傳代細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)

1、當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一方面由于細(xì)胞密度過(guò)大，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物枯竭和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。因此需要將培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的這個(gè)過(guò)程稱為傳代(passage) 或者再培養(yǎng)(subculture) 。1)傳代標(biāo)準(zhǔn)傳代時(shí)間一般通過(guò)兩個(gè)方面進(jìn)行確定：一是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)液由于pH 值下降而呈現(xiàn)黃色時(shí)，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度，需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)；二是觀察細(xì)胞形態(tài)，健康細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。初代培養(yǎng)的首次傳代很重要，

2、是建立細(xì)胞系的關(guān)鍵時(shí)期。在首次傳代時(shí)一般要特別注意以下3 點(diǎn)：細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面之前，不要急于傳代。原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很常見(jiàn)。 傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要，注意觀察及時(shí)進(jìn)行處理，并可根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間不同而分離和純化所需要的細(xì)胞。 另外早期傳代的培養(yǎng)細(xì)胞較已經(jīng)建系的培養(yǎng)消化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境有利于細(xì)胞生存和增殖。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳人新的培養(yǎng)瓶。2)生長(zhǎng)周期和傳代比例體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂

3、的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。 傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分離后再次培養(yǎng)，進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳代數(shù)可以衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。傳代是細(xì)胞分裂造成的結(jié)果，細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)細(xì)胞周期， 分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞周期能準(zhǔn)確表示細(xì)胞增殖速度。兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間也可以用細(xì)胞世代時(shí)間來(lái)表示，所以細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限生長(zhǎng)下去。傳代代數(shù)與細(xì)胞的世代數(shù)（增殖代數(shù)）并不是同一個(gè)概念。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，所說(shuō)的“第 6 代細(xì)胞”指細(xì)胞已經(jīng)傳代 6 次。以貼壁細(xì)胞為例

4、，每傳代一次，大概要倍增36次，細(xì)胞要經(jīng)歷如下生長(zhǎng)過(guò)程：游離期、貼壁期、潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和停止期（平臺(tái)期）。 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，就要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變。甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞有密度依賴和接觸抑制的特點(diǎn)，細(xì)胞濃度過(guò)低，不易存活，表現(xiàn)為細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期；細(xì)胞濃度過(guò)高，發(fā)生接觸抑制后生長(zhǎng)遲緩甚至死亡，所以傳代比例通常按1:21:4的稀釋度進(jìn)行。傳代后細(xì)胞的接種濃度一般為5X 10的5次方/mL。細(xì)胞傳代方法1）概述2）根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的培養(yǎng)細(xì)胞傳代方法。 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以用直接吹打或離心分離后傳代，或自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法

5、傳代，部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代。3）細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)常用的酶為胰蛋白酶，它可以破壞細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)瓶之間的細(xì)胞連接或接觸，從而使它們之間的連接減弱或完全消失。經(jīng)胰蛋白酶處理后的貼壁細(xì)胞在外力（如吹打）的作用下可以分散成單個(gè)細(xì)胞，再經(jīng)稀釋和接種后就可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)和空間，達(dá)到細(xì)胞傳代培養(yǎng)的目的。2）方法（1）貼壁細(xì)胞的消化法傳代吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。向瓶?jī)?nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA 混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流過(guò)所有細(xì)胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加l2 mL新的消化液，輕輕搖動(dòng)后再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化。也可不采用上述步驟，直接加消

6、化液進(jìn)行消化。最好在37 c或25 qC以上室溫環(huán)境下進(jìn)行消化。消化 25 min后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hank's液數(shù)毫升。輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的 培養(yǎng)液，終止消化。用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，吹打過(guò)程要順序進(jìn)行，從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛,同時(shí)盡可能不要出現(xiàn)泡沫，這些都會(huì)對(duì)細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。(2)

7、懸浮細(xì)胞的傳代因懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞不貼壁，故傳代時(shí)不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。直接傳代即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2-2/3 ，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。 懸浮細(xì)胞常采用離心方法傳代，即將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，80g 1000 r/min離心5min,去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液，然后傳代接種。(3)半懸浮細(xì)胞的傳代半懸浮細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，可不經(jīng)消化處理直接吹打使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。但這種方法僅限于部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等。直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大細(xì)胞也常有大量丟失，因而絕大

