選擇性熒光探針剖析教學(xué)內(nèi)容

1、選擇性熒光探針剖析熒光探針概述熒光探針概述熒光探針是建立在光譜化學(xué)和光學(xué)波導(dǎo)與測量技術(shù)基礎(chǔ)上，選擇性的將分析對象的化學(xué)信息連續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測量的熒光信號的分子測量裝置。熒光分子經(jīng)過特殊的設(shè)計(jì)，能夠選擇性識(shí)別待測物，再將這種識(shí)別信息轉(zhuǎn)換成熒光信號傳遞給外界，具有這種功能的分子就是熒光探針分子。熒光探針分子的結(jié)構(gòu)熒光探針分子的結(jié)構(gòu) 熒光探針分子通常由三部分組成： 識(shí)別基團(tuán)（receptor） 熒光基團(tuán)（fluorophore） 連接體部分（spacer） FSRhvstrongly fluorescentFluorephoreSpacerReceptorAnalyte識(shí)別基團(tuán)決定了探針分子的選

2、擇性和特異性，熒光基團(tuán)則決定了識(shí)別的靈敏度，而連接體部分則可起到分子識(shí)別樞紐的作用。熒光探針與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光探針與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光探針的性能與探針的共軛體系大小、共軛鍵體系的共平面性和剛性程度、分子母體上取代基的種類及取代基位置和幾何構(gòu)型等因素相關(guān)。 給電子取代基如：-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR和-CN。 吸電子取代基如：-C = O，-COOH，-CHO，-NO2和-N=N-。 熒光體取代上重原子后，熒光減弱，而磷光往往相應(yīng)增強(qiáng)。重原子的取代，一般指的是鹵素(Cl，Br和I)的取代。芳烴取代重原子后，熒光強(qiáng)度一般隨鹵素原子量的增加而減弱，這一效應(yīng)稱為“重原子效應(yīng)”。熒光

3、分子探針的設(shè)計(jì)原理熒光分子探針的設(shè)計(jì)原理 鍵合-信號輸出法 置換法 化學(xué)計(jì)量計(jì)法1.鍵合鍵合-信號輸出法信號輸出法 熒光 連接體 識(shí)別 被分析物 信號輸出 基團(tuán) 基團(tuán) 鍵合-信號輸出法是指將探針中的識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)通過共價(jià)鍵連接起來設(shè)計(jì)熒光探針的方法。 作為熒光基團(tuán)的香豆素和作為識(shí)別基團(tuán)的鄰氨基苯硫醚以席夫堿相連，加入鋅離子后，與硫醚上的硫原子、席夫堿上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到結(jié)構(gòu)2，抑制了席夫堿上C=N鍵的旋轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)了熒光從無到有的變化。 122、置換法、置換法識(shí)別基團(tuán) 被分析物 識(shí)別基團(tuán) 熒光基團(tuán) 結(jié)合熒光基團(tuán) 結(jié)合被分析物 該原理是利用識(shí)別基團(tuán)分別與熒光基團(tuán)和被分析物結(jié)合能力

4、的不同來實(shí)現(xiàn)對被分析物的檢測。 識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)形成絡(luò)合物，當(dāng)被分析物加入到該體系中時(shí)，由于識(shí)別基團(tuán)與被分析物的結(jié)合能力要強(qiáng)于識(shí)別基團(tuán)與熒光基團(tuán)的結(jié)合能力，因此被測物將熒光基團(tuán)置換出來，從而引起了整個(gè)體系熒光等化學(xué)參數(shù)的變化，進(jìn)而為儀器或者裸眼識(shí)別，該原理常用于設(shè)計(jì)陰離子熒光探針。 CN-Cu(CN)234Cu2+ 化合物3以氟硼熒為熒光團(tuán)修飾了DPA為識(shí)別基團(tuán)，探針本身熒光很強(qiáng)，但與銅離子絡(luò)合后可形成結(jié)構(gòu)3，從而淬滅了氟硼熒的熒光，加入氰根離子后，由于銅離子與氰根離子的結(jié)合常數(shù)更大，從而把作為熒光基團(tuán)的氟硼熒衍生物從絡(luò)合狀態(tài)中置換出來得到結(jié)構(gòu)4，使之進(jìn)入溶液，熒光恢復(fù)，而其它的陰離子沒有這

