基因工程載體

1、vectors第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 質粒載體質粒載體 第三節(jié)第三節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體第四節(jié)第四節(jié) 大分子大分子DNA克隆載體克隆載體第五節(jié)第五節(jié) 病毒載體病毒載體第六節(jié)第六節(jié) 基因打靶載體基因打靶載體第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、基因克隆載體的概念一、基因克隆載體的概念二、基因工程對載體的要求二、基因工程對載體的要求三、載體的種類三、載體的種類四、克隆載體的發(fā)展概況四、克隆載體的發(fā)展概況一、一、 基因克隆載體的概念基因克隆載體的概念 基因載體基因載體是一類能自我復制的是一類能自我復制的DNA分子，其中分子，其中的一段的一段DNA被切除而不影響其復制，可用以置換或被切除而不影響其復

2、制，可用以置換或插入外源插入外源(目的目的) DNA而將目的而將目的DNA帶入宿主細胞。帶入宿主細胞。 （1）在宿主細胞內能獨立復制。）在宿主細胞內能獨立復制。 （2）有選擇性標記。）有選擇性標記。（3）有一段多克隆位點。）有一段多克隆位點。二、基因工程對載體的要求二、基因工程對載體的要求外源外源DNADNA插入其中不影響載體的復制。插入其中不影響載體的復制。（4）分子量小，拷貝數多。）分子量小，拷貝數多。（5）容易從宿主細胞中分離純化。）容易從宿主細胞中分離純化。polylinker 基因工程中常用的載體有基因工程中常用的載體有5類：類： 三、載體的種類三、載體的種類質粒（質粒（plasmi

3、d）單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物柯斯質粒（柯斯質粒（cosmid）動物病毒（動物病毒（virus） 第一階段（第一階段（19771977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如如pSC101, colE1, pCRpSC101, colE1, pCR, pBR313, pBR313和和pBR322pBR322。第二階段：第二階段：增大載體容量增大載體容量（降低載體長度），建立（降低載體長度），建立多克多克隆位點區(qū)隆位點區(qū)和新的和新的遺傳標記遺傳標記基因。如基因。如pUCpUC系列載體。系列載體。 四、克隆載體的發(fā)展概況四、克隆載體

4、的發(fā)展概況第二節(jié)第二節(jié) 質粒載體質粒載體一、質粒（一、質粒（plasmid）二、質粒的類型二、質粒的類型三、質粒的復制類型三、質粒的復制類型四、質粒載體的構建四、質粒載體的構建五、經典的大腸桿菌質粒載體五、經典的大腸桿菌質粒載體六、其它質粒載體六、其它質粒載體七、質粒載體的不穩(wěn)定性七、質粒載體的不穩(wěn)定性第二節(jié)第二節(jié) 質粒載體質粒載體 一、質粒（一、質粒（plasmid）是獨立于染色體以外的能自主復制的是獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。大腸桿菌的質粒大腸桿菌的質粒（1）分子小：）分

5、子?。?. 質粒的一般生物學特性質粒的一般生物學特性1200 kb（2）編碼基因少：）編碼基因少：23個中等大小的蛋白質。個中等大小的蛋白質。（3）環(huán)形狀：）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性。一些額外的特性。（4）質粒的空間構型：）質粒的空間構型： 共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA 線形線形DNA （ linear ，lDNA）一條鏈上有一至數個缺口。一條鏈上有一至數個缺口。 開環(huán)開環(huán)DNA（

6、 open circular， ocDNA）（5）質粒空間構型與電泳速率）質粒空間構型與電泳速率同一質粒盡管分子量相同，不同的構同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：型電泳遷移率不同：scDNA最快、最快、l DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL二、質粒的類型二、質粒的類型在大腸桿菌中的質粒，可以分為：在大腸桿菌中的質粒，可以分為：接合型質粒接合型質粒:非接合型質粒非接合型質粒能自我轉移能自我轉移不能自我轉移不能自我轉移除了帶有自我除了帶有自我復制復制所必需的遺傳信息外所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌還帶有一套控制細菌配對配對和質粒和質粒接合轉接合轉移移的基因。的