8、部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞均需消化后，才能吹打傳代。細(xì)胞系的維持細(xì)胞系的維持是培養(yǎng)工作重要內(nèi)容。通過(guò)換液、傳代、再換液、再傳代和細(xì)胞凍存實(shí)現(xiàn)細(xì)胞系的維持，但對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)都有其自身特點(diǎn)。要做好細(xì)胞系的維持必須注意以下4 點(diǎn)：細(xì)胞系檔案要記錄好，如組織來(lái)源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時(shí)間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長(zhǎng)形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本等。這些記錄對(duì)于保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)，保持細(xì)胞的一致、觀察長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后細(xì)胞特性的改變都有十分重要的意義。因此， 無(wú)論在索取新細(xì)胞系還是自己建立新細(xì)胞系時(shí)都要盡可能把上述資料收集齊全。細(xì)胞系的傳代、換液一般都有自身的規(guī)律性，因此在維持傳代時(shí)要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)

9、律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)特性發(fā)生改變，影響以后細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，以防細(xì)胞之間的交叉污染。傳代時(shí)所用器械要編號(hào)或做好標(biāo)記，嚴(yán)禁交叉使用.每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，防止由于培養(yǎng)細(xì)胞污染等因素造成細(xì)胞系的絕種；另外，二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用，最好凍存，以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或發(fā)生改變。培養(yǎng)細(xì)胞的純化體外培養(yǎng)細(xì)胞源于動(dòng)物機(jī)體，而機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞都混雜生長(zhǎng)，每一種組織都有血管和間葉組織，因此， 從體內(nèi)取得的培養(yǎng)材料所做的原代培養(yǎng)，絕大多數(shù)都是各種細(xì)胞混合生長(zhǎng)。其主要表現(xiàn)為兩大類，即上皮樣細(xì)胞和纖維樣細(xì)胞。

10、在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中即使都是纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞，它們也有種類的不同，如纖維樣細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等。而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究都要求采用單一種類細(xì)胞，這樣才能對(duì)某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等的變化進(jìn)行研究，因此培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。細(xì)胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類?？筛鶕?jù)不同細(xì)胞種類、來(lái)源、實(shí)驗(yàn)要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法。1)自然純化自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，排擠其他細(xì)胞生長(zhǎng)，靠自然的增殖潛力最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無(wú)法人為的選擇細(xì)胞，時(shí)間長(zhǎng)，多

11、數(shù)情況下，剩下的都是成纖維細(xì)胞，因此，僅有些惡性腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)此方法，自然純化而建立細(xì)胞系。2)人工純化利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。(1)酶消化法概述： 由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶比較敏感，而上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性較高，因此， 在消化培養(yǎng)細(xì)胞特別是原代培時(shí)， 成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，養(yǎng)和培養(yǎng)早期，這種差異尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi)達(dá)到純化細(xì)胞的目的。方法：采用普通消化傳代方法，將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)

12、瓶?jī)?nèi)兩次，每次加1 mL(25 mL 培養(yǎng)瓶)，稍加搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)所有細(xì)胞表面，然后倒掉。蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫壁，立即加入 2mL 有血清培養(yǎng)液，終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域 (可事先在顯微鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上畫出記號(hào))：吹打過(guò)程中不要用力，也不要吹上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，或隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作。經(jīng)過(guò)幾次處理可以將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_(kāi)。(2)機(jī)械劃除法概述：原代培養(yǎng)成功后，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞多數(shù)都同時(shí)出現(xiàn)，混雜生長(zhǎng)

13、。這種混雜生長(zhǎng)常常分區(qū)呈片，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上：因此可以采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞的區(qū)域，而保留需要的。方法： 將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行。用彎頭滴管在不需要生長(zhǎng)的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞脫壁懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞；推劃后用培養(yǎng)液沖洗兩次，即可加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長(zhǎng)出， 可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染。(3)反復(fù)貼壁法概述：成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細(xì)胞常能在1030 min 完成附著過(guò)程(但不一定完全伸展);而上皮細(xì)胞大部分在短時(shí)間內(nèi)不能附著

14、或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起。利用不同細(xì)胞貼壁速度不同的特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)反復(fù)貼壁，可以將早期傳代培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分開(kāi)。方法：將細(xì)胞懸液接種到一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(最好用無(wú)血清培養(yǎng)，因?yàn)樵跓o(wú)血清支 持下，上皮細(xì)胞貼壁更慢)靜置20 min；在顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞部分貼壁，稍 加搖蕩也不浮起時(shí)，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁細(xì)胞一起倒出或吸到另一培養(yǎng)瓶；繼續(xù)培養(yǎng)或重復(fù)上述操作，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞逐步分隔開(kāi)。(4)克隆法在同一細(xì)胞系中，存在不同的細(xì)胞株，它們的功能和生長(zhǎng)特點(diǎn)僅略有不同，要純化出某一種細(xì)胞，用上述方法常不能將同一細(xì)胞系的不同株分開(kāi)，可采用細(xì)胞克隆的方法。具體過(guò)程是采用細(xì)胞克隆法將細(xì)胞分成單個(gè)細(xì)胞，使之分別生長(zhǎng)成克隆，然