流式細(xì)胞術(shù)——交大版

1、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) -原理、操作及應(yīng)用原理、操作及應(yīng)用生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系 流式實(shí)驗(yàn)室地址：西7樓107室電話：63846590-776423主要內(nèi)容主要內(nèi)容 一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理 流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)簡介 流式細(xì)胞儀的光信號檢測流式細(xì)胞儀的光信號檢測 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成 熒光抗體的選擇熒光抗體的選擇 流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析 二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧 三、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用三、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1.1 流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)簡介 流式細(xì)胞術(shù)（流式

2、細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。 流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer ）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn) 檢測對象：單細(xì)胞懸液或生物顆粒；檢測對象：單細(xì)胞懸液或生物顆粒； 檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測參數(shù)：多參數(shù)； 檢測特點(diǎn)：單細(xì)胞水平分析；檢測特點(diǎn)：單細(xì)胞水平分析； 檢測速度：高速，最高達(dá)上萬個細(xì)胞檢測速度：高速，最高達(dá)上萬個細(xì)胞/

3、秒；秒； 檢測結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好；檢測結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好； 可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選；可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選；流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀的分類 分析型分析型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。 分選型分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 既能流式分析，還能對分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；既能流式分析，還能對分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選； 進(jìn)樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流進(jìn)樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選。式細(xì)胞儀一般只用于分選。流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化 1934 Mol

4、davanl: First try (固定式細(xì)胞分析固定式細(xì)胞分析-流動式流動式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系統(tǒng)鞘流系統(tǒng)(解決難題解決難題)； 1956 Coulter原理原理(血細(xì)胞計數(shù)器血細(xì)胞計數(shù)器)； 1965 Kamentsky: 分光光度計定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用；分光光度計定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用； 1967 Kamentsky等設(shè)計了細(xì)胞分選的裝置；等設(shè)計了細(xì)胞分選的裝置； 1969 Vandilla等等: 第一臺熒光檢測細(xì)胞計第一臺熒光檢測細(xì)胞計(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大學(xué)斯坦福大學(xué): 研制出熒光激活細(xì)胞分選儀研制出熒光激活

5、細(xì)胞分選儀(FACS)； 1973 BD公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流 式細(xì)胞儀式細(xì)胞儀-FACS 。 1975 Kohler和和Milstein: 單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)(促進(jìn)流式發(fā)展促進(jìn)流式發(fā)展)。BD公司分析型流式細(xì)胞儀公司分析型流式細(xì)胞儀FACS Calibur 雙激光四色，市場覆蓋率最高LSR II 雙激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACS Canto II 雙激光六色，三激光八色FACS Verse雙激光六色，三激光八色BD公司分選型流式細(xì)胞儀公司分選型流式細(xì)胞儀FACSVantage SEFACSAria

6、 IIIInflux1.2 流式細(xì)胞術(shù)光信號檢測流式細(xì)胞術(shù)光信號檢測 光信號的類型光信號的類型 散射光信號散射光信號：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)， 是細(xì)胞的固有參數(shù)。是細(xì)胞的固有參數(shù)。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC); 側(cè)向散射光側(cè)向散射光(side scatter, SSC). 熒光信號熒光信號 自發(fā)熒光自發(fā)熒光 (細(xì)胞色素因子、核黃素細(xì)胞色素因子、核黃素)：微弱微弱 特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出 的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。1.2.1 散射光信號散射光信號（一）前向散射光（一）前向散射光F

7、SC FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在信號方向與激光束平行，偏離度一般在1 -6度范圍內(nèi)，度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細(xì)胞的亦稱小角度散射光，主要反映被測細(xì)胞的體積大小和活力體積大小和活力。（二）側(cè)向散射光（二）側(cè)向散射光SSC SSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散度散射光，其信號強(qiáng)度反映射光，其信號強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。（三）散射光的作用（三）散射光的作用 實(shí)驗(yàn)中，常利用實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去

8、除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞粒細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片死細(xì)胞死細(xì)胞或碎片或碎片粘連粘連細(xì)胞細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株腫瘤細(xì)胞株FSC/SSC散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖死細(xì)胞死細(xì)胞加藥處理后加藥處理后FSC/SSC散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖 通過通過FSC/SSC散點(diǎn)圖，散點(diǎn)圖，gate出目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析。出目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析。1.2.2 熒光信號熒光信號（一）熒光：（一）熒光： 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。為高能狀態(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光

9、。發(fā)射波長發(fā)射波長(熒光波長熒光波長)Emission wavelength激發(fā)波長激發(fā)波長Excitation wavelength（二）常用熒光素（二）常用熒光素499nm 藍(lán)色熒光（藍(lán)色熒光（Blue）； 500-549nm，綠色熒光（，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（，黃色熒光（Yellow）； 585-615nm，橙色熒光（，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（，紅色熒光（Red）； 700nm，遠(yuǎn)紅外熒光（，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）。標(biāo)記抗體的熒光素標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿訜晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長發(fā)射光波長（n

10、m）中文名中文名FITC490520異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665核酸熒光染料核酸熒光染料PI（碘化丙啶（碘化丙啶 535, 623） 可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于于DNA分析，需要用分析，需要用RNase處理細(xì)胞排

11、除處理細(xì)胞排除RNA對對DNA熒光定量的影響；熒光定量的影響；PI不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。7-AAD（7-氨基放線菌素氨基放線菌素D 545, 647 ） 以插入的方式與以插入的方式與DNA鏈的鏈的G-C堿堿基對結(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞?；鶎Y(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式與可以非嵌入方式與DNA鏈上鏈上的的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染

