生物催化技術(shù)

1、生物催化技術(shù)摘要：本文主要探討生物催化劑的種類、生物催化酶的制備、表征、應(yīng)用等方面。其中固定化酶有許多粗酶液沒(méi)有的特點(diǎn)，但制備固定酶首先要經(jīng)過(guò)大量復(fù)雜的分離、純化工作，而且一種固定化酶只能用于特定的單步反應(yīng)，以及對(duì)現(xiàn)代生物催化技術(shù)的發(fā)展及研究。關(guān)鍵詞：生物催化劑；性質(zhì)；用途；發(fā)展引言：生物催化劑是游離的或固定的細(xì)胞或酶的總稱，它們?cè)谏锓磻?yīng)中起著催化劑的作用。生物催化是利用生物催化劑，改變（通常是加速）化學(xué)反應(yīng)速率，合成有機(jī)化學(xué)品和藥物制品。生物催化涉及三個(gè)學(xué)科的不同部分：化學(xué)中的生物化學(xué)和有機(jī)化學(xué)；生物學(xué)中的微生物學(xué)、分子生物學(xué)和酶學(xué)；化學(xué)工程學(xué)中的催化、傳遞工程和反應(yīng)工程學(xué)。人類很早就知道

2、利用酶和微生物細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行生物催化已有幾千年歷史，早已發(fā)明了麥芽制曲釀酒工藝，古埃及和古代中國(guó)都有歷史記載。近現(xiàn)代認(rèn)識(shí)酶是與發(fā)酵和消化現(xiàn)象聯(lián)系在一起的。后來(lái)創(chuàng)造了“酶”這一術(shù)語(yǔ)以表述催化活性，近代科學(xué)技術(shù)對(duì)酶的認(rèn)識(shí)研究，成為現(xiàn)代酶學(xué)與生物催化研究的基礎(chǔ)?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)以及化工行業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)于催化劑的要求越來(lái)越高，人們不斷探索新的催化技術(shù)以滿足不發(fā)展的化工行業(yè)的需求。與化學(xué)工業(yè)相反，生物催化技術(shù)工業(yè)是產(chǎn)銷量不大的行業(yè)，主要應(yīng)用與制藥領(lǐng)域及少數(shù)的化工行業(yè)及視頻行業(yè)。生物催化技術(shù)對(duì)化學(xué)工業(yè)的影響主要是可再生資源的生物加工。自生物技術(shù)誕生之日起，人們就一直致力于把它應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中去。工

3、業(yè)生物催化技術(shù)是生物技術(shù)應(yīng)用中一個(gè)新興和關(guān)鍵的領(lǐng)域。生物催化技術(shù)首先從和它聯(lián)系做緊密的醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)開(kāi)始，逐漸涉及到化工、材料等行業(yè)，并通過(guò)它們影響社會(huì)生產(chǎn)、生活的各個(gè)方面。美國(guó)21實(shí)際發(fā)展規(guī)劃中預(yù)計(jì)，到2020年，通過(guò)生物催化技術(shù)，將實(shí)現(xiàn)降低化學(xué)工業(yè)原料消耗、水資源消耗、能量消耗30%,減少污染物的排放和污染擴(kuò)散以蛋白質(zhì)酶的工程應(yīng)用為核心的工業(yè)生物催化技術(shù)，被認(rèn)為是生物技術(shù)繼生物醫(yī)藥和轉(zhuǎn)基因植物之后的第三次浪潮。它的發(fā)展與應(yīng)用將對(duì)人類的工業(yè)化學(xué)過(guò)程帶來(lái)根本的變革。工業(yè)生物催化的興起與以下的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)因素有密切的關(guān)系：(1)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的出現(xiàn)，(2)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。探討了工業(yè)生