7、基因。如：如：F質粒（性質粒、或質粒（性質粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉移到原先不存在該質粒的受體菌中。轉移到原先不存在該質粒的受體菌中。又叫又叫自我轉移型質粒自我轉移型質粒。1. 接合型質粒：接合型質粒：不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。大腸桿菌接合（大腸桿菌接合（conjunction）可接合質粒如可接合質粒如 F 因子（因子（F factor） 2. 非接合型質粒：非接合型質粒：雖然帶有自我雖然帶有自我復制復制所必需的遺傳信息，但失所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質粒接合去了控制細菌配對和質粒接合轉

8、移轉移的基因，的基因，因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞。因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞。（1）R質粒（抗性質粒）：質粒（抗性質粒）：帶有一種或數種帶有一種或數種抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主獲，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。帶有控制帶有控制大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）合合成的基因。成的基因。（2）Col質粒：質粒：大腸桿菌素對不帶大腸桿菌素對不帶Col質粒的大腸桿菌有毒。質粒的大腸桿菌有毒。三、質粒的復制類型三、質粒的復制類型1. 嚴緊型質粒（嚴緊型質粒（stringe

9、nt plasmid）拷貝數少拷貝數少，只有，只有13份拷貝。份拷貝。2. 松弛型質粒（松弛型質粒（relaxed plasmid）拷貝數多拷貝數多，有，有1060份拷貝。份拷貝。（接合型質粒分子量大，一般屬嚴緊型）。（接合型質粒分子量大，一般屬嚴緊型）。（非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。（非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。（1）分子量大，拷貝數低）分子量大，拷貝數低四、質粒載體的構建四、質粒載體的構建1. 天然質粒的局限性天然質粒的局限性第一個用于基因克隆的天然質粒第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長，分子長 9.1 kb。但只有一個但只有一個EcoR I切點充當克隆位

10、切點充當克隆位點，點，Tetr 作為篩選標志。作為篩選標志。ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌質粒的篩選標志是大腸桿菌素素E1（colicin E1）。）。（2）篩選標志不理想）篩選標志不理想colicin E1能殺死不含能殺死不含ColE1 質粒的菌，質粒的菌，形成形成“噬菌斑噬菌斑”。唯一的克隆位點唯一的克隆位點 EcoR I 正好位于這個正好位于這個基因的內部。基因的內部。（1）具有復制起點（）具有復制起點（ORI）2. 質粒載體必須具備的基本條件質粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內切酶的單一位點：）若干限制性內切酶的單一位點：是篩選的

11、標志。理想的載體應該有兩是篩選的標志。理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。種抗菌素抗性基因。用來插入外源用來插入外源DNA片斷。且插入后不影片斷。且插入后不影響復制功能。響復制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數。）具有較小的分子量和較高的拷貝數。氨芐青霉素抗性（氨芐青霉素抗性（ Apr或或 Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kmr或或Kanr）四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性 （Tcr或或Tetr）鏈霉素抗性鏈霉素抗性 （Smr或或Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmr或或Cmlr）3. 質粒的選擇標記及其工作原理：質粒的選擇標記及其工作原理：（1）選擇標記）選擇標記絕大多數質粒載體都是用抗

12、菌素抗性絕大多數質粒載體都是用抗菌素抗性標記：標記：i）氨芐青霉素（）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生物。通過干擾細菌細胞壁合成的末端反通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死應，殺死生長的細菌生長的細菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）細菌抗性原理）細菌抗性原理Ampr基因編碼基因編碼 -內酰胺酶內酰胺酶，特異地，特異地切割氨芐青霉素的切割氨芐青霉素的 -內酰胺環(huán)。內酰胺環(huán)。通過與通過與50S核糖體亞基結合，干擾細胞核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死死。b）細菌抗性原理）細菌抗性原理Cmlr 編碼編碼乙酰轉