12、料。定量染料。Hoechst（343, 450）常見為常見為Hoechst33342和和Hoechst33258，非嵌入的，非嵌入的方式與方式與DNA鏈上的鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞堿基對結(jié)合。能對活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。PY（派若寧（派若寧 560, 573） RNA染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。AO（吖啶橙（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進(jìn)行呈橙黃色熒光，可進(jìn)行DNA/RNA

13、雙參數(shù)分析。雙參數(shù)分析。1.3 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 流動室流動室 液流驅(qū)動系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)光源激發(fā)光源 光束收集系統(tǒng)光束收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換器光電轉(zhuǎn)換器 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng) 噴嘴噴嘴 電偏轉(zhuǎn)板電偏轉(zhuǎn)板 樣本收集器樣本收集器1.3.1 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩展起來的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細(xì)種液體的同軸流動，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。

14、流體動力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流體動力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細(xì)胞流直個聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在徑被約束在10-20um，避免，避免了多個細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測區(qū)。了多個細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測區(qū)。鞘液鞘液鞘液鞘液細(xì)胞流細(xì)胞流激光照射點(diǎn)激光照射點(diǎn)流體動力學(xué)聚焦示意圖流體動力學(xué)聚焦示意圖1.3.2 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)（一）（一）激發(fā)光源激發(fā)光源 ：激光器：激光器 氣體激光器：氬離子氣體激光器：氬離子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪離子、氪離子 (647nm)、氪氬、氪氬(568nm)

15、； 染料激光器：如氬離子激光泵浦的染料激光器：如氬離子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器，發(fā)出光器，發(fā)出550-650nm可變波長激發(fā)光；可變波長激發(fā)光； 半導(dǎo)體激光器半導(dǎo)體激光器：價格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長。價格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長。BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半導(dǎo)體激光器。半導(dǎo)體激光器。 激光特點(diǎn)：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。激光特點(diǎn)：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。 現(xiàn)在儀器常配有儀器選配現(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器，波長多為根激光器，波長多為488nm、633nm和和355nm、405nmUV；（二）光收

16、集系統(tǒng)（二）光收集系統(tǒng) 濾光片濾光片的組成的組成 長通濾片長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；：只允許特定波長以上的光束通過； 短通濾片短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；：只允許特定波長以下的光束通過； 帶通濾片帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long pass Short pass Band pass460 500 540460 500 540460 500 540 全反射光路全反射光路FACS Aria流式細(xì)胞儀器信號檢測系統(tǒng)流式細(xì)胞儀器信號檢測系統(tǒng)PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFI

17、TCSSC1.3.3 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電檢測器光電檢測器將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。 前置放大電路前置放大電路將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。 模數(shù)轉(zhuǎn)換器模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。將模擬的電脈沖信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。計算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。（一）（一）光電檢測器光電檢測器(photodetector) 光電二極管光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強(qiáng)信號（光靈敏度低，測定強(qiáng)信號（FSC）；）； 光電倍增管光電倍增管(photomultiplier, P

18、MT)光靈敏度高，測定弱信號（光靈敏度高，測定弱信號（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光前向散射光光電二極管光電二極管（二）（二）電信號兩種放大方式電信號兩種放大方式 由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機(jī)分析由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機(jī)分析處理，一般信號的放大可以使用處理，一般信號的放大可以使用線性線性或或?qū)?shù)對數(shù)兩種方式。兩種方式。 線性線性(linear; lin) 對數(shù)對數(shù)(logarithmic; log) 一般一般FSC和和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用

19、對數(shù)放大。變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。（三）（三）熒光信號的面積熒光信號的面積A、寬度、寬度W和高度和高度H 細(xì)胞通過激光檢測區(qū)域時，產(chǎn)生的熒光信號被光電倍增管接收，形成脈沖信號。熒光信號脈沖形成示意圖熒光信號脈沖形成示意圖TimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0熒光信號脈沖的面積、高度和寬度熒光信號脈沖的面積、高度和寬度Width = Area/Height一個信號脈沖有高度、面積和寬度。 光信號電信號數(shù)字信號光信號電信號數(shù)字信號 通道通道(channel) 一個光電檢測器一個光電檢測器就是一個通道，有多少個光電二極管就是一個通道，有多少個光電

20、二極管/倍倍增管，就有多少個通道：增管，就有多少個通道： 散射光通道散射光通道: FSC通道和通道和SSC通道；通道； 熒光通道熒光通道 通道命名方式：通道命名方式： 以以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。等。 以該通道接收的主要熒光素命名，如以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。 For example：FACSCalibur有有488nm和和633nm兩根激光器，兩根激光器，488nm能檢測能檢測FSC、SSC、FL1(FITC)、 FL2(PE)、 FL3(PerCP)，635能檢測能

21、檢測FL4(APC)，代表，代表Calibur有有6個通道，最多能同時個通道，最多能同時檢測檢測4個熒光，個熒光，6種參數(shù)。種參數(shù)。1.3.4 流式分選流式分選 電荷式電荷式分選分選超聲振動器超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置收集裝置(流式管、培養(yǎng)板流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)(充電充電)高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板四路分選原理四路分選原理電荷式分選裝置電荷式分選裝置分選指標(biāo)分選指標(biāo) 分選時間由三方面決定：進(jìn)樣速度、目標(biāo)細(xì)胞所占比例、分選時間由三方面決定：進(jìn)樣速度、目標(biāo)細(xì)胞所占比例、需要收集的細(xì)胞數(shù)。需要收集的細(xì)胞數(shù)。需要細(xì)胞數(shù)目標(biāo)細(xì)胞所占