4、物催化技術(shù)的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，并對(duì)我國(guó)如何發(fā)展該領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提出一些見(jiàn)解。1 .生物催化劑的種類及性質(zhì)1.1 生物催化劑的種類：從酶的作用和功能的發(fā)現(xiàn)過(guò)程中了解到，人們最早使用的是游離的細(xì)胞活體，即使用這些細(xì)胞中的酶作為生物催化劑；在此基礎(chǔ)上考慮將該酶蛋白質(zhì)從細(xì)胞中提取分離出來(lái)。比較純的催化劑形態(tài)進(jìn)行的反應(yīng)催化，也可以采用固定化技術(shù)將酶或細(xì)胞固定在惰性固體表面后再使用。因此，固定化細(xì)胞和固定化酶又稱固定化催化劑生物催化劑的類別如下：生長(zhǎng)細(xì)胞、休止細(xì)胞、凍干細(xì)胞、處理細(xì)胞1.2 生物催化劑的性質(zhì)生物催化劑具有催化高效性，催化種類的專一性及反應(yīng)條件專一性三大基本性質(zhì)。生物催化劑的三大特征決定

5、了生物催化劑的廣泛的用途6。2 .固定化酶的制備方法：2.1 傳統(tǒng)的制備方法：2.1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹(shù)脂等載體上的固定方式。顯著特點(diǎn)是：工藝簡(jiǎn)便及條件溫和，包括無(wú)機(jī)、有機(jī)高分子材料，吸附過(guò)程可同時(shí)達(dá)到純化和固定化；酶失活后可重新活化，載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，有活潑的表面。2.1.2 包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個(gè)方法比較簡(jiǎn)便，酶分子僅僅是被包埋起來(lái)，生物活性被破壞的程度低，但此法對(duì)大分子底物不適用。（1）網(wǎng)格型將酶或包埋

6、在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。（2）微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。2.1.3 結(jié)合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過(guò)離子鍵結(jié)合而使酶固定的方法，叫離子鍵結(jié)合法。其間形成化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法叫共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固，使用過(guò)程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點(diǎn)是載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較強(qiáng)烈，所以往往需要嚴(yán)格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。2.1.4 交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白之間的交聯(lián)，

7、使酶分子和多功能試劑之間形成共價(jià)鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：（1）單獨(dú)與酶作用；（2）酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；（3）多功能團(tuán)試劑與載體反應(yīng)得到有功能團(tuán)的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氟酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N,N-乙烯馬來(lái)酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點(diǎn)是有的方法固定化操作較復(fù)雜，進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)易造成酶失活。2.2 新型的制備方法：2.2.1 共價(jià)固定法：酶分子表面存在很多可供利用的化學(xué)基團(tuán)。選擇性地利用酶分子表面遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的特定稀有基團(tuán)

8、(如琉基)進(jìn)行反應(yīng)，使該基團(tuán)與載體上另一基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)來(lái)同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達(dá)到控制其空間取向的目的。Collioud等化學(xué)合成一個(gè)異雙功能試劑(N-m-3(trifluoromethyl)diazirin-3-ylphenyl4maleimidobutyramide),他們禾用這種雙功能試劑成功地實(shí)現(xiàn)了氨基酸、合成肽和抗體Fab片段的定向固定。Stein等通過(guò)衍生全氟疊氮基苯疏水交聯(lián)共價(jià)固定一種脂鏈細(xì)胞蛋白，取得了一致的空間取向。固定后的蛋白質(zhì)分子結(jié)合牢固、穩(wěn)定性佳，不能被離子或非離子去污劑清除。2.2.2 氨基酸置換法：利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個(gè)

9、氨基酸分子，通過(guò)該氨基酸殘基特殊的側(cè)鏈基團(tuán)控制固定方向。Huang等通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)诳莶莸鞍酌?subtil2isin)分子表面遠(yuǎn)離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys殘基。經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys,然后利用Cys殘基上的琉基固定枯草蛋白酶分子，取得了較好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。2.2.3 抗體耦聯(lián)法：大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法。抗體分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團(tuán)可以通過(guò)賴氨酸的一氨基或末端氨基、天冬氨酸的B-氨基、谷氨酸的y-氨基或末端竣基進(jìn)行一般性的偶聯(lián)。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠來(lái)定向固定抗體酶(abzyme)48G7-4