13、移酶乙酰轉移酶，特異地使氯霉，特異地使氯霉素乙?；Щ?。素乙酰化而失活。a）抑菌原理）抑菌原理a）殺菌原理）殺菌原理通過與通過與70S核糖體結合，導致核糖體結合，導致mRNA發(fā)生錯讀，發(fā)生錯讀，殺死細菌殺死細菌。b）細菌抗性原理）細菌抗性原理Kanr 編碼的編碼的氨基糖苷磷酸轉移酶氨基糖苷磷酸轉移酶，對，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結合作用。合作用。a）殺菌原理）殺菌原理通過與通過與30S核糖體亞基結合，導致核糖體亞基結合，導致mRNA錯譯，錯譯，殺死細菌殺死細菌。b）細菌抗性原理）細菌抗性原理Strr 編碼一種編碼一種氨基糖苷磷酸轉移酶氨基糖苷磷酸轉

14、移酶對鏈對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體霉素進行修飾，阻斷其與核糖體30S亞亞基結合作用?；Y合作用。b）細菌抗性原理）細菌抗性原理a）抑菌原理）抑菌原理通過與通過與30S核糖體亞基結合，干擾細胞核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成，殺蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成，殺死死生長的細菌生長的細菌。Tetr 編碼特異性蛋白質，對細菌的膜結編碼特異性蛋白質，對細菌的膜結構進行修飾，組止四環(huán)素通過細胞膜進構進行修飾，組止四環(huán)素通過細胞膜進入細菌細胞內。入細菌細胞內。當帶有當帶有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的載體載體進入受體菌進入受體菌后，受體菌才能生長。后，受體菌才能生長。不帶有不帶有

15、抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受體菌不能在的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。生長。（2）抗菌素選擇原理）抗菌素選擇原理活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素（1）高拷貝數的質粒載體）高拷貝數的質粒載體ColE1、pMB1派生質粒具有高拷貝數派生質粒具有高拷貝數的特點。的特點。（2）低拷貝數的質粒載體）低拷貝數的質粒載體 有特殊用途有特殊用途:由由pSC101派生來的載體特點是分子量大，派生來的載體特點是分子量大，拷貝數低。拷貝數低。當有些被克隆的基因的表達產物過多時會當有些被克隆的基因的表達產物過多時會嚴重地影響寄主菌的正常代謝活動，導致嚴重

16、地影響寄主菌的正常代謝活動，導致寄主菌死亡，就需要低拷貝的載體。寄主菌死亡，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等等（3）失控的質粒載體）失控的質粒載體這是一類這是一類溫度敏感型復制控制溫度敏感型復制控制質粒。質粒。溫度低（低于溫度低（低于37 oC），拷貝數很少；），拷貝數很少；溫度增加（溫度增加（40 oC）時，拷貝數會很快增）時，拷貝數會很快增加到加到1000個以上。個以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors（4） 插入失活型質粒載體插入失活型質粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因

17、內部。標記基因內部。如如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐钥咕乜剐酝庠赐庠碊NA無抗菌素抗性無抗菌素抗性正選擇的質粒載體正選擇的質粒載體如如pUR2、pTR262等。等。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。能在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉化后的細胞。直接選擇轉化后的細胞。目前通用的絕大部分質粒載體都是正目前通用的絕大部分質粒載體都是正選擇載體。選擇載體。Direct selection vectors（6） 表達型質粒載體表達型質粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。復制起始點復制起始

