DB35∕T 2034-2021 鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸鑒別診斷技術(shù)

1、ICS 65.020.30CCS B 4135 福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 20342021鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸鑒別診斷技術(shù)Quarantine protocol for virulent and attenuated strains of duck plague virus infection2021 - 12 - 29 發(fā)布2022 - 03 - 29 實(shí)施福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布 DB35/T 20342021目次前言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 縮 略語15 疫病概述16 聚合酶鏈反應(yīng)27 結(jié)果判定3附錄 A（規(guī)范性） 試劑的配制4附錄 B（資料性） 電泳圖6附錄

2、C（資料性） 參考序列7I 前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。 本文件由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。 本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、福建省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、龍巖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、福州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、三明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。 本文件主要起草人：萬春和、黃瑜、傅光華、陳長(zhǎng)福、劉道泉、陳小麗、程龍飛、劉榮昌、施少華、陳紅梅、傅秋玲、江南松、李中華。 II 鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸鑒別診斷技術(shù)1 范圍本文件

3、規(guī)定了鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸鑒別診斷的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的操作技術(shù)。本文件適用于鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。 2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法 3 術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。 4 縮略語下列縮略語適用于本文件。 DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP：三磷酸脫氧核苷酸（Deoxynucleoside triph

4、osphate） PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction） TAE：三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid） 5 疫病概述5.1 鴨瘟鴨瘟，又稱為鴨病毒性腸炎，最早于1923年在荷蘭發(fā)生和流行，隨后在世界多國均有報(bào)道，幾乎所有的雁形目禽類（如多品種鴨、鵝和天鵝）均可發(fā)生鴨瘟。黃引賢等于1957年在廣州發(fā)現(xiàn)鴨瘟后，在我國南方主要養(yǎng)鴨區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)鴨業(yè)曾造成巨大的直接經(jīng)濟(jì)損失。 5.2 UL2 基因特點(diǎn)鴨瘟病毒，

5、又稱為鴨腸炎病毒或鴨皰疹病毒1型，是引起雁形目禽類發(fā)生鴨瘟的病原。鴨瘟弱毒， 即鴨瘟活疫苗毒，自1960年以來一直用于防控鴨瘟。鴨瘟病毒UL2基因編碼尿嘧啶DNA糖基化酶，是一個(gè) 非必需基因，在DNA復(fù)制過程中可將脫氧尿嘧啶核苷三磷酸錯(cuò)誤插入或是胞嘧啶的脫氨基造成的尿嘧啶殘基切除，保證DNA復(fù)制的正確性和順利進(jìn)行。對(duì)GenBank中登錄的鴨瘟病毒（強(qiáng)毒株和弱毒株）的UL21 DB35/T 20342021基因進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒株UL2基因長(zhǎng)度為1 002 bp，而弱毒株UL2基因長(zhǎng)度為474 bp，且與強(qiáng)毒株UL2基因相比具有528 bp核苷酸序列缺失。 6 聚合酶鏈反應(yīng)6.1 主要儀器設(shè)

6、備6.1.1 PCR 儀。 6.1.2 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。 6.1.3 微量移液器。 6.1.4 組織勻漿器。 6.1.5 電泳儀。 6.1.6 電泳槽。 6.1.7 紫外凝膠成像系統(tǒng)。 6.2 試劑6.2.1 水，應(yīng)符合 GB/T 6682 所規(guī)定一級(jí)水的要求。 6.2.2 磷酸鹽緩沖液，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.1 的規(guī)定。 6.2.3 10%十二烷基磺酸鈉溶液，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.2 的規(guī)定。 6.2.4 蛋白酶 K 溶液，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.3 的規(guī)定。 6.2.5 3M 乙酸鈉溶液，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.4 的規(guī)定。 6.2.6 1×TAE

7、 電泳緩沖液，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.5 的規(guī)定。 6.2.7 1.0%瓊脂糖凝膠，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.7 的規(guī)定。 6.2.8 10×加樣緩沖液，配置方法應(yīng)符合附錄 A 中A.8 的規(guī)定。 6.2.9 引物（Primer）：10 mol/L。根據(jù)鴨瘟強(qiáng)弱毒的 UL2 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)，對(duì)鴨瘟強(qiáng)弱毒擴(kuò)增片段大小分別為 1 019 bp 和 491 bp。 上游引物UL 2F：5- TAACGTCGTTTATACTGTTCCAC -3。下游引物UL 2R：5- AGACCCAAATGACAGAACCT -3。 6.3 樣品處理將采集的組織（肝臟、食道粘膜假膜）經(jīng)剪碎處理后