10、A1的Fab片段，抗體酶Fab片段保持了很好的催化活性?？贵w分子Fc區(qū)的糖鏈部分氧化可產(chǎn)生醛基，醛基與載體上的氨基通過(guò)縮合反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)定向固定。醛基若與載體上的酰肌通過(guò)腺鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)抗體分子的定向固定，與隨機(jī)固定相比，固定后抗體穩(wěn)定性提高的同時(shí)免疫吸附活性也提高了3倍。2.2.4 生物素-親和素親合法：生物素是存在于所有活細(xì)胞內(nèi)但含量甚微(<0,0001%)的中性小分子輔酶。親和素是一個(gè)含有四個(gè)相同亞基的四聚體，每個(gè)亞基均含一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)(解離常數(shù)105mol/L)0生物素與親和素或相應(yīng)細(xì)菌中的鏈霉親和素有高專一性的、極強(qiáng)的親和力。這種特性使其成為免疫分析、受體研究、免疫組織化學(xué)、基因工

11、程和蛋白質(zhì)分離等領(lǐng)域中獨(dú)特有力的工具。2.2.5 疏水定向固定法：細(xì)胞粘著分子(celladhesionmolecules,CAMs)!介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-底物粘著、細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞信號(hào)發(fā)生的分子。細(xì)胞粘著分子和其它細(xì)胞表面分子通常通過(guò)疏水作用固定在脂質(zhì)膜上，磷脂錨定是常選擇的方式。接觸位點(diǎn)A糖蛋白是調(diào)節(jié)發(fā)育的細(xì)胞粘著分子，產(chǎn)生于多細(xì)胞發(fā)生早期，通過(guò)形成高親和、EDTA穩(wěn)定的接觸位點(diǎn)介導(dǎo)細(xì)胞粘著。接觸位點(diǎn)A糖蛋白可通過(guò)神經(jīng)酰胺疏水同定在細(xì)胞表面。疏水定向固定可保持蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、生理活性及天然構(gòu)象。這種通過(guò)疏水作用的固定，固定的效率高，固定為非共價(jià)，而且固定過(guò)程可逆，用去污劑可終止或消除同定應(yīng)

12、。Stein等用庚基胺修飾竣甲基葡聚糖載體表面的竣基來(lái)疏水固定接觸位點(diǎn)A糖蛋白分子，成功地控制了固定位點(diǎn)的空間取向。用mAb7l特異結(jié)合來(lái)檢測(cè)csA的活性狀態(tài)，mAb71結(jié)合良好，而mAb353則不能結(jié)合。2.2.6 微波/超聲輔助固定化：微波是一種電磁波，波長(zhǎng)為0.1100cmo微波加熱的主要原理是介質(zhì)材料的極性分子在微波高頻電場(chǎng)的作用下反復(fù)快速取向轉(zhuǎn)動(dòng)而摩擦生熱，是從物質(zhì)內(nèi)部開(kāi)始，瞬時(shí)達(dá)到需要的溫度。微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點(diǎn)，包括：加熱迅速、均勻，不需要熱傳導(dǎo)過(guò)程，內(nèi)外同時(shí)加熱，加熱時(shí)間短；加熱質(zhì)量高，營(yíng)養(yǎng)破壞少；節(jié)能高效；易于控制功能等超聲波是指振動(dòng)頻率大于20kHz以上的一

13、種縱波，在介質(zhì)中傳播時(shí)，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學(xué)的變化，從而產(chǎn)生一系列超聲效應(yīng)，包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)。研究認(rèn)為，超聲波對(duì)液體化學(xué)反應(yīng)速度和產(chǎn)率的影響主要是超聲波在液體介質(zhì)中的空化作用，超聲可使液體介質(zhì)中形成微泡，其破裂伴隨能量的釋放，可以提高許多化學(xué)反應(yīng)的速度。到目前為止，超聲波技術(shù)對(duì)物質(zhì)提取，高分子降解，酶解反應(yīng)等都有很好的促進(jìn)作用。其中超聲波酶解反應(yīng)具有高效、廉價(jià)、無(wú)污染，可提高酶促反應(yīng)速度和有效成分的產(chǎn)率。3酶固定化原理經(jīng)戊二醛活化的載體具了能與蛋白酶分子的自由氨基反應(yīng)的基團(tuán)，及-CHQ經(jīng)過(guò)戊二醛活化的載體與酶蛋白分子的反應(yīng)機(jī)理是戊二醛的另一個(gè)沒(méi)有與為載體相連的-CHO

