免疫學(xué)寄生蟲(chóng)

1、第五篇 實(shí)驗(yàn)技術(shù)及抗寄生蟲(chóng)藥物第十七章 寄生蟲(chóng)病原檢查技術(shù)寄生蟲(chóng)學(xué)診斷技術(shù)包括病原檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查等三個(gè)方面。本節(jié)將主要對(duì)病原檢查的各種技術(shù)方法作一較全面的介紹 第一節(jié) 糞便檢查 糞便檢查是診斷寄生蟲(chóng)病常用的病原學(xué)檢測(cè)方法。要取得準(zhǔn)確的結(jié)果，糞便必須新鮮，送檢時(shí)間一般不宜超過(guò)24小時(shí)。如檢查腸內(nèi)原蟲(chóng)滋養(yǎng)體，最好立即檢查，或暫時(shí)保存在35°C37°C條件下待查。盛糞便的容器須潔凈、干燥，并防止污染；糞便不可混入尿液及其它體液等，以免影響檢查結(jié)果。具體方法如下： （一）直接涂片法（direct smear method） 用以檢查蠕蟲(chóng)卵、原蟲(chóng)的包囊和滋養(yǎng)體。方法

2、簡(jiǎn)便，連續(xù)作3次涂片，可以提高檢出率。 1蠕蟲(chóng)卵檢查 滴一滴生理鹽水于潔凈的載玻片上，用棉簽棍或牙簽挑取綠豆大小的糞便塊，在生理鹽水中涂抹均勻；涂片的厚度以透過(guò)玻片隱約可辨認(rèn)書(shū)上的字跡為宜。一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應(yīng)注意蟲(chóng)卵與糞便中的異物鑒別。蟲(chóng)卵都具有一定形狀和大??；卵殼表面光滑整齊，具固有的色澤；卵內(nèi)含卵細(xì)胞或幼蟲(chóng)。2原蟲(chóng)檢查(1) 活滋養(yǎng)體檢查：涂片應(yīng)較薄，方法同查蠕蟲(chóng)卵。氣溫愈接近體溫，滋養(yǎng)體的活動(dòng)愈明顯。必要時(shí)可用保溫臺(tái)保持溫度。（2）包囊的碘液染色檢查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水，糞便涂抹方法同上。若同時(shí)需檢查活滋養(yǎng)體，可在玻片另一側(cè)滴一滴生理鹽

3、水。同上法涂抹糞便標(biāo)本，再蓋上蓋片。片中滴碘液的一側(cè)查包囊；另一側(cè)查活滋養(yǎng)體。碘液配方：碘化鉀4g，碘2g，蒸餾水100ml。（3）隱孢子蟲(chóng)卵囊染色檢查：目前最佳的方法為金安-酚改良抗酸染色法。其次為金胺酚染色法和改良抗酸染色法。對(duì)于新鮮糞便或經(jīng)10%福爾馬林固定保存（41個(gè)月內(nèi)）的含卵囊糞便都可用這三種方法染色。染色過(guò)程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法復(fù)染。方法步驟如下：金胺酚（auramine-phenol）染色法：1) 染液配制：1g/l金胺酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石炭酸5.0g，蒸餾水100ml；3%鹽酸酒精（第二液）：鹽酸3ml，95%酒精100ml；5g/l高錳酸鉀

4、液（第三液）：高錳酸鉀0.5g，蒸餾水100ml。2）染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，1015分鐘后水洗；滴加第二液，1分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置熒光顯微鏡檢查。低倍熒光鏡下，可見(jiàn)卵囊為一圓形小亮點(diǎn)，發(fā)出乳白色熒光。高倍鏡下卵囊呈乳白或略帶綠色，卵囊壁為一薄層，多數(shù)卵囊周?chē)钊?，中央淡染，呈環(huán)狀，核深染結(jié)構(gòu)偏位，有些卵囊全部為深染。但有些標(biāo)本可出現(xiàn)非特異的熒光顆粒，應(yīng)注意鑒別。改良抗酸（modified acid-fast method）染色法：1) 染色液配制：石炭酸復(fù)紅染色液（第一液）：堿性復(fù)紅4g，95%酒精20ml，石炭酸8ml，蒸餾水100ml；10%硫酸溶液