5、樣的現(xiàn)象，因此可以實(shí)現(xiàn)對氰根離子的檢測。 3、化學(xué)計(jì)量計(jì)法、化學(xué)計(jì)量計(jì)法 探針分子 被分析物 新物質(zhì)A 探針分子 被分析物 中間體 新物質(zhì)B 新物質(zhì)C（I）被分析物和探針分子反應(yīng)形成了共價(jià)化合物；（II）被分析物催化探針分子反應(yīng)生成兩種新物質(zhì)。熒光分子探針識(shí)別原理熒光分子探針識(shí)別原理熒光分子探針主要有如下幾種識(shí)別機(jī)理：光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（PET, photo-induced electron transfer）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理（ICT, intramolecular charge transfer）熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理（FRET, fluorescence resonance energy

6、transfer）形成激基締合物（excimer/exciplex）1 1、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（PETPET）光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移體系是由包含電子給體的識(shí)別基團(tuán)部分R，通過間隔基S(如-CH2-)和熒光團(tuán)F相連而構(gòu)成的?；赑ET機(jī)理設(shè)計(jì)的熒光分子探針，在未結(jié)合客體之前，探針分子不發(fā)射熒光或熒光很弱，而一旦識(shí)別基團(tuán)與客體相結(jié)合，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用就會(huì)受到抑制，甚至被完全阻斷，熒光團(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光。基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理設(shè)計(jì)的熒光分子探針122 2、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針分子通常是熒光團(tuán)上同時(shí)連有推電子基團(tuán)（電子給體）和吸電子基團(tuán)（電子受體）,通過鍵提供

7、電子轉(zhuǎn)移的通道，形成強(qiáng)的推-拉作用的共軛體系，其吸電子基團(tuán)或推電子基團(tuán)本身充當(dāng)識(shí)別基團(tuán)的一部分。當(dāng)識(shí)別基團(tuán)和被分析物結(jié)合后，作為識(shí)別基團(tuán)的供電子部分或拉電子部分的推拉電能力發(fā)生的改變，整個(gè)體系的的電子結(jié)構(gòu)重新分布，從而導(dǎo)致吸收光譜，發(fā)射光譜發(fā)生變化，主要是光譜紅移或藍(lán)移 。基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理設(shè)計(jì)的熒光分子探針343 3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 是指在兩個(gè)不同的熒光團(tuán)中，如果一個(gè)熒光團(tuán)(供體Doner)的發(fā)射光譜和另一個(gè)熒光團(tuán)(受體Acceptor)的吸收光譜有一定程度的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光團(tuán)間的距離合適時(shí)(一般小于1000nm)，就可以觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)

8、移的現(xiàn)象，即用供體的激發(fā)波長激發(fā)時(shí)，可觀察到受體的熒光發(fā)射。4 4、激基締合物激基締合物/復(fù)合物復(fù)合物如果兩個(gè)相同的熒光團(tuán)之間的位置和距離合適，其中一個(gè)熒光團(tuán)被激發(fā)以后就會(huì)和另外一個(gè)處于基態(tài)的熒光團(tuán)形成激基締合物(excimer)，其熒光發(fā)射光譜的特征表現(xiàn)是原來單體的發(fā)射峰減弱或者消失，而一個(gè)新的、強(qiáng)而寬的、長波長的無振動(dòng)精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)射峰出現(xiàn)。萘、蒽、芘等熒光團(tuán)由于具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成激基復(fù)合物，常常用于此類探針的設(shè)計(jì)中。基于激基締合物設(shè)計(jì)的熒光分子探針56熒光分子探針的特點(diǎn)熒光分子探針的特點(diǎn)熒光探針的熒光必須與生物樣品的背景熒光易于區(qū)別;熒光探針必須不干擾研究的主體;熒光探針的毒性