22、比例(%)15501041.7 min20 s2 s10516.8 min3.4 min20 s1062.8 h3.4 min3.4 min1071.2 天5.6 h34 min分選時間表分選時間表(機(jī)器流速機(jī)器流速10000個個/s時時) 分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。 分選純度分選純度指被分選出來的細(xì)胞所占的百分比，一般能達(dá)指被分選出來的細(xì)胞所占的百分比，一般能達(dá)99%以上。以上。 分選收獲率分選收獲率是指被分選出的細(xì)胞與原來總細(xì)胞的百分比。是指被分選出的細(xì)胞與原來總細(xì)胞的百分比。 分選純度和收獲率永遠(yuǎn)是相互矛盾的，純度提高，收獲率分選

23、純度和收獲率永遠(yuǎn)是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。降低，反之亦然。 富集模式富集模式(enrich mode) 純化模式純化模式(purify mode) 單細(xì)胞模式單細(xì)胞模式(single cell mode)1.4 熒光抗體的選擇熒光抗體的選擇A 根據(jù)流式細(xì)胞儀選擇抗體根據(jù)流式細(xì)胞儀選擇抗體 流式細(xì)胞儀能檢測的通道數(shù)流式細(xì)胞儀能檢測的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用由激光器種類、數(shù)量和使用的光學(xué)濾片決定的光學(xué)濾片決定)。如。如FACSCalibur： 多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以

24、隨意搭配。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP 530/30515-545FITC、AF488FL2BP 585/42564-606PEFL3670 LP670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP 661/16653-669APC、AF647B 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇抗體抗體 不同的熒光素強(qiáng)度有所不同；不同的熒光素強(qiáng)度有所不同； 高表達(dá)的抗原可用不太高表達(dá)的抗原可用不太“亮亮”的染料，更的染料，更“亮亮”的熒光素分的熒光素分配給表達(dá)低的抗原：配給表達(dá)

25、低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC 選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進(jìn)行組合，選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進(jìn)行組合，同時需要正確的調(diào)節(jié)補(bǔ)償。同時需要正確的調(diào)節(jié)補(bǔ)償。CD51.5 FCM數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析 標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的FCM數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)采用列表模式（列表模式（list mode），記錄了每個，記錄了每個細(xì)胞的所有參數(shù)的信息。細(xì)胞的所有參數(shù)的信息。 每個細(xì)胞檢測每個細(xì)胞檢測5個參數(shù)，那么獲取個參數(shù)，那么獲取10000個細(xì)胞，容量為個細(xì)胞，容量為510000（字或雙字）。（字或雙字）。Event #FSCSSCFL1 FITCFL2

26、PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015FCM數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖(Histogram) 雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示： 散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖(Dot Plot) 偽彩圖偽彩圖(Pseudo-color Plot) 等高線圖等高線圖(Contour Plot) 密度圖密度圖(Density Plot) 假三維圖假三維圖(Pseudo 3D Plot) 三維圖三維圖(3D Plot) 常用分析軟件常用分析軟件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express

27、直方圖直方圖Histogram 細(xì)胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標(biāo)表示熒光信細(xì)胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標(biāo)表示熒光信號或散射光信號相對強(qiáng)度的值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)一般號或散射光信號相對強(qiáng)度的值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。是細(xì)胞數(shù)。Event #FL1 FITC110270037204150101001000CountsFITC熒熒光強(qiáng)度光強(qiáng)度 橫坐標(biāo)既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。橫坐標(biāo)既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。DNA倍體分析倍體分析抗原表達(dá)分析抗原表達(dá)分析Overlay圖圖散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖 散點(diǎn)圖中每個點(diǎn)代表一個細(xì)胞，散點(diǎn)圖中每個點(diǎn)代表一個細(xì)胞，X軸與軸與Y軸分別代表

28、一種參軸分別代表一種參數(shù)，優(yōu)點(diǎn)是比直方圖直觀。數(shù)，優(yōu)點(diǎn)是比直方圖直觀。FL1FL2散點(diǎn)圖和偽彩圖散點(diǎn)圖和偽彩圖等高圖和密度圖等高圖和密度圖 等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。 密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。細(xì)胞少。假三維圖和三維圖假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 設(shè)門與數(shù)據(jù)分析設(shè)門與數(shù)據(jù)分析 門門(Gate，簡寫，簡

29、寫G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個重要術(shù)語，是流式細(xì)胞術(shù)中的一個重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。橢圓形橢圓形圓形圓形矩形矩形任意形狀任意形狀 R(Region，區(qū)域，區(qū)域)。門可以是單一區(qū)域。門可以是單一區(qū)域(G=R1)，也可以是幾，也可以是幾個區(qū)域組合在一起：個區(qū)域組合在一起：G=R1 and R2; G=R1 or R2; G=R1 not R2。十字門十字門線性門線性門二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧流式細(xì)胞術(shù)操作流程流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞血液骨髓新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光染色上機(jī)檢測表型測定細(xì)胞分選繼

