸檬酸異檸檬酸90:3:7。 整理課件# 3、-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié) 在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中，在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中，TCA循環(huán)的一個(gè)顯著特循環(huán)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，點(diǎn)

10、是，-酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻遏。因此當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，在檸檬酸生成期，菌體內(nèi)遏。因此當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，在檸檬酸生成期，菌體內(nèi)不存在不存在-酮戊二酸脫氫酶或活力很低。酮戊二酸脫氫酶或活力很低。 -酮戊二酸脫氫酶催化的反應(yīng)是酮戊二酸脫氫酶催化的反應(yīng)是TCATCA循環(huán)中唯一不循環(huán)中唯一不可逆反應(yīng)，一旦可逆反應(yīng)，一旦-酮戊二酸脫氫酶喪失，就會(huì)引起：酮戊二酸脫氫酶喪失，就會(huì)引起：TCATCA循環(huán)中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸循環(huán)中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆逆TCATCA循環(huán)生成，使循環(huán)生成，使TCATCA循環(huán)成循環(huán)成“馬蹄

11、形馬蹄形”。-酮戊酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。整理課件#(三三)氧對(duì)檸檬酸積累的調(diào)節(jié)氧對(duì)檸檬酸積累的調(diào)節(jié) 乙酰乙酰CoA和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過(guò)程中要引進(jìn)一和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過(guò)程中要引進(jìn)一個(gè)氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它個(gè)氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對(duì)檸檬酸發(fā)酵的作用為：對(duì)檸檬酸發(fā)酵的作用為：(1)氧是發(fā)酵過(guò)程生成的氧是發(fā)酵過(guò)程生成的NADH2重新氧化的氫受體。重新氧化的氫受體。(2)近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有一條標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈以近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有一條標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈以外，還有一條側(cè)系呼吸鏈。外，還

12、有一條側(cè)系呼吸鏈。 當(dāng)缺氧時(shí)，只要很短時(shí)間中斷供氧，就會(huì)導(dǎo)致此側(cè)系當(dāng)缺氧時(shí)，只要很短時(shí)間中斷供氧，就會(huì)導(dǎo)致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。呼吸鏈的不可逆失活，而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。 整理課件#（四）乙醛酸循環(huán)與醋酸發(fā)酵檸檬酸（四）乙醛酸循環(huán)與醋酸發(fā)酵檸檬酸乙醇乙醇乙酸乙酸 v3醋酸醋酸 1檸檬酸檸檬酸v生成的檸檬酸一半轉(zhuǎn)化為生成的檸檬酸一半轉(zhuǎn)化為異檸檬酸異檸檬酸v酵母酵母N源耗盡后開(kāi)始烷烴源耗盡后開(kāi)始烷烴發(fā)酵，低濃度發(fā)酵，低濃度AMP抑制抑制NAD-異檸檬酸脫氫酶的異檸檬酸脫氫酶的活性，檸檬酸大量合成并活性，檸檬酸大量合成并積累。此時(shí)順烏頭酸水合積累。此時(shí)順烏頭酸水合酶

13、催化反應(yīng)平衡為：檸檬酶催化反應(yīng)平衡為：檸檬酸：異檸檬酸：順烏頭酸酸：異檸檬酸：順烏頭酸 = 90：7：3。細(xì)胞質(zhì)中積。細(xì)胞質(zhì)中積累大量異檸檬酸。累大量異檸檬酸。整理課件# MnMn2+2+缺乏缺乏抑制蛋白合成抑制蛋白合成NHNH4 4+ +，有一條呼吸活動(dòng)強(qiáng)的不產(chǎn)生，有一條呼吸活動(dòng)強(qiáng)的不產(chǎn)生ATPATP的側(cè)呼吸鏈：的側(cè)呼吸鏈： 丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制。丙酮酸氧化脫羧生成丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制。丙酮酸氧化脫羧生成乙酰乙酰CoACoA和和COCO2 2的固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，的固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力。

14、增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力。小結(jié)：小結(jié)： 順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立了以下平衡：順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立了以下平衡： 檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7 同時(shí)控制同時(shí)控制Fe2+含量時(shí)，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。含量時(shí)，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。 隨著檸檬酸積累，隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時(shí)，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫降低到一定程度時(shí)，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累。氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累。整理課件#（五）檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率（五）檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率1、無(wú)、無(wú)CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)率固定反應(yīng)的產(chǎn)率合成合成1分子檸檬酸需要

15、分子檸檬酸需要3分子分子乙酰輔酶乙酰輔酶A，也就是需要，也就是需要1.5分子的葡萄糖。分子的葡萄糖。理論產(chǎn)率為：理論產(chǎn)率為：192 /( 1801.5) = 71.1%整理課件#2、通過(guò)、通過(guò) CO2固定反應(yīng)提供固定反應(yīng)提供C4二羧酸二羧酸整理課件#四、檸檬酸發(fā)酵過(guò)程的控制要點(diǎn)四、檸檬酸發(fā)酵過(guò)程的控制要點(diǎn)（1）控制）控制Mn2+、NH4+濃度，解除檸檬酸對(duì)濃度，解除檸檬酸對(duì)PFK的的抑制，使抑制，使EMP暢通無(wú)阻。暢通無(wú)阻。（3）控制培養(yǎng)基中的）控制培養(yǎng)基中的Fe2+ 的濃度，使順烏頭酸水的濃度，使順烏頭酸水合酶失活。合酶失活。（2） 控制溶氧，防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ??？刂迫苎?，防止?cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ?/p>

16、。整理課件#五、檸檬酸產(chǎn)生菌育種的傳統(tǒng)方法：五、檸檬酸產(chǎn)生菌育種的傳統(tǒng)方法： 1. 透明圈大的菌株透明圈大的菌株 平板：平板：10%甘薯甘薯 + 2 %的瓊脂的瓊脂 + 0.5% CaCO3 誘變后，涂布，透明圈大的則好誘變后，涂布，透明圈大的則好 2. 顯色圈大小顯色圈大小 平板：麥汁培養(yǎng)基平板：麥汁培養(yǎng)基 + pH值指示劑值指示劑 誘變后，誘變后，33培養(yǎng)培養(yǎng)3天，透明圈大的則好。天，透明圈大的則好。整理課件# 3. 不分解檸檬酸的菌株不分解檸檬酸的菌株 不利用檸檬酸為碳源的菌株，說(shuō)明其不利用檸檬酸為碳源的菌株，說(shuō)明其TCA循環(huán)中檸檬酸循環(huán)中檸檬酸后續(xù)酶的活性較低，或者喪失，這有利于積累檸檬酸。后續(xù)酶的活性較低，或者喪失，這有利于積累檸檬酸。方法：以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不好的突變株。方法：以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不好的突變株。 4. 選育不長(zhǎng)孢子、少長(zhǎng)孢子、遲長(zhǎng)孢子的菌株選育不長(zhǎng)孢子、少長(zhǎng)孢子、遲長(zhǎng)孢子的菌株 在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會(huì)使在培養(yǎng)