8、，與磷酸鹽緩沖液按體積比1:3的比例制成組織勻漿液，反復(fù)凍融3次，4 000 r/min離心30 min，取上清液凍存分裝備用。 6.4 核酸 DNA 提取6.4.1 取 420 L 組織勻漿上清液和 30 L 核糖核酸酶加入 1.5 mL 滅菌離心管混勻后，室溫（20 25 ）作用 20 min。 6.4.2 加入 40 L 10%十二烷基磺酸鈉溶液和 10 L 蛋白酶 K 溶液，56 水浴 2 h。 6.4.3 加入等量的 Tris·飽和酚，顛倒充分混勻，12 000 r/min 離心 5 min，小心吸取上層水相于另一 1.5 mL 滅菌離心管中。 6.4.4 加入等體積酚-三

9、氯甲烷-異戊醇（25:24:1），顛倒充分混勻，12 000 r/min 離心 5 min，小心吸取上層水相于另一 1.5 mL 滅菌離心管中。 6.4.5 加入 1/10 體積的 3M 乙酸鈉和 2 倍體積冰凍預(yù)冷的無水乙醇混勻后，-20放置 1 h。2 DB35/T 2034202112 000 r/min 離心 15 min，去上清。加入 600 L 75%冰凍預(yù)冷的乙醇清洗 2 次，倒置于吸水紙上 5 min，室溫晾干。加入 20 L 滅菌雙蒸水溶解，-20 放置備用。 6.4.6 核酸 DNA 提取也可采用市售等效的商品化核酸 DNA 提取試劑盒，按說明書的要求進(jìn)行操作。 6.5 對(duì)

10、照以56 30min滅活的鴨瘟強(qiáng)毒、弱毒病毒提取的基因組DNA或目的片段為陽性對(duì)照，以其他滅活的病毒或健康鴨組織提取的基因組DNA為陰性對(duì)照，以滅菌雙蒸水為空白對(duì)照。 6.6 PCR 擴(kuò)增6.6.1 PCR 反應(yīng)體系為 50 L，每個(gè) PCR 反應(yīng)管的反應(yīng)液配置為：依次加入 10×PCR 緩沖液 5 L， 上/下游引物各 1 L、dNTP Mixture（各 2.5 mM）4 L、提取的核酸 DNA 2 L、Taq 聚合酶 1 L， 加水至總體積 50 L。2 000 r/min 離心 15 s。 6.6.2 將 PCR 反應(yīng)管置于 PCR 儀進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 預(yù)變

11、性 5 min；循環(huán)參數(shù)為 94 變性 50 s，55 退火 30 s，72 延伸 60 s，循環(huán) 35 次；第三步 72 再延伸 10 min 結(jié)束。 6.6.3 PCR 擴(kuò)增也可采用市售等效的商品化 PCR 檢測(cè)試劑盒，按說明書的要求進(jìn)行操作。 6.7 電泳用1×TAE電泳緩沖液配置1.0%的瓊脂糖凝膠。將凝膠放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。取5 L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5 L 10×加樣緩沖液混合，然后加入到1.0 %瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。在電泳時(shí)，使用5 L DNA相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物（DL 2 000 DNA Marker）作對(duì)照。以5 V/cm的電壓進(jìn)行

12、電泳， 30 min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。 7 結(jié)果判定7.1 試驗(yàn)成立的條件當(dāng)鴨瘟強(qiáng)毒陽性對(duì)照、鴨瘟弱毒陽性對(duì)照分別出現(xiàn)約1 019 bp和491 bp的特異性條帶，陰性對(duì)照、空白對(duì)照均無擴(kuò)增條帶（見附錄B），試驗(yàn)結(jié)果成立。 7.2 試驗(yàn)結(jié)果判定當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)約1 019 bp條帶，判定為鴨瘟強(qiáng)毒陽性；當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)約491 bp條帶，判定為鴨瘟弱毒陽性；當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)約1 019 bp和491 bp兩個(gè)條帶，判定為鴨瘟強(qiáng)毒、鴨瘟弱毒雙陽性；當(dāng)待檢樣品無特異性擴(kuò)增條帶（見附錄B），判定為鴨瘟強(qiáng)毒、鴨瘟弱毒雙陰性。 必要時(shí)，將目的條帶進(jìn)行膠回收后克隆測(cè)序，待測(cè)樣品的測(cè)序結(jié)果與參考序列進(jìn)

13、行比較。與參考序列（見附錄C中的C.1）核苷酸同源性在99.0 %以上，判為鴨瘟強(qiáng)毒陽性；與參考序列（見附錄C中的C.2） 核苷酸同源性在99.0 %以上，判為鴨瘟弱毒陽性。 3 DB35/T 20342021AA 附錄A（規(guī)范性） 試劑的配制A.1 0.01M 磷酸鹽緩沖液（PBS）NaCl8.0 g KCl0.2 g Na2HPO4·12H2O2 .9 g KH2PO40.2 g 將上述試劑溶于800 mL水中，定容至1 000 mL，高壓滅菌后4 保存。 A.2 10十二烷基磺酸鈉溶液取10 g的SDS粉末溶解在70 mL水中，加熱到70 ，攪拌待完全溶解后，定容到100 mL