30、續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學(xué)分析 2.1 單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液制備 2.2 免疫熒光標(biāo)記免疫熒光標(biāo)記 2.3 對照的設(shè)置對照的設(shè)置 2.4 光譜重疊與補(bǔ)償光譜重疊與補(bǔ)償2.1 單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液制備 2.1.1 新鮮實(shí)體組織的樣本制備新鮮實(shí)體組織的樣本制備 對于不同組織來源的實(shí)體組織和實(shí)體瘤標(biāo)本，應(yīng)該根據(jù)各對于不同組織來源的實(shí)體組織和實(shí)體瘤標(biāo)本，應(yīng)該根據(jù)各自特點(diǎn)選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞自特點(diǎn)選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)量高產(chǎn)量高、損傷小損傷小的目的。常用方法有：的目的。常用方法有：酶消化法酶消化法機(jī)械法機(jī)械法化學(xué)試劑處理法化學(xué)試劑處理法 酶消化法酶消化法：根據(jù)

31、分散組織類型來確定使用的酶類：根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：胰蛋白酶胰蛋白酶水解酯鍵、肽鍵；水解酯鍵、肽鍵；膠原酶膠原酶降解幾種分子類型的膠原；降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶溶菌酶水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶彈性蛋白酶消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。1. 將新鮮組織置于離心管中，加入將新鮮組織置于離心管中，加入1-2ml酶消化酶消化20-30min（恒溫（恒溫37或室溫），間斷振蕩或吹打；或室溫），間斷振蕩或吹打；2. 終止消化，收集細(xì)胞懸液，終止消化，收集細(xì)胞懸液，300目尼龍網(wǎng)過濾，除去目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，低速離心除去細(xì)胞碎

32、片；細(xì)胞團(tuán)塊，低速離心除去細(xì)胞碎片；3. 將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記或保存?zhèn)溆?。將制備好的單?xì)胞懸液進(jìn)行熒光標(biāo)記或保存?zhèn)溆谩?注意注意：酶的使用濃度、溫度、消化時間、酶活性的酶的使用濃度、溫度、消化時間、酶活性的pH值。值。機(jī)械法特點(diǎn)機(jī)械法特點(diǎn)：易造成細(xì)胞碎片和團(tuán)塊，實(shí)際操作時，應(yīng)注意：易造成細(xì)胞碎片和團(tuán)塊，實(shí)際操作時，應(yīng)注意碎片和團(tuán)塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用碎片和團(tuán)塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用。組織解離器 機(jī)械法機(jī)械法：有有剪碎法剪碎法、網(wǎng)搓法網(wǎng)搓法、研研磨法磨法等。等。利用機(jī)械方法、物理方利用機(jī)械方法、物理方法給予組織交大的壓力，法給予組織交大的壓力

33、，使細(xì)胞從組織間分散開使細(xì)胞從組織間分散開來。來。 化學(xué)處理法化學(xué)處理法：作用原理：將組織細(xì)胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置作用原理：將組織細(xì)胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散開來，常用試劑有換出來，從而使細(xì)胞分散開來，常用試劑有EDTA、EGTA、TPB等。等。EDTA是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成螯合物，實(shí)際運(yùn)用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白螯合物，實(shí)際運(yùn)用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。酶）。 特點(diǎn)特點(diǎn)：用化學(xué)法細(xì)胞存活率低、細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片：用化學(xué)法細(xì)胞存活率低、細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片和聚集量不穩(wěn)定。和聚集

34、量不穩(wěn)定。 機(jī)械法往往造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞機(jī)械法往往造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量，注意去除細(xì)胞碎片和團(tuán)塊以免影響產(chǎn)量，注意去除細(xì)胞碎片和團(tuán)塊以免影響FCM結(jié)果，如低結(jié)果，如低速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等。速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等。 酶消化法、化學(xué)試劑處理法對實(shí)體組織的分散效果較理想，酶消化法、化學(xué)試劑處理法對實(shí)體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學(xué)成分的不良影響。但會造成所測化學(xué)成分的不良影響。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，最終要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，最終要求細(xì)胞呈單個分散狀態(tài)；細(xì)胞碎片、團(tuán)塊盡量少；細(xì)胞活求細(xì)

35、胞呈單個分散狀態(tài)；細(xì)胞碎片、團(tuán)塊盡量少；細(xì)胞活性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。2.1.2 石蠟包埋組織樣本制備石蠟包埋組織樣本制備切片：將石蠟組織切成50um厚的組織片4-5片，放入1試管中；脫脂：加入二甲苯3-5ml脫脂，室溫下1-2天，脫凈后棄二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10 min，去乙醇后加入蒸餾水3-5ml，3-5min后棄水；消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶（pH 1.5-2.0），37恒溫水浴30 min，每隔5-10min振蕩一次；終止消化：加冷的PBS或生理鹽水終止消化；過濾：用300

36、目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第二次消化；收集細(xì)胞懸液：將過濾液離心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速離心沉淀去除碎片；根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臉?biāo)記熒光抗體，或保存細(xì)胞備用。2.1.3 血液、骨髓樣本制備血液、骨髓樣本制備 外周血單個核細(xì)胞外周血單個核細(xì)胞PBMC的分離的分離血液層Ficoll層血漿層PBMCFicoll層紅細(xì)胞層離心前離心后Ficoll密度梯度離心法分離密度梯度離心法分離PBMC注意：注意： 由于多核粒細(xì)胞比較大，由于多核粒細(xì)胞比較大，粒細(xì)胞沉降在紅細(xì)胞層，粒細(xì)胞沉降在紅細(xì)胞層，所以該法不適合粒細(xì)胞所以該法不適合粒細(xì)胞研究；研究； 該法操作過程中可能丟該法操作過程中可能丟失一些有意義的