18、點ORI、選擇標記、選擇標記、多克隆位點多克隆位點MCS2）大腸桿菌操縱子元件）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因阻遏基因 I操縱基因操縱基因O啟動基因啟動基因P核糖體結合位點序列（核糖體結合位點序列（SD）轉錄終止信號區(qū)。轉錄終止信號區(qū)。1）普通載體元件）普通載體元件表達載體的表達載體的結構結構五、經典的大腸桿菌質粒載體五、經典的大腸桿菌質粒載體1. pSC101第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質粒載體。粒載體。（1）類型）類型天然質粒，屬低拷貝型。天然質粒，屬低拷貝型。（2）長度）長度9.09 kb。（3）選擇標記）選擇標記四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性Tetr6個克隆

19、位點：個克隆位點：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個位個位于選擇標記于選擇標記Tetr的內部）的內部）（4）克隆位點）克隆位點2. ColE1（1）類型）類型天然質粒，屬高拷貝型。天然質粒，屬高拷貝型。（2）長度）長度6.3 kb。（3）選擇標記）選擇標記大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicin）E1。EcoR I位于位于E1內部，插入外源內部，插入外源DNA會導會導致致E1失活，使受體菌不能合成失活，使受體菌不能合成E1（ColE1- -）。）。EcoR I（

20、4）克隆位點）克隆位點Colicin E1外源外源DNA無無ColicinpSP2124質粒的質粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件來源）元件來源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工構建載體。人工構建載體。 復制起點復制起點 oripMB1系列（來源于系列（來源于ColE1）的的高拷貝高拷貝型復制起點型復制起點 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因?；?。pBR322pBR322質?？寺≥d體構建過程質?？寺≥d體構建過程（2）長度）長度4363bp（3）選擇標記）選擇標記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點）

21、克隆位點其中其中9個會導致個會導致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）；3個會導致個會導致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個克隆位點。個克隆位點。（5）pBR322的優(yōu)點的優(yōu)點 雙抗菌素抗性選擇標記雙抗菌素抗性選擇標記插入失活，分兩次先后選擇：插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細胞沒有獲得載體的寄主細胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。獲得載體的寄主細胞獲得載體的寄主細胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因

22、外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡 安全安全失去了轉移蛋白基因失去了轉移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通過接合轉移。不能通過接合轉移。 高拷貝數高拷貝數 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大保留了轉移蛋白（保留了轉移蛋白（mob）的）的作用位點作用位點。 能夠被能夠被ColK質粒編碼的質粒編碼的mob蛋白識別，蛋白識別，如果再有如果再有F質粒的參與，就有可能轉移。質粒的參與，就有可能轉移。 刪除刪除mobmob識別位點識別位點（如質粒（如質粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：從從pBR322上切去上切去HaeII片斷，既除片斷

23、，既除去了去了mob識別位點，又增加質粒的識別位點，又增加質粒的拷貝數?？截悢怠＃?）PBR322的改進的改進pBR325：在在pBR322位點上接入一段來自噬菌位點上接入一段來自噬菌體體PICm的的HaeII酶切片斷（帶有氯霉酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也帶一個上也帶一個EcoRI位點位點。使使EcoRI 也成為插入失活型位點。也成為插入失活型位點。 改造改造EcoR I 位點位點University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎上改的基礎上改造而成，屬正選擇載體。造而成

24、，屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復制起點復制起點pBR322的的 ori但其上失去了克隆位點。但其上失去了克隆位點。 Ampr 基因基因（1）元件來源）元件來源 lacZ的啟動子的啟動子大腸桿菌大腸桿菌 lacZ基因基因-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽基因（肽基因（lacZ）。）。pBR322的的Ampr基因基因（2）長度）長度約約2.7kb（3）克隆位點）克隆位點10個連續(xù)的單一限制酶切位個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于點，位于lacZ基因的基因的5端。端。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互補肽互補（藍白（藍白斑