14、，高壓滅菌后室溫保存。 A.3 蛋白酶 K（10 mg/mL）取100 mg的蛋白酶K溶解在6 mL水中，定容到100 mL，-20 保存。 A.4 3M 乙酸鈉（Ph5.2）取408.1 g三水乙酸鈉溶解于700 mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.2，定容到1 000 mL，高壓滅菌后室溫保存。 A.5 1×TAE 電泳緩沖液A.5.1 配制0.5 mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉18.61 g 氫 氧 化 鈉 調(diào) pH 至 8.0 滅 菌 雙 蒸 水 定 容 至 100 mL A.5.2 配制50×TAE電泳緩沖液羥 基 甲 基 氨 基

15、甲 烷 （Tris） 242 g 冰乙酸57.1 mL 0.5 mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0） 100 mL 滅 菌 雙 蒸 水 定 容 至 1 000 mL 用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋50倍使用。 A.5.3 配制1×TAE電泳緩沖液50×TAE 電 泳 緩 沖 液 20 mL 滅 菌 雙 蒸 水 定 容 至 1 000 mL 4 DB35/T 20342021A.6 溴化乙錠溶液溴 化 乙 錠 20 mg 滅 菌 雙 蒸 水 定 容 至 20 mL 也可采用市售商品化的更環(huán)保、更安全Goldviewer等熒光染料。 A.7 1.0瓊脂糖凝膠瓊脂糖1.0 g 1

16、×TAE 電 泳 緩 沖 液 定 容 至 100 mL 置微波爐中加熱至完全融化，待冷至50 60 時(shí)，加溴化乙錠（EB）溶液5 µL，搖勻后倒入制膠板中，待完全凝固后取下加樣梳，備用。 A.8 10×加樣緩沖液聚 蔗 糖 25 g 溴酚藍(lán)0.1 g 二甲苯青0.1 g 滅 菌 雙 蒸 水 定 容 至 100 mL 5 DB35/T 20342021BB 附錄B（資料性） 電泳圖 3 鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖見圖B.1。 bp 2000 1000 750 500 250 100 M1 2 4 5 6 7 8 標(biāo)引序號(hào)說明： MDL 2 000 DNA M

17、arker； 1鴨瘟弱毒陽性對(duì)照； 2鴨瘟強(qiáng)毒陽性對(duì)照； 3陰性對(duì)照； 4空白對(duì)照； 5待檢樣品-鴨瘟弱毒陽性； 6待檢樣品-鴨瘟強(qiáng)毒陽性； 7待檢樣品-鴨瘟強(qiáng)弱毒雙陽性； 8待檢樣品-鴨瘟強(qiáng)弱毒雙陰性。 圖B.1 鴨瘟強(qiáng)弱毒核酸 PCR 檢測(cè)結(jié)果電泳圖6 DB35/T 20342021CC 附錄C（資料性） 參考序列C.1 鴨瘟強(qiáng)毒參考序列TAACGTCGTTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTGCCAGTCAACCGGCTCAACGCCACGACCTTCCAGGTATTCATTGGCCTTTTTAAAAT GATCACATAAGATGAATGGCTTTCTAGACAGCGGTGAT

18、GGATGGCTATATTTCAAAACACAATGCTTGCGACAATTCGGTTTGAACGCT TCCTGAGCATGCACGCCCCACAGCATAAACACTAATCCTTCCTTATTGTCATGTAACCATTGTAATACAGATTTGACTATTTTTGACCA ACCAACGTCTACATGCGATCCCGGATGCCCCTTTCGTACTGTGAGGGTGGTATTTAACAACAAAACTCCAGCTTTGGCCCATGCCTCTA GGCAGCCATGATCAACAATTTTCGTCTCTGGGTAAGAGCGCCGAACGGCCGATAATATATTACGTAGG

19、CTAGGAGGTATCTGAATACCT CTCCGCACGCTGAATGCGAGCCCGTGAGCCTGGCCGGGTTGATGATATGGATCTTGCCCAACTATGATGACTTTTACATCCGATGGAGC ACAGTACCTCGTCCATGTAAATATTTCATTTTTTGGCGGCAGGACTTCTTCGATGTCACAGCGCCGTTCATACTCAAGTAATACTCGAG ACCCCACTTCCGATTGTAGCTCTTGGTATAATACTTCCCGCCAAGCATCGCCAATACAATAATCGCCGCTCAATTTTTCCCACTCGGTG GGACTATTAAACCACGAAGGCGCGACCTCACCGCGACCGCTGCTGTTCGACGTCTGAGGTTGTTGTGCTATACCGCCCCCCTCCCTCAT ACAGGCAACGAAACCCGCTGGCGCACCACAAGGCCTGCGTCGTTTCGGCGCCTGGGACGGAGACGGGAGCCTATCGTCGG