37、細(xì)胞或失一些有意義的細(xì)胞或細(xì)胞亞群，所以臨床上細(xì)胞亞群，所以臨床上一般不主張分離血液或一般不主張分離血液或骨髓的單個核細(xì)胞。骨髓的單個核細(xì)胞。 紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞原理：紅細(xì)胞裂解液成分為低滲的原理：紅細(xì)胞裂解液成分為低滲的NH4Cl溶液，利用雙溶液，利用雙凹型的紅細(xì)胞膜抗性差，白細(xì)胞膜抗性比較好的特點(diǎn)，凹型的紅細(xì)胞膜抗性差，白細(xì)胞膜抗性比較好的特點(diǎn)，加入低滲透壓的紅細(xì)胞裂解液時，紅細(xì)胞膜脹破，而白加入低滲透壓的紅細(xì)胞裂解液時，紅細(xì)胞膜脹破，而白細(xì)胞膜不受影響，從而達(dá)到去除紅細(xì)胞的目的。細(xì)胞膜不受影響，從而達(dá)到去除紅細(xì)胞的目的。2.1.4 培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備培養(yǎng)細(xì)胞

38、單細(xì)胞懸液制備2.1.5 體液脫落細(xì)胞樣本制備體液脫落細(xì)胞樣本制備懸浮生長細(xì)胞懸浮生長細(xì)胞吸管反復(fù)吹打吸管反復(fù)吹打貼壁生長細(xì)胞貼壁生長細(xì)胞消化處理消化處理離心獲得單離心獲得單細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液洗脫液洗脫液尿液尿液胸腹水胸腹水離心收集細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用生理鹽水或用生理鹽水或PBS洗滌洗滌3次次300目尼龍膜目尼龍膜過濾后離心過濾后離心沉淀去上清沉淀去上清單細(xì)胞單細(xì)胞懸液懸液FCM可檢測下列細(xì)胞成分：可檢測下列細(xì)胞成分： 表面標(biāo)記物表面標(biāo)記物 胞漿標(biāo)記物胞漿標(biāo)記物 核內(nèi)標(biāo)記物核內(nèi)標(biāo)記物 可溶性成分可溶性成分2.2 免疫熒光染色免疫熒光染色黏附因子黏附因子表面受體表面受體細(xì)胞因子細(xì)胞因子分泌到胞外

39、的分泌到胞外的細(xì)胞因子細(xì)胞因子胞內(nèi)抗原胞內(nèi)抗原核酸含量核酸含量核內(nèi)抗原核內(nèi)抗原 熒光素偶聯(lián)抗體熒光素偶聯(lián)抗體 抗體上偶聯(lián)熒光素抗體上偶聯(lián)熒光素(FITC、PE等等)，通過，通過抗原抗體反應(yīng)讓目標(biāo)細(xì)胞特異性的帶抗原抗體反應(yīng)讓目標(biāo)細(xì)胞特異性的帶上熒光。上熒光。 染色過程即抗原抗體反應(yīng)過程。染色過程即抗原抗體反應(yīng)過程。 熒光染料熒光染料/熒光化合物熒光化合物 PI、DAPI等插入核酸鏈中；等插入核酸鏈中； CFSE和蛋白質(zhì)共價結(jié)合；和蛋白質(zhì)共價結(jié)合； Annexin V-FITC檢測凋亡。檢測凋亡。 熒光蛋白熒光蛋白 如如GFP，不需要染色，直接檢測。，不需要染色，直接檢測。 免疫熒光染色主要包括直

40、接和間接免疫熒光染色兩種方法。免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標(biāo)記的方法難以進(jìn)行多色標(biāo)記，而且操作復(fù)雜、信噪間接標(biāo)記的方法難以進(jìn)行多色標(biāo)記，而且操作復(fù)雜、信噪比高，所以一般首先直標(biāo)熒光抗體。比高，所以一般首先直標(biāo)熒光抗體。熒光抗體熒光抗體熒光二抗熒光二抗第一抗體第一抗體直接標(biāo)記直接標(biāo)記間接標(biāo)記間接標(biāo)記 一般檢測時，獲取一般檢測時，獲取12萬個細(xì)胞，標(biāo)記萬個細(xì)胞，標(biāo)記0.51106細(xì)胞即細(xì)胞即可?？?。 下述情況細(xì)胞量需相應(yīng)增加：檢測胞內(nèi)下述情況細(xì)胞量需相應(yīng)增加：檢測胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細(xì)胞周期乙醇固定損失細(xì)胞多；檢測細(xì)胞在標(biāo)本次數(shù)多；細(xì)胞周期乙醇固定

41、損失細(xì)胞多；檢測細(xì)胞在標(biāo)本中比例低中比例低 0.51106個細(xì)胞個細(xì)胞孵育體積孵育體積50-100ul上機(jī)體積上機(jī)體積200-500ul終濃度約終濃度約1106個個/ml加染料加染料洗滌后補(bǔ)洗滌后補(bǔ)加液體加液體細(xì)胞表面抗原標(biāo)記細(xì)胞表面抗原標(biāo)記 表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標(biāo)記步驟表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標(biāo)記步驟也相對簡單。也相對簡單。 標(biāo)記：取標(biāo)記：取0.51106細(xì)胞，加入適量抗體細(xì)胞，加入適量抗體(根據(jù)抗體說根據(jù)抗體說明書明書)，充分混勻后，充分混勻后(總體積總體積50-100ul)， 4 避光孵育避光孵育10-30min。 洗滌：加入洗滌：加入1ml PBS洗液，洗液，3

