蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定與沉淀反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)7 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)I. 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定一、目的： 了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì) 學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法二、原理： 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在溶液中存在如下平衡：pH = pI 凈電荷=0 pH pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3+ + H+ OH- + H+ OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+ 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)顆粒上正負(fù)電荷數(shù)目相等時(shí)溶液的pH值。 處于等電點(diǎn)時(shí)的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不發(fā)生移動(dòng)；處于等電點(diǎn)時(shí)的蛋白質(zhì)溶解度最低。 用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH值的緩沖液。向緩沖液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的

2、等電點(diǎn)。三、器材 1.水浴鍋2.溫度計(jì)3.200毫升錐型瓶4.100毫升容量瓶5.吸管6.試管7.試管架8.乳缽四.試劑:1. 0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液 200毫升2. 1.00mol/L醋酸溶液 100毫升3. 0.10mol/L醋酸溶液 100毫升4. 0.01mol/L醋酸溶液 50毫升五.操作方法 取4支同樣規(guī)格的試管，按下表順序加入各試劑，然后混勻，靜置10分鐘，觀察現(xiàn)象。試管號(hào)蒸餾水(ml)0.01mol/L醋酸 (ml)0.1mol/L醋酸 (ml)1.0mol/L醋酸 (ml)酪蛋白醋酸鈉溶液(ml)產(chǎn)生混濁否?18.40.6128.70.3138.01.0147.41.61最

3、渾濁的一管的pH為酪蛋白的等電點(diǎn)。六.等電點(diǎn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果 幾號(hào)管最混濁,溶液pH為?由于等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小,所以酪蛋白的等電點(diǎn)為?蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、目的：1加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。2了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。3了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。二、原理： 蛋白質(zhì)分子表面的水化層和雙電層是蛋白質(zhì)水溶液穩(wěn)定的兩個(gè)重要因素。用一定的理化因素處理可破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜或中和表面電荷而使蛋白質(zhì)沉淀。 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類(lèi)。 （1）可逆的沉淀的反應(yīng)：蛋白質(zhì)不變性 （2）不可逆沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)變性三、器材及試劑：1. 蛋白質(zhì)溶液5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋

4、清水=19）2. pH4.7 醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液3. 3%硝酸銀溶液4. 5%三氯乙酸溶液5. 95%乙醇 6. 飽和硫酸銨溶液7. 硫酸銨結(jié)晶粉末8. 0.1 molL-1鹽酸溶液9. 0.1 molL-1氫氧化鈉溶液10. 0.05 molL-1碳酸鈉溶液11. 0.1 molL-1醋酸溶液12. 甲基紅溶液13. 2%氯化鋇溶液四、操作步驟 1蛋白質(zhì)的鹽析 無(wú)機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。 如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。 由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類(lèi)濃度時(shí)，又能再溶解，故蛋白

5、質(zhì)的鹽析作用是可逆過(guò)程。 加5%卵清蛋白溶液5 ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過(guò)濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。 2重金屬離子沉淀蛋白質(zhì) 重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。 取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 ml，再加3%硝酸銀溶液12滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？ 3某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì) 取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 ml，再加1 ml

6、5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。 4有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì) 取1支試管，加入2 ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2 ml 95%乙醇?；靹颍^察沉淀的生成。5.乙醇引起的變性與沉淀 取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑 試劑（ml）管號(hào)5%卵清蛋白溶液0.1 molL-1氫氧化鈉溶 液0.1 molL-1鹽酸溶液95%乙醇pH4.7緩沖溶液123111111111 振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8 ml，然后在第2、3號(hào)管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1 molL-1醋酸溶液及0.05 molL-1碳酸鈉溶液中和之

7、。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1 molL-1鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。五.蛋白質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果 沉淀方法5卵清蛋白試劑觀察現(xiàn)象沉淀溶解情況為什么鹽析2ml硫酸銨溶液重金屬離子2ml3AgNO3有機(jī)酸2ml5三氯乙酸有機(jī)溶劑2ml9 5乙醇五.操作方法 取4支同樣規(guī)格的試管，按下表順序加入各試劑，然后混勻，靜置10分鐘，觀察現(xiàn)象。試管號(hào)蒸餾水(ml)0.01mol/L醋酸 (ml)0.1mol/L醋酸 (ml)1.0mol/L醋酸 (ml)酪蛋白醋酸鈉溶液(ml)產(chǎn)生混濁否?18.40.6128.70.3138.01.0147.41.61最渾濁的一管的pH為酪蛋白的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、目的：1加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。2了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。3了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。 振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8 ml