5、（第二液）：純硫酸10ml，蒸餾水90ml（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中）；20g/l孔雀綠液（第三液）：20g/l孔雀綠原液1ml，蒸餾水10ml。2）染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，1.510分鐘后水洗；滴加第二液，110 分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置顯微鏡下觀察。經(jīng)染色后，卵囊呈玫瑰紅色，圓形或橢圓形，背景為綠色。如染色（1.5分鐘）和脫色（2分鐘）時(shí)間短，卵囊內(nèi)子孢子邊界不明顯；如染色時(shí)間長(zhǎng)（510分鐘）脫色時(shí)間需相應(yīng)延長(zhǎng)，子孢子邊界明顯。卵囊內(nèi)子孢子均染為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，共4個(gè)。其他非特異顆粒則染成藍(lán)黑色，容易與卵囊區(qū)分。不具備熒光鏡的實(shí)驗(yàn)室，亦可用本方

6、法先染色，然后在光鏡低、高倍下過(guò)篩檢查。如發(fā)現(xiàn)小紅點(diǎn)再用油鏡觀察的效果好，可提高檢出速度和準(zhǔn)確性。金胺酚染色改良抗酸復(fù)染法用本法可克服上述染色法的缺點(diǎn)。具體方法是：先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法復(fù)染。再用光學(xué)顯微鏡觀察，卵囊同抗酸染色法所見(jiàn)，但非特異性顆粒被染成蘭黑色，兩者顏色截然不同，極易鑒別，使檢出率和準(zhǔn)確性大大提高。（二）厚涂片透明法（改良加藤法）（modified Katos thick smear）厚涂片透明法適于蠕蟲(chóng)卵檢查。取約50mg（已用100目不銹鋼篩除去糞渣）糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開(kāi)（20×25mm）。置于303

7、6溫箱中約半小時(shí)或25約1小時(shí)。待糞膜稍干，即可鏡檢。玻璃紙準(zhǔn)備：將玻璃紙剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油孔雀綠溶液（含純甘油100ml、水100ml和1ml 3%孔雀綠水溶液）中至少浸泡24小時(shí)，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時(shí)間，如糞膜厚透明時(shí)間短，蟲(chóng)卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則蟲(chóng)卵變形，也不易辨認(rèn)。如，檢查鉤蟲(chóng)卵時(shí)，透明時(shí)間宜在30分鐘以內(nèi)。(三)濃聚法（concentration method）1. 沉淀法（sedimentation method）原蟲(chóng)包囊和蠕蟲(chóng)卵的比重大可沉積于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲(chóng)卵和某些原蟲(chóng)包囊則效果較差

8、。(1) 重力沉淀法：即自然沉淀法。本法主要用于蠕蟲(chóng)卵檢查，蠕蟲(chóng)卵比重大于水，可沉于水底，使蟲(chóng)卵濃集。加之，經(jīng)水洗后，視野清晰，易于檢查。有些蟲(chóng)卵，如鉤蟲(chóng)卵，比重較輕，應(yīng)用此法效果不佳。本法缺點(diǎn)為費(fèi)時(shí)，操作煩瑣。 取糞便2030g、加水制成混懸液，用金屬篩（4060孔）或2、3層濕紗布過(guò)濾，再加清水沖洗殘?jiān)?；過(guò)濾糞液在容器中靜置25分鐘，到去上液，重新加滿清水，以后每隔1520分鐘換水一次（共34次），直至上清液清晰為止。最后倒去上清液，取沉渣作涂片鏡檢。檢查血吸蟲(chóng)卵時(shí)，沉淀時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，尤在室溫高于15° C時(shí)，卵內(nèi)毛蚴易孵化。當(dāng)檢查包囊時(shí)，換水間隔時(shí)間宜延長(zhǎng)至約6小時(shí)（圖 17-

9、1）。 圖17-1 糞便自然沉淀法及毛蚴孵化法（2）離心沉淀法（centrifugal sedimentation method）：將上述濾去粗渣的糞液離心（1500-2000rpm/min）12分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復(fù)沉淀34次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。本法省時(shí)、省力，適用于臨床檢驗(yàn)。（3）汞碘醛離心沉淀法（merthiolate-iodine-formaldehyde centrifugation sedimentation method, MIFC）：本法既可濃集，又可固定和染色，適用于原蟲(chóng)包囊、滋養(yǎng)體及蠕蟲(chóng)卵和幼蟲(chóng)的檢查。如準(zhǔn)確稱取1g糞便，即