42、00g離心洗滌離心洗滌5min。 上機(jī)檢測：棄去上清后加入上機(jī)檢測：棄去上清后加入200-500ul PBS，重懸細(xì)胞，重懸細(xì)胞后立即上機(jī)檢測；如不能及時上機(jī)檢測，則加入同樣后立即上機(jī)檢測；如不能及時上機(jī)檢測，則加入同樣體積的體積的1%多聚甲醛，混勻后置于多聚甲醛，混勻后置于4 冰箱內(nèi)保存，一冰箱內(nèi)保存，一般不超過般不超過24h。胞內(nèi)抗原熒光標(biāo)記胞內(nèi)抗原熒光標(biāo)記 細(xì)胞內(nèi)抗原：如細(xì)胞內(nèi)抗原：如MPO； 核內(nèi)抗原：如核內(nèi)抗原：如FoxP3； 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子(胞內(nèi)因子胞內(nèi)因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。等。 固定：固定：4多聚甲醛多聚甲醛 破膜破膜/透化透化 0.05%皂素

43、皂素(saponin)； 0.01% Triton X-100 70% 乙醇乙醇 膜表面抗原染色：分別加入相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體和適量膜表面抗原染色：分別加入相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體和適量細(xì)胞標(biāo)本，充分混勻后避光孵育細(xì)胞標(biāo)本，充分混勻后避光孵育10-30min。 洗滌：加洗滌：加1ml PBS洗液，洗液，300g離心離心5min。 固定：去上清后加入固定：去上清后加入500ul 4%多聚甲醛，固定多聚甲醛，固定20min。 透化：離心洗去固定劑后，加皂素透化：離心洗去固定劑后，加皂素500 ul，透化，透化10min。 胞內(nèi)抗原染色：離心洗去透化液后，加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記胞內(nèi)抗原染色：離心洗去透化液后

44、，加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記抗體，混勻后室溫避光孵育抗體，混勻后室溫避光孵育30 min。 洗滌：加洗滌：加1ml PBS洗液，洗液，300g離心離心5min。 上機(jī)檢測：棄去上清后加入上機(jī)檢測：棄去上清后加入PBS 200-500 ul后上機(jī)檢測。后上機(jī)檢測。2.3 對照的設(shè)置對照的設(shè)置 空白對照空白對照 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這靈敏的檢測到，這種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。 設(shè)置空白對照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒設(shè)置空白對照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特

45、異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。 流式結(jié)果中熒光強(qiáng)弱是一個相對流式結(jié)果中熒光強(qiáng)弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子值，光電倍增管電壓越大，電子信號越強(qiáng)；電壓越小，信號越弱。信號越強(qiáng)；電壓越小，信號越弱。 通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性對照管的通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強(qiáng)度處于陰性的位置，實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度處于陰性的位置，實(shí)驗(yàn)組的熒光值都是相對對照組。組的熒光值都是相對對照組。001001002陽性對照陽性對照Positive Control 設(shè)置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次設(shè)置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時都必須設(shè)置：分析時都必須

46、設(shè)置： 使用新的熒光素抗體時；使用新的熒光素抗體時； 使用存儲時間較長的熒光素抗體時。使用存儲時間較長的熒光素抗體時。 設(shè)置陽性對照的方法：設(shè)置陽性對照的方法： 用肯定表達(dá)有該抗原的細(xì)胞來檢測；用肯定表達(dá)有該抗原的細(xì)胞來檢測； 已經(jīng)證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。已經(jīng)證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。單標(biāo)對照單標(biāo)對照Single Staining Control 兩色或多色實(shí)驗(yàn)時須設(shè)置單標(biāo)對照，用于補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)；兩色或多色實(shí)驗(yàn)時須設(shè)置單標(biāo)對照，用于補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)； 單標(biāo)實(shí)驗(yàn)時不需要。單標(biāo)實(shí)驗(yàn)時不需要。2.4 光譜重疊與補(bǔ)償光譜重疊與補(bǔ)償當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長熒光時，

47、理論上可選擇濾當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長熒光時，理論上可選擇濾光片使每種熒光僅被相應(yīng)的通道檢測到。但由于目前使用的各種熒光光片使每種熒光僅被相應(yīng)的通道檢測到。但由于目前使用的各種熒光染料都是染料都是寬發(fā)射譜寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射的峰值各不相同，但性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射的峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，這種現(xiàn)象就是這種現(xiàn)象就是光譜重疊光譜重疊(spectral overlap)。FL1 530/30FL2 585/42發(fā)射波長FITC發(fā)射譜PE發(fā)射譜 實(shí)驗(yàn)操作中

48、，常利用電子技術(shù)和計算機(jī)軟件設(shè)置的方法將實(shí)驗(yàn)操作中，常利用電子技術(shù)和計算機(jī)軟件設(shè)置的方法將串入相鄰熒光通道的信號扣除，這種技術(shù)稱為熒光補(bǔ)償串入相鄰熒光通道的信號扣除，這種技術(shù)稱為熒光補(bǔ)償(fluorescence compensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1 - %FL2補(bǔ)償前補(bǔ)償前補(bǔ)償后補(bǔ)償后FITC單標(biāo)單標(biāo)PE 單標(biāo)單標(biāo)未補(bǔ)償未補(bǔ)償正確補(bǔ)償正確補(bǔ)償FITC-PE補(bǔ)償太大補(bǔ)償太大PE-FITC補(bǔ)償太大補(bǔ)償太大補(bǔ)償調(diào)節(jié)要合適補(bǔ)償調(diào)節(jié)要合適三、流式細(xì)胞