25、）相結合。斑）相結合。（4）選擇標記）選擇標記藍白斑選擇原理：藍白斑選擇原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside）5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖半乳糖 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把無色的化合物能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個分解成半乳糖和一個深藍色深藍色的的物質物質5-溴溴-4-氯靛藍。氯靛藍。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍氯靛藍 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal顯色反應：顯色反應：lacZ的的 肽互補肽互補1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨

26、基酸片斷端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4 4聚體的狀態(tài)下才有功能聚體的狀態(tài)下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚體聚體2）受體菌）受體菌lacZ突變（突變（lacZM15）受體菌基因組的受體菌基因組的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解聚體的活性酶，不能分解Xgal 受體菌株：受體菌株：JM系列系列、TG1、TG2、X

27、L1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC質粒載體上的質粒載體上的lacZ 編碼編碼 肽與這個肽與這個缺失突變的缺失突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互補互補”，使，使它能形成它能形成4聚體。又能分解聚體。又能分解Xgal。產生。產生藍色物質。藍色物質。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受體菌受體菌lacZ3）載體）載體lacZ與與 互補互補4） 互補的插入失活互補的插入失活pUC載體上載體上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位點點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合的合成，但插入外源基因就會阻止成，但插

28、入外源基因就會阻止LacZ的的合成，不能互補。合成，不能互補。 lacZ53 肽移碼突變肽移碼突變lacZ53 肽肽不互補不互補互補互補MCS外源外源DNAIPTG是乳糖的類似物。能誘導是乳糖的類似物。能誘導lac操操縱子的啟動轉錄，使受體菌基因組中縱子的啟動轉錄，使受體菌基因組中的的lacZ 的的C端部分端部分和載體的和載體的lacZ 肽肽都表達，從而互補。都表達，從而互補。IPTG異丙基異丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS無插入時，互補，藍菌斑。無插入時，互補，藍菌斑。MC

29、S有插入時，不互補，白菌斑。有插入時，不互補，白菌斑。IPTG誘導的結果：誘導的結果：無質粒的無質粒的受體菌受體菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；無抗菌素抗性無抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑無菌斑生長生長質粒轉化質粒轉化的受體菌的受體菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被載體產物缺失被載體產物 互補，能分解互補，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍色有藍色菌斑生菌斑生長長帶外源帶外源DNADNA插插入

30、的質粒轉化入的質粒轉化的受體菌的受體菌載體產物失活，載體產物失活，不能互補不能互補 - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色有白色菌斑生菌斑生長長 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18為為2682bp，pUC8為為2750bp。 選擇方便選擇方便Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利克隆便利具有多克隆位點（具有多克隆位點（MCS），使有兩個不），使有兩個不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。

31、測序方便測序方便pUC的的MCS與與M13噬菌體載體的噬菌體載體的MCS完完全相同，便于把外源全相同，便于把外源DNA轉移到轉移到M13載載體上測序。體上測序。六、其它質粒載體六、其它質粒載體1. pGEM-3Z由由pUC派生而來。派生而來。與與pUC的主要區(qū)別是在的主要區(qū)別是在MCS的兩側分別的兩側分別加了一個噬菌體加了一個噬菌體啟動子啟動子T7和和SP6。T7啟動子啟動子SP6啟動子啟動子MCSlacZAmprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶識別轉錄。聚合酶識別轉錄。 如果加入純化的如果加入純化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在試管里就可以轉錄在試管里就可以轉錄mRNA

32、外源基因正接反接都可以轉錄。外源基因正接反接都可以轉錄。 MCS與與pUC18的完全一樣。的完全一樣。2. pGEM-4Z：與與pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7啟動子和啟動子和SP6啟動子的啟動子的位置互換位置互換。（1 1）pGEM-3Z的特點：的特點：（1 1）穿梭質粒載體的結構）穿梭質粒載體的結構人工構建的、具有兩種不同復制起人工構建的、具有兩種不同復制起點和選擇標記、可以在兩種不同的點和選擇標記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體。寄主細胞中存活和復制的質粒載體。Yeast復制起點復制起點E.coli復制起點復制起點E.coli選擇標記選擇標記Yeast選擇標記選擇標