10、可作蠕蟲(chóng)卵的定量檢查。取糞便1g，加適量（約10ml）汞碘醛液，充分調(diào)勻，用2層脫脂紗布過(guò)濾，再加入乙醚4ml，搖2分鐘，離心（2000rpm/min）12分鐘，即分成乙醚、糞渣、汞碘醛及沉淀物4層。吸棄上面3層，取沉渣鏡檢。汞碘醛配制：1) 汞醛（MF）液：1/1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40%）25ml， 甘油50ml，蒸 餾水200ml。2）盧戈氏液：碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100ml。檢查時(shí)取汞醛液2.35ml及5%盧戈氏液0.15ml混合備用。但混合液保存8小時(shí)后即變質(zhì)，不應(yīng)再用；碘液亦不宜于1周后再用。（4）醛醚沉淀法（formalin-ether sedimentati

11、on）：取糞便12g置于小容器內(nèi)，加水1020ml調(diào)勻，將糞便混懸液經(jīng)2層紗布（或100目金屬篩網(wǎng)）過(guò)濾，離心（200rpm/min）2分鐘；倒去上層糞液，保留沉渣，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10%甲醛7ml。5分鐘后加乙醚3ml，塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘；即可見(jiàn)管內(nèi)自上而下分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。本法不僅濃集效果好，而且不損傷包囊和蟲(chóng)卵的形態(tài)，易于觀察和鑒定。對(duì)于含脂肪較多的糞便，本法效果優(yōu)于硫酸鋅漂浮法。但對(duì)布氏嗜碘阿米巴包囊、賈第蟲(chóng)包囊及微小膜殼絳蟲(chóng)卵等的檢查效果較差。2浮聚法（flotation method）利用比重較大的液體，使原蟲(chóng)包囊或蠕蟲(chóng)

12、卵上浮，集中于液體表面，常用的方法有兩種：(1)飽和鹽水浮聚法（brine flotation）：此法用以檢查鉤蟲(chóng)卵效果最好，也可用于檢查其它線蟲(chóng)卵和微小膜殼絳蟲(chóng)卵。但不適于檢查吸蟲(chóng)卵和原蟲(chóng)包囊。用竹簽取黃豆粒大小的糞便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶）中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水至液面略高于瓶口，以不溢出為止。此時(shí)在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢（圖 17-2）。圖17-2 飽和鹽水浮聚法 飽和鹽水配制： 將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動(dòng)，直至食鹽不再溶解為止。（2）硫酸鋅離心浮聚法（zinc sulfate cent

13、rifugal flotation method）：此法適用于檢查原蟲(chóng)包囊、球蟲(chóng)卵囊、線蟲(chóng)卵和微小膜殼絳蟲(chóng)卵。取糞便約1g，加1015倍的水，充分?jǐn)囁椋措x心沉淀法過(guò)濾，反復(fù)離心34次，至清水為止，最后倒去上清液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33%的溶液），調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)鉤取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴（查包囊），鏡檢。鉤取標(biāo)本時(shí)，用金屬環(huán)輕輕接觸液面即可，切勿攪動(dòng)。離心后應(yīng)立即取標(biāo)本鏡檢，如若放置時(shí)間超過(guò)1小以上，會(huì)因包囊或蟲(chóng)卵變形而影響觀察效果。（3）蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲(chóng)的卵囊。取糞便約5g，加水15-20

14、ml，以260目尼龍袋或4層紗布過(guò)濾。取濾液離心5-10分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸餾水320ml，石炭酸6.5ml）再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表面膜鏡檢（高倍或油鏡）。卵囊透明無(wú)色，囊壁光滑，內(nèi)含一小暗點(diǎn)和發(fā)出蛋黃色的子孢子。隱孢子蟲(chóng)的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，鑒于1小時(shí)后卵囊脫水變形不易辨認(rèn)，故應(yīng)立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖容液。 常見(jiàn)蠕蟲(chóng)卵、包囊的比重見(jiàn)表171。表171 蠕蟲(chóng)卵、包囊的比重 蟲(chóng)卵或包囊 比重 華支睪吸蟲(chóng)卵 1.1701.190 姜片吸蟲(chóng)卵 1.190 肝片形吸蟲(chóng)卵 1.200 日本血吸蟲(chóng)卵 1.200 帶絳

15、蟲(chóng)卵 1.140 微小膜殼絳蟲(chóng)卵 1.050 鉤蟲(chóng)卵 1.0551.080 鞭蟲(chóng)卵 1.150 蟯蟲(chóng)卵 1.1051.115 受精蛔蟲(chóng)卵 1.1101.130 未受精蛔蟲(chóng)卵 1.2101.230 毛圓線蟲(chóng)卵 1.1151.130 溶組織內(nèi)阿米巴包囊 1.0601.070 結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊 1.070 微小內(nèi)蜒阿米巴包囊 1.0651.070 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)包囊 1.0401.0603尼龍袋集卵法本法主要用于血吸蟲(chóng)卵的濃集。先將120目/吋（孔徑略大于血吸蟲(chóng)卵）的尼龍袋套于260目/吋（孔徑略小于血吸蟲(chóng)卵）的尼龍袋內(nèi)（兩袋的底部均不粘合，分別用金屬夾夾?。Ｈ〖S便30g，放入搪瓷杯內(nèi)加水搗碎調(diào)勻