49、術(shù)的應(yīng)用三、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞功能在上述分析基礎(chǔ)上進(jìn)行分選在上述分析基礎(chǔ)上進(jìn)行分選 3.1 檢測細(xì)胞周期檢測細(xì)胞周期 3.2 檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 3.3 檢測細(xì)胞增殖檢測細(xì)胞增殖 3.4 免疫細(xì)胞亞型檢測免疫細(xì)胞亞型檢測 3.5 檢測細(xì)胞因子檢測細(xì)胞因子 3.6 檢測細(xì)胞吞噬功能檢測細(xì)胞吞噬功能 3.7 流式分選流式分選3.1 檢測細(xì)胞周期檢測細(xì)胞周期 處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含含量不同，量不同，G

50、0/G1期細(xì)胞含有二倍體期細(xì)胞含有二倍體量的量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍期細(xì)胞含有四倍體量的體量的DNA，而，而S期細(xì)胞期細(xì)胞DNA含量含量處于二倍體和四倍體量之間。處于二倍體和四倍體量之間。DNA Content DNA熒光染料能與熒光染料能與DNA結(jié)合，結(jié)合，DNA含量的多少與含量的多少與熒光染料的結(jié)合量熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸吸收熒光分子的多少。通過流式檢收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細(xì)胞內(nèi)測就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、期、S期和期和G2/M期細(xì)胞比例。期細(xì)胞比例。 細(xì)胞周期分析核

51、酸染料細(xì)胞周期分析核酸染料 細(xì)胞膜非通透性染料：細(xì)胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶碘化丙啶)、EB(溴化乙啶溴化乙啶)，不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜，標(biāo)記時需要通過固定等方法增不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜，標(biāo)記時需要通過固定等方法增加細(xì)胞膜的通透性。加細(xì)胞膜的通透性。 細(xì)胞膜通透性染料：細(xì)胞膜通透性染料：DAPI、Hoechst，能染活細(xì)胞的，能染活細(xì)胞的DNA，但需紫外激光激發(fā)。，但需紫外激光激發(fā)。 PI標(biāo)記法標(biāo)記法檢測細(xì)胞周期檢測細(xì)胞周期 需要乙醇固定增加細(xì)胞膜的通透性；需要乙醇固定增加細(xì)胞膜的通透性； 需要加需要加RNase，去除，去除RNA對對DNA的干擾。的干擾。 PI法檢測細(xì)胞周期一般步驟：法檢測細(xì)胞

52、周期一般步驟： 收集單細(xì)胞懸液收集單細(xì)胞懸液(1 106個個)，緩慢加入，緩慢加入1 ml預(yù)冷的預(yù)冷的70乙醇，于乙醇，于4固定過夜，或固定過夜，或-20長期固定。長期固定。 離心收集細(xì)胞，再以離心收集細(xì)胞，再以1ml PBS徹底洗去乙醇；徹底洗去乙醇； 去上清后加入染色液去上清后加入染色液(包含包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 染色染色30min后上機(jī)檢測。后上機(jī)檢測。細(xì)胞周期檢測結(jié)果細(xì)胞周期檢測結(jié)果脾臟細(xì)胞脾臟細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞通過流式檢測，能得出通過流式檢測，能得出G0/G1期、期、S期和期和G2/M期細(xì)胞比

53、例。期細(xì)胞比例。增殖指數(shù)增殖指數(shù)(proliferous index, PI)：指處于：指處于S期和期和G2/M期細(xì)胞之和占總細(xì)期細(xì)胞之和占總細(xì)胞的比例，反映了細(xì)胞的增殖能力。胞的比例，反映了細(xì)胞的增殖能力。CV值值(變異系數(shù)變異系數(shù))：衡量儀器測量分辨率和精度的指標(biāo)。：衡量儀器測量分辨率和精度的指標(biāo)。DNA倍體分析倍體分析病變腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，流式檢測病變腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，流式檢測DNA含量能反映異含量能反映異倍體情況。倍體情況。DNA指數(shù)指數(shù)(DNA index, DI)：(樣本的樣本的G0/G1期峰平均熒光道數(shù)期峰平均熒光道數(shù))/(正常二倍正常二倍體細(xì)胞體細(xì)胞

54、G0/G1期峰平均熒光道數(shù)期峰平均熒光道數(shù))，描述樣品細(xì)胞，描述樣品細(xì)胞DNA含量的偏離程度含量的偏離程度和倍體水平。和倍體水平。倍體倍體(ploidy)：染色體數(shù)目。二倍體：染色體數(shù)目。二倍體 DI=1；四倍體；四倍體 DI=2；二倍體四倍；二倍體四倍體之外統(tǒng)稱異倍體。體之外統(tǒng)稱異倍體。二倍體二倍體異倍體異倍體異倍體異倍體精子單倍體細(xì)胞精子單倍體細(xì)胞 雙聯(lián)體細(xì)胞的去除雙聯(lián)體細(xì)胞的去除 利用信號脈沖利用信號脈沖FL2-W/FL2-A區(qū)別標(biāo)本中的粘連細(xì)胞以及碎區(qū)別標(biāo)本中的粘連細(xì)胞以及碎片，最大程度的減少假陽性。片，最大程度的減少假陽性。G1雙聯(lián)體細(xì)胞雙聯(lián)體細(xì)胞G2/M細(xì)胞細(xì)胞FL2-WFL2-W