33、記MCS大腸桿菌大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌大腸桿菌動物細胞穿梭載體動物細胞穿梭載體（2 2）常用的穿梭質粒載體）常用的穿梭質粒載體（3 3）穿梭載體的優(yōu)點）穿梭載體的優(yōu)點 也能利用其它細胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿也能利用其它細胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細胞等）進行基因表達。菌、哺乳動物細胞等）進行基因表達。 可以自如地在兩種不同寄主細胞之可以自如地在兩種不同寄主細胞之間來回轉移基因。間來回轉移基因?？寺?、構建克隆、構建表達表達E.coliAnimal cell 利用大腸桿菌進行基因克隆、表達。利用大腸桿菌進行基因克隆、表達。

34、第三節(jié)第三節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體一、噬菌體的一般特性一、噬菌體的一般特性二、噬菌體的生活周期二、噬菌體的生活周期三、單鏈噬菌體載體三、單鏈噬菌體載體四、雙鏈噬菌體載體四、雙鏈噬菌體載體 載體載體第三節(jié)第三節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體 噬菌體是一類細菌病毒（噬菌體是一類細菌病毒（Bacteriophage）。）。一、噬菌體的一般特性一、噬菌體的一般特性結構：結構：蛋白質外殼內包裹蛋白質外殼內包裹著著DNA（雙鏈、單（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀鏈、線性、環(huán)狀等）。等）。分為兩種：分為兩種：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌體的生活周期二、噬菌體的生活周期 感染細菌后立即在菌體內復制和合感染細菌后立即在菌

35、體內復制和合成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。噬菌體。烈性噬菌體（烈性噬菌體（virulent phage)2. 溶原周期：溶原周期： 感染細菌后，將自己的感染細菌后，將自己的DNA整合到整合到細菌的染色體細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱中。形成這一過程稱為溶原化（為溶原化（lysogenization)。溫和噬菌體（溫和噬菌體（temperate phage)三、單鏈噬菌體載體三、單鏈噬菌體載體單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體：（2）復制型（）

36、復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀DNA。1. 單鏈單鏈DNA噬菌體的特點噬菌體的特點（3）RF DNA和和ssDNA都能轉染感受態(tài)都能轉染感受態(tài) 大腸桿菌。并產生噬菌斑。大腸桿菌。并產生噬菌斑。（5）可產生大量的含有外源）可產生大量的含有外源DNA插入片插入片 斷的斷的單鏈分子單鏈分子，便于作探針或測序。，便于作探針或測序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。）不存在包裝限制。RF dsDNA在寄主細胞內以高拷貝形式在寄主細胞內以高拷貝形式存在。存在。成熟的噬菌體里只包裝有成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也，也容易提取。容易提取。M13噬菌體只感染噬菌體只感染雄性雄

37、性大腸桿菌。大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長度長度（3）DNA提純提純（1）寄主）寄主（4）M13的生活周期的生活周期M13通過雄性細菌的通過雄性細菌的F性須性須注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA轉錄轉錄mRNA、合成、合成+DNA、翻譯形、翻譯形成噬菌體蛋白成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細胞擠出寄主細胞+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白外殼蛋白組裝成子代組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌注入大腸桿菌復制復制轉錄轉錄翻譯翻譯+DNA指導合成指導合成+DNA200個個 RF DNA每個細胞可以放出約每個細胞可以

38、放出約10001000個個M13M13顆粒！顆粒！3. M13載體的構建：載體的構建：M13基因組中只有基因基因組中只有基因II與基因與基因IV之間之間存在一段存在一段507bp的基因間隔區(qū)。的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定）克隆區(qū)域的選定 基因間隔區(qū)（基因間隔區(qū)（intergenic region, IG區(qū)）區(qū)）IG區(qū)內只有一個區(qū)內只有一個 BsuI 切點。切點。其余其余9個個BsuI限制性位點分布在其它部位。限制性位點分布在其它部位。 酶切位點酶切位點M13J. Messing證明，證明，IG區(qū)存在區(qū)存在M13的的復制起復制起點點，但可以插入外源，但可以插入外源DNA而不影響而不影響M1