9、、使用的pH范圍，生物相容性等方面都有嚴(yán)格的要求。 目前使用的熒光探針主要有熒光素類、羅丹明類，香豆素類等化合物。 羅丹明及其衍生物是一種氧雜蒽類熒光染料 ，由于苯環(huán)間氧橋的存在，從而分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)，開環(huán)狀態(tài)下，在激發(fā)光的作用下能產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收和熒光，其最大發(fā)射波長位于500-700 nm之間，為紅色可見光區(qū)，可有效的避開生物體系背景熒光，從而能提高探針的靈敏度，因此是生物分析中經(jīng)常用到的熒光探針，具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。 羅丹明類 14 15 羅丹明內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)具以下特點(diǎn)：1）羅丹明的內(nèi)酰胺螺環(huán)是非共軛結(jié)構(gòu)的，因此在長波長處無吸收，無色，無熒光；2）內(nèi)酰胺

10、螺環(huán)結(jié)構(gòu)在酸性條件或者與被分析物結(jié)合后能夠誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，氧雜蒽結(jié)構(gòu)電子重新排布，共軛結(jié)構(gòu)恢復(fù)，因此在長波長有吸收，有顏色，強(qiáng)熒光。由于此結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，羅丹明內(nèi)酰胺類衍生物是一類很好的OFF-ON型熒光傳感器熒光團(tuán)。卟啉類 卟啉（Porphyrin）是卟吩（Porphine）外環(huán)帶有取代基的同系物和衍生物的總稱。卟吩是由4個(gè)吡咯環(huán)和4個(gè)次甲基橋聯(lián)起來的18電子的大環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，具有平面分子結(jié)構(gòu)和芳香性，不同的卟吩分子其平面性不同，共軛程度也不同。其結(jié)構(gòu)具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）卟吩分子中4個(gè)吡咯環(huán)的8個(gè)位和4個(gè)中位（meso-）的氫原子均可被其它基團(tuán)所取代。（2）當(dāng)卟吩環(huán)中的兩個(gè)吡咯上的氫

11、原子被金屬離子取代時(shí)，形成金屬卟啉，其配合物的種類繁多。（3）卟啉是兩性化合物，其中兩個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子可接受質(zhì)子，又可以給出質(zhì)子。（4）卟吩的骨架是非常容易變形的，其分子構(gòu)型與四個(gè)中位（meso-）的取代基有關(guān)。卟啉（H2TPP）化合物具有非常好的光學(xué)性質(zhì)，是一種理想的熒光物質(zhì)，具有高的熒光量子產(chǎn)率、大的Stokes位移、相對長的激發(fā)（400 nm）和發(fā)射（600nm）波長，相對長的激發(fā)和發(fā)射波長能夠減少背景熒光的干擾，是一種值得深入研究的離子熒光探針，卟啉直接作為識(shí)別基團(tuán)對某些金屬離子有一定響應(yīng)。卟啉可以與金屬陽離子配位形成金屬卟啉。而且金屬卟啉與自由堿卟啉的吸收光譜和發(fā)射光譜又完全不一樣

12、。因此，利用不同的卟啉化合物就能直接測定金屬離子。時(shí)至今日， 已有報(bào)道卟啉可以用于Zn2+、Cd2+、Li+、Cu2+、Na+、Co2+、Pd2+、Hg2+以及H+的檢測等。展望 隨著熒光探針技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,必然會(huì)給目前較為熱門的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物芯片以及等藥物作用機(jī)制等領(lǐng)域帶來新的發(fā)展契機(jī)，提供非常有價(jià)值的方法和信息。文文 獻(xiàn)獻(xiàn) 講講 解解據(jù)于羅丹明據(jù)于羅丹明“關(guān)關(guān)- -開開”的熒光探針對的熒光探針對FeFe2+2+在活細(xì)胞成像中在活細(xì)胞成像中具有高選擇性具有高選擇性BackgroundDuring past decades, some successful attempts

13、have been made to develop selective fluorescent probes for Fe3+.Unfortunately, there have been relatively few fluorescent probesfor Fe2+On the other hand, rhodamine-based fluorescent probes with the construction of a turn-on type have received increasing interest in recent years because of their sim

14、plicity, low detection limit, the capability for special recognition and excellent spectroscopic properties. Highlights A rhodamine-based “turn-on” fluorescent probe was synthesized with high yield. Probe displays high selectivity for Fe2+ and a stable response range of 224 M. The “turn-on” fluoresc