16、，經(jīng)60目/吋 銅篩濾入內(nèi)層尼龍袋，然后將兩個(gè)尼龍袋一起在清水桶內(nèi)緩慢上下提動(dòng)洗濾袋內(nèi)糞液，或在自來(lái)水蓮蓬頭下緩緩沖洗，至袋內(nèi)流出清水為止。將120目/吋尼龍袋提出，棄取袋內(nèi)糞渣，取下260目/吋 尼龍袋下端金屬夾，將袋內(nèi)糞渣全部洗入三角量杯內(nèi)，靜置15分鐘。傾去上清液，吸沉渣鏡檢?；?qū)⒊猎谷肴菬績(jī)?nèi)作血吸蟲(chóng)毛蚴孵化。本法有費(fèi)時(shí)短、蟲(chóng)卵丟失少等優(yōu)點(diǎn)，并可避免在自然沉淀過(guò)程中孵出的毛蚴在換水時(shí)被倒掉。 （四）毛蚴孵化法（miracidium hatching method） 為依據(jù)血吸蟲(chóng)卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度的清水中，短時(shí)間內(nèi)可孵出的特性而設(shè)計(jì)的方法，適用于早期血吸蟲(chóng)病患者的糞便檢查。取糞便約

17、30g，先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，將糞便沉渣倒入三角燒瓶?jī)?nèi)，加清水（城市中須用去氯水）至瓶口，在2030的條件下，經(jīng)小時(shí)后用肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。如見(jiàn)水面下有白色點(diǎn)狀物作直線來(lái)往游動(dòng)，即是毛蚴。必要時(shí)也可以用吸管將毛蚴吸出鏡檢。如無(wú)毛蚴，每隔小時(shí)（小時(shí)內(nèi)）觀察一次。氣溫高時(shí)，毛蚴可在短時(shí)間內(nèi)孵出，因此在夏季要用.食鹽水或冰水沖洗糞便，最后一次才改用室溫清水（圖 17-1）。毛蚴促孵法：將用沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶?jī)?nèi)，不加水，或?qū)⒓S便置于吸水紙上，再放在溫箱中過(guò)夜。檢查時(shí)，加清水，小時(shí)后就可見(jiàn)到孵出的毛蚴。采用此法，毛蚴孵出時(shí)間較一致，數(shù)量也較多。 （五）肛門(mén)拭子法（anal swab）：

18、適用于肛周產(chǎn)卵（蟯蟲(chóng)），或?？稍诟亻T(mén)附近發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)卵（帶絳蟲(chóng)卵）的檢查。 1棉簽拭子法 先將棉簽浸泡在生理鹽水中，取出時(shí)擠去過(guò)多的鹽水，在肛門(mén)周?chē)胧?，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動(dòng)，迅速提起棉簽，在試管內(nèi)壁擠干鹽水后棄去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一截玻片，務(wù)使其接觸液面，分鐘后取下載玻片鏡檢。也可將擦拭肛門(mén)的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，在試管內(nèi)壁擠去水分后棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后，倒去上液，取沉渣鏡檢。 2透明膠紙法（cellophane tape） 用長(zhǎng)約cm，寬約cm的透明膠紙有膠面，粘貼肛門(mén)周?chē)钠つw，取下后將有膠面平貼在玻片上，鏡檢。 （六）鉤蚴培

19、養(yǎng)法（culturmethod for hookworm larvae）為根據(jù)鉤蟲(chóng)卵內(nèi)幼蟲(chóng)在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)孵出的原理設(shè)計(jì)的方法。加冷開(kāi)水約ml于潔凈試管內(nèi)（×10cm），將濾紙剪成與試管等寬但較試管稍長(zhǎng)的字型紙條，用鉛筆書(shū)寫(xiě)受檢者姓名或編號(hào)于橫條部分。取糞便約0.20.4g，均勻地涂抹在紙條豎部的上部2/3處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，以糞便不接觸水面為度。在20 30條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天沿管壁補(bǔ)充冷開(kāi)水，以保持水面高度。3天后用肉眼或放大鏡檢查試管底部。鉤蚴在水中常作蛇行游動(dòng)，蟲(chóng)體透明。如未發(fā)現(xiàn)鉤蚴，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5天。氣溫太低時(shí)可將培養(yǎng)管放入溫水（30左右