39、3噬菌體的活力。噬菌體的活力。在在IG區(qū)內插入一個大腸桿菌的區(qū)內插入一個大腸桿菌的LacZ（ -肽序列肽序列)。利用利用 -肽序列中的三個單一酶切位肽序列中的三個單一酶切位點（點（Bgl II、Ava II 和和 Pvu I）。）。（2）加入酶切位點）加入酶切位點 在在IG區(qū)內加入單一內切酶位點區(qū)內加入單一內切酶位點第一個第一個M13載體：載體：M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化不完全消化各種長度的線性片斷各種長度的線性片斷E.coli lac基因的基因的HindII片斷片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ）連接連接M13mp1JM101宿主宿主只有在只有在IG區(qū)插入區(qū)插入l

40、acZ才能在含有才能在含有X-gal和誘導物和誘導物IPTG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時出現藍白菌斑。的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時出現藍白菌斑。（3）M13載體系列載體系列加上常用的酶切位點。加上常用的酶切位點。 M13載體系列的命名載體系列的命名M13mpn n代表系列數字代表系列數字 對對M13mp1的改進的改進B. Gronenborn和和J. Messing1978年把年把LacZ 5端的第端的第13個核苷酸個核苷酸G突變成突變成A，產生了一個產生了一個EcoR I切點。切點。M13mp2：5ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用用N-甲基甲基-N-亞硝基脲亞硝基脲 把把G甲基化甲基化 5ATGA

41、CCATGATTACGGATTCA-轉染轉染E.coli。mG與與T配對，復制兩次后配對，復制兩次后5ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切點切點用用EcoRI切切M13mp1M13mp2選擇能切開的選擇能切開的 線性分子線性分子再環(huán)化再環(huán)化M13mp1 對對M13mp2的進一步改進的進一步改進在在M13mp2的的LacZ的的5端加上一段人工端加上一段人工合成的多克隆位點（合成的多克隆位點（MCS）。）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對應有相同對應有相同MCS的的pUC系列載體：系列載體：pUC7、pU

42、C8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為成為M13mp系列載體：系列載體：（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段（2） X-gal顯色反應，可供直接選擇顯色反應，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈分子中的每一條鏈子代子代M13噬菌體中包含的是單連噬菌體中包含的是單連+DNA。MCS+-+-+-編碼鏈編碼鏈非編碼鏈非編碼鏈外源外源DNA不同的酶切不同的酶切不同的酶切不同的酶切插入插入M13 vectorM13 RF+-+-+-外源外源DNA轉染轉染E. col

43、i成熟的子代成熟的子代M13中中+ 插入外源插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 實際克隆能力小于實際克隆能力小于1500bp1500bp。5. M13載體的缺點載體的缺點由由質粒載體質粒載體與與單鏈噬菌體載體單鏈噬菌體載體的復制起點的復制起點結合而成的新型載體系列。結合而成的新型載體系列。MCS噬菌體噬菌體ori質粒質粒oriAmprlacZlacI約約3000bp（比（比M13?。┬。┛寺∧芰Υ罂寺∧芰Υ竽懿迦肽懿迦?0kb的外源的外源DNA。兩種復制形式兩種復制形式分子量小分子量?。?）噬菌粒載體的特點）噬菌粒載體的特點既具有質粒的復制起點，又具有噬菌體既具有質粒的