15、ence is caused by open-cyclic mechanism of rhodamine. Probe shows a good application to monitor Fe2+ in living cells by bioimaging.Results and discussion探針探針1 1（羅丹明）由（羅丹明）由2 2（2,6 - 2,6 - 二乙?；拎ぃ┰诙阴；拎ぃ┰诩状贾屑状贾懈弋a(chǎn)量合成高產(chǎn)量合成1、Selectivity analysis探針探針1的最大激發(fā)波長為的最大激發(fā)波長為562nm(A); Fe2+具有高選擇性具有高選擇性(B)2、Job pl

16、ot analysis溶液中探針溶液中探針1: Fe1: Fe2+2+=2:1=2:1形成絡(luò)合物時(shí)時(shí)，工作曲線的拐點(diǎn)為形成絡(luò)合物時(shí)時(shí)，工作曲線的拐點(diǎn)為0.67(Fig. 2A)；當(dāng)；當(dāng)FeFe2+2+的濃度范圍為的濃度范圍為224uM時(shí)的熒光強(qiáng)度時(shí)的熒光強(qiáng)度（ Fig. 2B ）。）。3、The pH-controlled emission measurement這個(gè)圖譜表明自由探針這個(gè)圖譜表明自由探針1在不同在不同pH緩沖液下的熒光強(qiáng)度；在緩沖液下的熒光強(qiáng)度；在pH范圍為范圍為5.5-8.0時(shí)熒光探針時(shí)熒光探針1對鐵離子具有響應(yīng)，而熒光強(qiáng)度的變化小于對鐵離子具有響應(yīng)，而熒光強(qiáng)度的變化小于10

17、。4、 Mechanism analysis羅丹明絡(luò)合物在構(gòu)造羅丹明絡(luò)合物在構(gòu)造“關(guān)關(guān)-開開”熒光探針時(shí)是一個(gè)理想的模型，熒光探針熒光探針時(shí)是一個(gè)理想的模型，熒光探針1 1的的發(fā)光性能對應(yīng)于發(fā)光性能對應(yīng)于“關(guān)關(guān)- -開開”的熒光信號，這種信號據(jù)于螺環(huán)和開環(huán)之間的轉(zhuǎn)換的熒光信號，這種信號據(jù)于螺環(huán)和開環(huán)之間的轉(zhuǎn)換機(jī)制。加入的金屬陽離子導(dǎo)致可逆或不可逆的螺環(huán)開環(huán)反應(yīng)，機(jī)制。加入的金屬陽離子導(dǎo)致可逆或不可逆的螺環(huán)開環(huán)反應(yīng)，F(xiàn)eFe2+2+能結(jié)合中間能結(jié)合中間的四個(gè)氧原子和乙酰吡啶，從而導(dǎo)致開環(huán)。兩組協(xié)調(diào)的四個(gè)氧原子和乙酰吡啶，從而導(dǎo)致開環(huán)。兩組協(xié)調(diào) O2N2 單位的群體能單位的群體能夠滿足夠滿足FeF

18、e2+2+的飽和配位層結(jié)構(gòu)。的飽和配位層結(jié)構(gòu)。5、Aser scanning confocal microscopy. .（激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)）（激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)）探針探針1會(huì)對活細(xì)胞內(nèi)的會(huì)對活細(xì)胞內(nèi)的Fe2+濃度的變化具有響應(yīng)；細(xì)胞內(nèi)含濃度的變化具有響應(yīng)；細(xì)胞內(nèi)含F(xiàn)e2+和探針的場發(fā)和探針的場發(fā)射圖片表明細(xì)胞成像的實(shí)驗(yàn)是可行的（射圖片表明細(xì)胞成像的實(shí)驗(yàn)是可行的（ C圖）。圖）。Conclusions1、據(jù)于羅丹明絡(luò)合物、據(jù)于羅丹明絡(luò)合物“關(guān)關(guān)-開開”熒光探針高產(chǎn)量合成。熒光探針高產(chǎn)量合成。2、各種金屬離子的選擇性在、各種金屬離子的選擇性在PBS緩沖液（緩沖液（pH 7.4）的影響下）的影響下，結(jié)果顯示探針，結(jié)果顯示探針1對對Fe2+高選擇性。高選擇性。3、用、用2:1的比例形成的絡(luò)合物