14、再與酶分子的氨基反應(yīng)，形成-N=C鍵，從而將酶分子固定在載體上。在加入酶液前必須將過(guò)量的戊二醛試劑洗去，因?yàn)槲於┦且环N交聯(lián)劑，它能與酶分子交聯(lián)，使酶分子之間形成共價(jià)鍵，得到三維網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)。止匕外，戊二醛是蛋白的變性劑，過(guò)量的戊二醛本身會(huì)使蛋白質(zhì)分子中毒，降低酶的活性，具體反映的機(jī)理如圖所示?？谌枕菁酉蛎笊嚼? .生物催化酶的光譜表征：還原型輔酶（NADH）的光譜吸收曲線（吸收峰分別在260nm和340nm）還原型輔酶（NADH）的吸收光譜曲線生化谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢驗(yàn)試劑的反應(yīng)原理如下：e酮戊二酸+L-丙氨酸ALT-谷氨酸+丙酮酸（初反應(yīng)）丙酮酸+NADH+H+LDH-孚瞰+NAD+（主反應(yīng)）NA

15、DH的氧化速率與樣本中ALT酶活力成正比，NADH在340nm處有特征吸收峰，在340nm處測(cè)其吸光度的下降速率即可計(jì)算出ALT的活性。5 .固定化酶的應(yīng)用5.1 醫(yī)藥領(lǐng)域固定化月尿酶：月尿酶是專一性催化尿素水解的酶，應(yīng)用于尿素生產(chǎn)控制、產(chǎn)品檢驗(yàn)，也廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等，月尿酶的固定化在血液透析中有著極佳的應(yīng)用前景。固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶，加速體內(nèi)低密度脂蛋白的代謝。人體中的低密度脂蛋白是主要的血漿膽固醇載體，由于其在體內(nèi)代謝緩慢，易形成高血漿膽固醇，以至引起心血管疾病，因此磷酸酯酶的固定化可以應(yīng)用于心血管疾病的治療。固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常

16、用于水解在血液替代品的制備過(guò)程中產(chǎn)生的右旋糖酊。5.2 食品行業(yè)：固定化酶應(yīng)用于食品檢測(cè)：固定化酶技術(shù)的發(fā)展使生物傳感器也得到相當(dāng)大的發(fā)展，它不僅使食品成分的高選擇性、快速、低成本分析測(cè)定成為可能，而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將很快實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并可以保證安全可靠及高質(zhì)量的食品。5.3 環(huán)境保護(hù)：在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面，固定化酶也可以用于測(cè)定有毒物質(zhì)含量以進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。楊雪梅等選用硅膠、活性炭、大孔樹(shù)脂，在一定條件下用物理吸附法固定蛋白酶，3種載體固定的蛋白酶對(duì)含高濃度蛋白質(zhì)的淀粉黃漿廢水進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大孔樹(shù)脂對(duì)蛋白酶的效果良好，并對(duì)含高濃度蛋白質(zhì)的廢水處理效果最好

17、。在廢水處理中，固定化酶也受到了越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注。生活污水和工業(yè)廢水中有害成分主要是氯酚，將辣根過(guò)氧化物酶大量吸附在磁石上，可以保證其100%的活力，且凈化效果是粗酶的20多倍。5.4 生物傳感器方面的應(yīng)用：在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物傳感器因快速、靈敏、專一、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。目前，在檢測(cè)多種細(xì)菌、病毒及其毒素等多個(gè)方面生物傳感器已有較廣泛應(yīng)用。比如高精度血糖分析儀是采用固定化酶的生物傳感分析儀，其分析精度可以達(dá)到0.5%2%,比家用保健類生物傳感器幾乎高一個(gè)數(shù)量級(jí)，比目前醫(yī)用生化分析儀的精度也高2%3%這在血糖分析領(lǐng)域是非常重要的6。酶電極現(xiàn)已用于測(cè)定各種糖類、抗生素、氨基酸、有