20、）中數(shù)分鐘后，再行檢查（圖 17-3）。 圖17-3 鉤蚴培養(yǎng)法 此法亦可用于分離人體腸道內(nèi)各種阿米巴滋養(yǎng)體及人毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體，且能提高檢出率。但是，每管糞便量應(yīng)為1.0g；適宜溫度為2530；培養(yǎng)時(shí)間為天。臨床上為了及時(shí)報(bào)告致病原蟲(chóng)，可于培養(yǎng)小時(shí)后鏡檢。 （七）蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)法（egg count）蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)用于估計(jì)人體內(nèi)寄生蟲(chóng)的感染度，常用司徒爾（toll）氏法，即司氏稀釋蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)法（圖 17-4）。圖 17-4 司徒氏稀釋蟲(chóng)卵記數(shù)瓶在（左）及吸管（右）圖17-5 定量板用特制的三角燒瓶（或普通三角燒瓶），容量為65ml左右，在燒瓶的頸部相當(dāng)于56和60ml處，有兩個(gè)刻度。先把0.1ml/L NaO

21、H溶液到入瓶?jī)?nèi)至56ml處，再慢慢地加入糞便，到液面上升到60ml處，然后放進(jìn)玻璃珠10余顆，用橡膠塞塞緊瓶口，充分搖動(dòng)，使其成為十分均勻的混懸液。計(jì)數(shù)時(shí)充分搖勻，用有刻度的小吸管吸取0.075或0.15ml糞液置于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下計(jì)數(shù)全片的蟲(chóng)卵數(shù)，乘以200（0.075ml）或100（吸0.15ml）即得每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)。由于糞便的性狀明顯地影響估算結(jié)果，因此不成形的糞便的蟲(chóng)卵數(shù)應(yīng)再乘糞便性狀系數(shù)，即半成形糞便×1.5，軟濕形糞便×2，粥狀糞便×3，水瀉糞便×4。 每克糞便含卵數(shù)×24小時(shí)糞便克數(shù) 雌蟲(chóng)數(shù)= 已知雌蟲(chóng)數(shù)每天排卵總數(shù)

22、成蟲(chóng)總數(shù)=雌蟲(chóng)總數(shù)×2（八）定量透明法 定量透明法適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲(chóng)卵的檢查及計(jì)數(shù)。此法系應(yīng)用改良聚苯乙烯作定量板（圖216），大小為40×30×1.37mm，?？诪橐婚L(zhǎng)圓孔，大小為8×4mm，兩端呈半圓形，所取的糞樣平均為41.7mg。操作時(shí)將大小約4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋在糞便標(biāo)本上，自篩網(wǎng)上用刮片刮取糞便，置定量板與載玻片上，用一手的兩指壓住定量板的兩端，將刮片上的糞便填滿?？祝稳ザ嘤嗉S便。掀起定量板，載玻片上留下一個(gè)長(zhǎng)形糞樣，然后在糞條上覆蓋含甘油孔雀綠溶液的大小約為5.02.6cm的玻璃紙條，展平后加壓，使玻璃紙下

23、的糞便鋪成長(zhǎng)橢圓形。經(jīng)1小時(shí)糞便透明后置鏡下計(jì)數(shù)。將所得蟲(chóng)卵數(shù)×24，再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)（eggs per gram， EPG）常見(jiàn)蠕蟲(chóng)的每條雌蟲(chóng)每天排卵數(shù)如212。（九）淘蟲(chóng)檢查法 為考核驅(qū)蟲(chóng)療效，常需從糞便中淘取蠕蟲(chóng)進(jìn)行鑒定與計(jì)數(shù)。取患者服藥后2472小時(shí)的全部糞便，加水?dāng)嚢?，用篩（40目）或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復(fù)沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲(chóng)體時(shí)，應(yīng)在玻皿下襯以黑紙。（十）帶絳蟲(chóng)孕節(jié)檢查法 絳蟲(chóng)節(jié)片用清水洗凈，置于兩節(jié)玻片之間，輕輕壓平，對(duì)光觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲(chóng)種。也可以用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭

24、素墨水或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計(jì)數(shù)。卡紅染液配制：鉀明礬飽和液100ml，卡紅3g，冰醋酸10ml?；旌鸵褐糜?7溫箱內(nèi)過(guò)夜，過(guò)濾后即可應(yīng)用。 表 17-2各種蠕蟲(chóng)每條雌蟲(chóng)每日排卵數(shù)* 蟲(chóng) 名 產(chǎn)卵數(shù)/日/條（平均數(shù)） 華支睪吸蟲(chóng) 16004000（2400） 姜片蟲(chóng) 1500048000（25000） 衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng) 1000020000 日本血吸蟲(chóng) 10003500 豬帶絳蟲(chóng) 3000050000/孕節(jié) 牛帶絳蟲(chóng) 97000124000/孕節(jié) 十二指腸鉤蟲(chóng) 1000030000（24000） 美洲鉤蟲(chóng) 500010000（9000） 蛔蟲(chóng) 234000245000（240000） 鞭蟲(chóng) 10

25、007000（2000）* 來(lái)源于不同資料的數(shù)目可能不同。第二節(jié) 血液檢查 血液檢查是診斷瘧疾、絲蟲(chóng)病的基本方法。涂制血膜用的載玻片用前需經(jīng)洗滌液處理，自來(lái)水、蒸餾水沖洗，在95%酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。采血針用前必須消毒或用一次性針，一人一針以免交叉感染。 洗滌液配制：常用玻璃器皿的洗滌液為鉻酸洗液，含工業(yè)濃硫酸100ml重鉻酸鉀80g，水1000ml。先用冷水將重鉻酸鉀溶化，然后徐徐加入濃硫酸，同時(shí)用玻璃棒攪拌。 （一）檢查瘧原蟲(chóng) （1）取血與涂片：用75%酒精棉球消毒耳垂，待干后用左手拇指與食指捏著耳垂下方，并使耳垂下側(cè)方皮膚崩緊，右手持取血針、刺破皮膚，擠出血滴。薄、厚血膜可涂制

26、在同一張玻片上（圖 17-6）。間日瘧原蟲(chóng)宜在發(fā)作后數(shù)小時(shí)采血；惡性瘧在發(fā)作初期采血可見(jiàn)大量環(huán)狀體，1周后可見(jiàn)配子體。 圖17-6 薄、厚血膜制作 1）薄血膜制片：在載玻片1/3與2/3交界處蘸血一小滴，以一端緣光滑的 2）載片為推片，將推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端緣擴(kuò)散后，自右向左推成薄血膜。操作時(shí)兩載片間的角度為3045°，推動(dòng)速度適宜。理想的薄血膜，應(yīng)是一層均勻分布的血細(xì)胞，血細(xì)胞間無(wú)空隙且涂血膜末端呈掃帚狀。 3）厚血膜制片：于載玻片的另一端（右）1/3處蘸血一小滴（約10mm3），以推片的一角，將血滴自內(nèi)向外作螺旋形攤開(kāi)，使之成為直徑約0.81cm，厚薄均勻的厚血

27、膜。厚血膜為多層血細(xì)胞的重疊，約等于20倍薄血膜的厚度 （2）固定與染色：血片必須充分涼干否則染色時(shí)容易脫落。固定時(shí)用小玻棒蘸甲醇或無(wú)水酒精在薄血膜上輕輕抹過(guò)。如薄、厚血膜在同一玻片上，切勿將固定液帶到厚血膜上，因厚血膜固定之前必須進(jìn)行溶血?？捎玫喂艿嗡诤裱ど?，待血膜呈灰白色時(shí)，將水倒去，涼干。在稀釋各種染液和沖洗血膜時(shí)，如用緩沖液則染色效果更佳。緩沖液的配制如下： 磷酸氫二鈉液：無(wú)水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.64g或Na2HPO4。 2H2O 11.867g或Na2HPO47H2O 17.872g或NaHPO4 12H2O 23.877g，蒸餾水1000ml。 M/15磷酸二氫鉀液

28、：磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.073g，蒸餾水1000ml。使用時(shí)將上述原液按下頁(yè)表配制成不同的pH緩沖液：表17-3 緩沖液配制pH6.87.07.2M/15 KH2PO4 （ml）4.96.37.3 M/15NaH2PO4（ml）5.13.72.7蒸餾水（ml）909090 染色時(shí)臨時(shí)配制成pH7.0或7.2的緩沖液。 常用的染色劑有姬氏染劑（Giemsa's stain）瑞士染劑（Wright's stain） 1）Giemsa染色法：此法染色效果良好，血膜褪色較慢，保存時(shí)間較久，但染色時(shí)間較長(zhǎng)。 染液配置：姬氏染劑粉1g，甲醇50ml，純甘油50ml 。將姬氏染劑粉置