55、FL2-HFL2-HFL2-WFL2-A3.2 檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞死亡方式主要有兩種：包括細(xì)胞壞死細(xì)胞死亡方式主要有兩種：包括細(xì)胞壞死(necrosis)和細(xì)胞和細(xì)胞凋亡凋亡(apoptosis)。 細(xì)胞凋亡，也稱細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞受基因調(diào)控的一細(xì)胞凋亡，也稱細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞受基因調(diào)控的一種主動性的、高度有序的結(jié)束自己生命的過程。種主動性的、高度有序的結(jié)束自己生命的過程。 凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和生化上有明顯的特征，如細(xì)胞皺縮、凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和生化上有明顯的特征，如細(xì)胞皺縮、核固縮、細(xì)胞膜卷曲、核固縮、細(xì)胞膜卷曲、DNA片段化、線粒體電位發(fā)生變化。片段化、線粒體電位發(fā)生變化。

56、根據(jù)這些特征，流式有多種方法能定性及定量的檢測細(xì)胞根據(jù)這些特征，流式有多種方法能定性及定量的檢測細(xì)胞凋亡情況。凋亡情況。3.2.1 亞二倍體亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測峰的檢測 凋亡細(xì)胞核小體崩解，凋亡細(xì)胞核小體崩解，DNA含量減少，加之由于含量減少，加之由于DNA的降的降解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此DNA染料的著色能力下染料的著色能力下降，熒光強(qiáng)度降低，表現(xiàn)在降，熒光強(qiáng)度降低，表現(xiàn)在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞G1峰峰(凋亡峰凋亡峰)。細(xì)胞凋亡峰細(xì)胞凋亡峰 Sub-G1四倍體峰四倍體峰二倍體峰二倍體峰PINumber3.2.2 An

57、nexin V/PI雙染法雙染法正常細(xì)胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負(fù)電的磷脂正常細(xì)胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負(fù)電的磷脂(如磷脂酰絲氨如磷脂酰絲氨酸酸, PS)。早期凋亡時，細(xì)胞表面不對稱性發(fā)生改變，。早期凋亡時，細(xì)胞表面不對稱性發(fā)生改變，PS外翻到胞外側(cè)。外翻到胞外側(cè)。Annexin V是一種是一種Ca2+依賴性的對依賴性的對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別膜表面是否有作為探針識別膜表面是否有PS，從而識別凋亡細(xì)胞。，從而識別凋亡細(xì)胞。PS外翻外翻PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完

58、整的，所以PI不能不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。Annexin V-FITCPI活細(xì)胞活細(xì)胞早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期凋亡壞死細(xì)胞壞死細(xì)胞裸核裸核免疫熒光圖免疫熒光圖C1h2h3h4h5h3.2.3 線粒體膜電位檢測法線粒體膜電位檢測法凋亡細(xì)胞線粒體膜電位會發(fā)生改變，利用熒光探針羅丹明凋亡細(xì)胞線粒體膜電位會發(fā)生改變，利用熒光探針羅丹明123(Rh123)、DiOC6和和JC-1等標(biāo)記后，經(jīng)過流式能檢測出線粒體電位的變化，從而等標(biāo)記后，經(jīng)過流式能檢測出線粒體電位的變化，從而反映了細(xì)胞的凋亡情況。反映了細(xì)胞的凋亡情況。JC-1在正常細(xì)胞中在胞漿以聚合體形式存在，在在正常細(xì)胞中在

59、胞漿以聚合體形式存在，在 Fl-1 和和 Fl-2 有熒光；有熒光；細(xì)胞凋亡時線粒體膜電位發(fā)生去極化，細(xì)胞凋亡時線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1 進(jìn)入線粒體以單體形式存進(jìn)入線粒體以單體形式存在，僅在在，僅在 Fl-1通道有熒光通道有熒光 。JC-1 (Fl-1)Jurkat T CellsControl CamptothecinJC-1 (Fl-2)3.2.4 DNA斷裂片段的檢測斷裂片段的檢測(TUNNEL法法) 凋亡中晚期會發(fā)生核酸內(nèi)切酶的激活，雙鏈的凋亡中晚期會發(fā)生核酸內(nèi)切酶的激活，雙鏈的DNA出現(xiàn)不出現(xiàn)不對稱的斷裂點(diǎn)，即產(chǎn)生一系列對稱的斷裂點(diǎn)，即產(chǎn)生一系列3-OH端。加入外源性的端。加

60、入外源性的脫脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)能夠催化外源性熒光素標(biāo)記的能夠催化外源性熒光素標(biāo)記的dUTP連接到連接到DNA的的3-OH端，通過流式檢測就能知道端，通過流式檢測就能知道DNA斷裂片段的多少，這斷裂片段的多少，這種方法叫做種方法叫做TdT介導(dǎo)的介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法缺口末端標(biāo)記法(TdT mediated-dUTP nick end labeling, TUNEL)。 近來研究證實(shí)，近來研究證實(shí)，Br-dUTP(BrdU)更容易摻入到凋亡細(xì)胞的更容易摻入到凋亡細(xì)胞的DNA中，所以現(xiàn)在