18、機(jī)酸、脂肪、醇類、胺類以及尿素、尿酸等。5.5 能源利用：近年來(lái)不少學(xué)者為了解決能源緊缺問(wèn)題致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油。高陽(yáng)等研究了利用多孔滲水物質(zhì)為載體固定脂肪酶，使其可在低水環(huán)境中合成生物柴油。氫氣作為一種清潔能源已引起人們的關(guān)注。有學(xué)者利用聚丙烯酰胺凝膠包埋丁酸梭狀芽抱桿菌IFO3847菌株，可以利用葡萄糖生產(chǎn)氫氣，并且穩(wěn)定性好，無(wú)需隔氧6 .固定化酶的研究進(jìn)展固定化酶對(duì)提高酶的穩(wěn)定性，拓展酶的應(yīng)用領(lǐng)域具有非常重要的意義。目前常用固定化方法普遍存在固定化使用試劑和載體成本高，固定化過(guò)程中酶的構(gòu)象受到影響及底物結(jié)合部位和活性中心受載體封閉所引起的酶活損失較大，固定化操作過(guò)程繁

19、瑣等缺點(diǎn)，限制了固定化酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。針對(duì)當(dāng)前固定化酶載體和方法的不足，本文采用反相懸浮包埋法合成磁性瓊脂糖微球，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷和亞氨基二乙酸處理使微球帶上螯合基團(tuán)，經(jīng)吸附銅離子后，制備了磁性瓊脂糖一亞氨基二乙酸（IDA）-Cu2僉屬螯合載體，利用該載體定向固定了木瓜蛋白酶，固定化最適條件為Cu2+1.5X10-2mol/g載體、固定化時(shí)間4h、固定化pH7.0、給酶量30mg/g載體。固定化酶的最適反應(yīng)溫度70C、最適反應(yīng)pH8.0,固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于溶液酶，固定化酶活力回收為68.4%,且有較好的操作穩(wěn)定性，載體重復(fù)使用5次后固定化酶酶活為首次固定化酶79.71%。本文研究了利用金屬

20、螯合載體固定多酚氧化酶時(shí)，固定化酶的性質(zhì)。得出固定化酶的最適反應(yīng)溫度為50C,最適反應(yīng)pH值7.0,固定化酶的酸堿耐受性明顯好于溶液酶，固定化酶反復(fù)使用6次，酶活仍保留50%左右，固定化載體可以反復(fù)使用5次，仍保持良好的性能。在使用金屬螯合載體固定化酶時(shí)，固定化反應(yīng)條件溫和，對(duì)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)影響小，酶活回收高；固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提高；載體的再生、酶的固定化過(guò)程操作簡(jiǎn)單；固定化酶及載體可多次重復(fù)利用，固定化酶生產(chǎn)成本低。因此該技術(shù)在工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景。高分子微球具有一定的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性，能抵抗微生物和酸堿的作用，是優(yōu)良的固定化酶載體材料.針對(duì)制備高活性、高穩(wěn)定性固定化酶對(duì)載體材料的性能要求，評(píng)述了高分子微球的組成和功能性基團(tuán)的可設(shè)計(jì)性、粒徑與形態(tài)可控性、多孔和大比表面積等結(jié)構(gòu)性質(zhì)，概括了載體結(jié)構(gòu)性質(zhì)對(duì)固定化酶催化活性的影響規(guī)律,提出了對(duì)不同性質(zhì)的生物酶"量體裁衣"，設(shè)計(jì)制備特效的載體材料是高分子微球固定化酶研究的發(fā)展趨勢(shì).同時(shí)介紹了固定化青霉素?；负凸潭ɑ久冈诠I(yè)催化領(lǐng)域的應(yīng)用.首先用分相法和填充法制作了兩種多孔玻璃微珠FXB5口TCBL用它們作為載體分別用物理吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法和重氮法固定了a-淀粉酶，在對(duì)它們的固定效果比較后，選取了共價(jià)偶聯(lián)法進(jìn)行了較詳細(xì)