29、于研缽中（最好用瑪瑙研缽），加小量甘油充分研磨，加甘油再磨，直至50ml甘油加完為止，倒入棕色玻瓶中。然后分幾次用少量甲醇沖洗缽中的甘油染粉，倒入玻瓶直至50ml甲醇用完為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置65溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)一周后過(guò)濾，備用。 染色方法：用pH7.07.2的緩沖液，將姬氏染液稀釋；比例約為1520份緩沖液加一份姬氏染液。用蠟筆劃出染色范圍，將稀釋的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小時(shí)（室溫），再用上述緩沖液沖洗。血片涼干后鏡檢。 2） 快速姬氏染色法：姬氏染液1ml，加緩沖液5ml，如前法染色5分鐘后用緩沖液沖洗，涼干后鏡檢。 3）Wright染色法： 此法操作簡(jiǎn)便，適

30、用于臨床診斷，但甲醇蒸發(fā)甚快，掌握不當(dāng)易在血片上發(fā)生染液沉淀，并較易褪色，保存時(shí)間不長(zhǎng)。多用于臨時(shí)性檢驗(yàn)。 染液配制：瑞氏染劑粉0.1.5g，甲醇9ml，甘油3ml。將瑞氏染劑加入甘油中充分研磨，然后加少量甲醇，研磨后倒入瓶?jī)?nèi)，再分幾次用甲醇沖洗缽中的甘油溶液，倒入瓶?jī)?nèi)，直至用完為止。搖勻，小時(shí)后過(guò)濾待用。一般、周后再過(guò)濾。 染色方法：瑞氏染劑含甲醇，薄血膜不需先固定；而厚血膜則需先經(jīng)溶血，待血膜干后才能染色。染色前先將溶過(guò)血的厚血膜和薄血膜一起用蠟筆劃好染色范圍，以防滴加染液時(shí)外溢。滴染液使覆蓋全部厚、薄血膜上，秒至分鐘后用滴管加等量的蒸餾水，輕輕搖動(dòng)載玻片，使蒸餾水和染液混合均勻，此時(shí)出現(xiàn)

31、一層燦銅色浮膜（染色），分鐘后用水緩慢從玻片一端沖洗（注意勿先倒去染液或直對(duì)血膜沖洗），涼干后鏡檢。 （二）檢查微絲蚴 （1）新鮮血片檢查：晚間9時(shí)到次晨2時(shí)取血1滴滴于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)蛇形游動(dòng)的幼蟲(chóng)后，仍需做染色檢查，以確定蟲(chóng)種。 （2）厚血膜檢查：厚血膜的制作、溶血、固定與姬氏液染色同瘧原蟲(chóng)。但需取血3滴，也可用Delafieid蘇木染色法染色。該染液的配制方法如下：取蘇木素1g溶于純酒精或95%的酒精10ml中，加飽和硫酸鋁銨（8%10%）100ml，倒入棕色瓶中，瓶口用兩層紗布扎緊，在陽(yáng)光下氧化周，過(guò)濾，加甘油25ml和甲醇25ml，用時(shí)稀釋10倍左右，將溶血、固

32、定的厚血膜置于德氏蘇木素液內(nèi)1015分鐘，在1%酸酒精中分色12分鐘，蒸餾水洗滌15分鐘，至血膜呈藍(lán)色，再用1%伊紅染色0.51分鐘，以水洗滌25分鐘，涼干后鏡檢。（3）活微絲蚴濃集法：在離心管內(nèi)加蒸餾水半管，加血液1012滴，再加生理鹽水混勻，離心（3000rpm/min）沉淀3分鐘，取沉渣檢查?；蛉§o脈血1ml， 置于盛有0.1ml 3.8%枸櫞酸鈉的試管中，搖勻，加水9ml，俟紅細(xì)胞溶化后，再離心2分鐘，倒去上清液，加水再離心，取沉渣鏡檢。第三節(jié) 排泄物與分泌物等的檢查 1痰液 痰中可能查見(jiàn)肺吸蟲(chóng)卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、棘球蚴的原頭蚴、糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)、蛔蚴、鉤蚴、塵螨等；卡氏肺孢子蟲(chóng)的

33、包囊也可出現(xiàn)于痰中，但檢出率很低。 （1）肺吸蟲(chóng)卵檢查：可先用直接涂片法檢查，如為陰性，改為濃集法集卵， 以提高檢出率。 直接涂片法：在潔凈載玻片上先加12滴生理鹽水，挑取痰液少許，最好選帶鐵銹色的痰，涂成痰膜，加蓋片鏡檢。如未發(fā)現(xiàn)肺吸蟲(chóng)卵，但見(jiàn)有夏科雷登晶體，提示可能是肺吸蟲(chóng)患者，多次涂片檢查為陰性者，可改用濃集法。 濃集法：收集24小時(shí)痰液，置于玻璃杯中，加入等量10%NaOH溶液，用玻棒攪勻后，放入37溫箱內(nèi)，數(shù)小時(shí)后痰液消化成稀液狀。分裝于數(shù)個(gè)離心管內(nèi)，以1500rpm/min離心510分鐘，棄去上清液，取沉渣數(shù)滴涂片檢查。 （2）溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體檢查：取新鮮痰液作涂片。天冷時(shí)應(yīng)

34、注意鏡臺(tái)上載玻片保溫。高倍鏡觀察，如為阿米巴滋養(yǎng)體，可見(jiàn)其伸出偽足并作定向運(yùn)動(dòng)。 （3）上述其他蠕蟲(chóng)幼蟲(chóng)及螨類(lèi)等宜用濃集法檢查。 2. 十二指腸液和膽汁 用十二指腸引流管抽取十二指腸液及膽汁，以直接涂片法鏡檢；也可以經(jīng)離心濃集后，取沉渣鏡檢?？蓹z查藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體、華支睪吸蟲(chóng)卵、肝片形吸蟲(chóng)卵和布氏姜片蟲(chóng)卵等；在急性阿米巴肝膿腫患者膽汁中偶可發(fā)現(xiàn)大滋養(yǎng)體。 檢查方法：可將各部分十二指腸引流液滴于載玻片上，加蓋片后直接鏡檢。為提高檢出率，常將各部分引流液加生理鹽水稀釋攪拌后，分裝于離心管內(nèi)，以2000rpm/min，離心510分鐘，吸取沉渣涂片鏡檢。如引流液過(guò)于粘稠，應(yīng)先加10%NaOH消化后

35、再離心。引流中的賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體常附著在粘液小塊上，或蟲(chóng)體聚集成絮片狀物。肝片形吸蟲(chóng)卵與姜片蟲(chóng)卵不易鑒別，但前者可出現(xiàn)于膽汁；而后者只見(jiàn)于十二指腸液中。 3尿液 取尿液5ml，離心（2000rpm/min）35分鐘，后取沉渣鏡檢。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振蕩，使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪層，離心，取沉渣鏡檢?？刹橐?jiàn)陰道毛滴蟲(chóng)、微絲蚴、埃及血吸蟲(chóng)卵 4鞘膜積液 主要檢查班氏微絲蚴。陰囊皮膚經(jīng)碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜積液作直接涂片檢查，也可以加適量生理鹽水稀釋離心，取沉渣鏡檢。 5陰道分泌物 檢查陰道毛滴蟲(chóng)。 直接涂片法： 用消毒棉簽在受檢者陰道后穹窿、子宮頸及陰道壁上取分泌物，然后用生理鹽水

36、涂片法鏡檢，即可發(fā)現(xiàn)活動(dòng)的蟲(chóng)體。天氣寒冷時(shí)，應(yīng)注意保溫。懸滴法：先在一蓋玻片周緣涂一薄層凡士林，中間滴1滴生理鹽水。將陰道分泌物涂于生理鹽水中，翻轉(zhuǎn)蓋片小心覆蓋在一具凹孔的載玻片上，稍加壓使兩片粘合，液滴即懸于蓋片下面，鏡檢。第四節(jié) 其他器官組織檢查 1骨髓穿刺 主要檢查杜氏利什曼原蟲(chóng)無(wú)鞭毛體。一般常作髂骨穿刺，囑患者側(cè)臥，暴露髂骨部位。視年齡大小，選用1720號(hào)帶有針芯的干燥無(wú)菌穿刺針，從髂骨前上棘后約1cm處刺入皮下當(dāng)針尖觸及骨面時(shí)，再慢慢地鉆入骨內(nèi)約0.51.0cm，即可拔出針芯，接一2ml干燥注射器，抽取骨髓液。取少許骨髓液作涂片；甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油鏡檢查。2淋巴結(jié)穿刺 （1）利什曼原蟲(chóng)：檢出率低于骨髓穿刺，但方法簡(jiǎn)便、安全。對(duì)于以往治療的患者，因其淋巴結(jié)內(nèi)原蟲(chóng)消失較慢，故仍有一定