44、復制起點，又具有噬菌體的復制起點。的復制起點。既能在大腸桿菌中以質粒的形式雙鏈復制，既能在大腸桿菌中以質粒的形式雙鏈復制，又能在噬菌體內進行單鏈復制。又能在噬菌體內進行單鏈復制。（2）常見的噬菌粒載體）常見的噬菌粒載體噬菌粒載噬菌粒載體體質粒部分質粒部分單鏈噬菌單鏈噬菌體部分體部分輔助噬菌輔助噬菌體體大腸桿菌大腸桿菌寄主寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101 VXM13M13變異變異株株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue輔助噬菌體用來復制和包裝噬菌粒載體。輔助噬菌體

45、用來復制和包裝噬菌粒載體。（3）pUC118/pUC119 構成構成1）M13的基因間隔區(qū)（的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質粒載體：質粒載體：帶有帶有M13復制起點。復制起點。質粒復制起點質粒復制起點AmprlacZMCSMCSpUC18/pUC19 oriAmprlacZlacIM13 ori3.2kbpUC118/119 pUC118/119的復制模式的復制模式兩種不同的復制模式兩種不同的復制模式1）雙鏈質粒復制模式）雙鏈質粒復制模式受受pUC本身的復制起點（來源于本身的復制起點（來源于ColE1）的控制。）的控制。來源于來源于M13的復制起點被的復制起點被輔助噬菌體輔助噬

46、菌體的基因的基因II產物控制。產物控制。2）單鏈滾環(huán)噬菌體復制模式）單鏈滾環(huán)噬菌體復制模式外殼蛋白外殼蛋白復制蛋白復制蛋白輔助輔助M13包裝包裝當寄主細胞被當寄主細胞被輔助噬菌體輔助噬菌體M13感染后。感染后。（4）PCR產物克隆載體產物克隆載體 T 載體載體pCR系列載體系列載體Invitrogen公司開發(fā)的公司開發(fā)的線性線性噬菌粒載體。噬菌粒載體。 結構結構pUC的質粒部分、的質粒部分、f1噬菌體噬菌體ori、Kanr和和Ampr抗性?？剐?。MCS的中部已經切開，各有一個的中部已經切開，各有一個3端突出的端突出的T。 特點特點PCR產物往往在產物往往在3端突出一個端突出一個A，所，所以能與

47、這個載體直接連接。以能與這個載體直接連接?？寺〉目寺〉腜CR產物能被兩側的產物能被兩側的EcoRI切下來回收。切下來回收。AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA四、雙鏈噬菌體載體四、雙鏈噬菌體載體 載體載體（1）長度為）長度為48502 bp；（2）雙鏈線性）雙鏈線性DNA；（3）但在兩端有）但在兩端有cos位點，可以環(huán)化。位點，可以環(huán)化。 DNA兩端各有兩端各有12bp的粘性末端，粘性末的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。位點。1. DNA分子的特點分子的特點 cos位點（位點（cohensive-end site）：）

48、： DNA進入細菌體內后，可形成雙鏈環(huán)狀進入細菌體內后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復制型（復制型（RF DNA）。）。DNA上有至少上有至少61個基因，有一半是必須的，個基因，有一半是必須的，與自身的活動有關，成簇排列。與自身的活動有關，成簇排列。其他約其他約1/3是是非必須基因（非必須基因（位于尾部合成至阻位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。遏之間的區(qū)段）。2. 噬菌體的基因組特點噬菌體的基因組特點 噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行 型復制。型復制。3. DNA的復制模型的復制模型（1） 型復制型復制（2）滾環(huán)復制）滾環(huán)復制 感染的晚期：啟動滾環(huán)復制機制。感染的晚期：啟動滾

49、環(huán)復制機制。形成多聯體形成多聯體 DAN分子。分子。這種多聯體分子必須在這種多聯體分子必須在cos位點被切斷位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。成單體分子才能被包裝起來。（1）構建原理：）構建原理：4. 噬菌體載體的構建噬菌體載體的構建（2）構建過程）構建過程在這個非必需區(qū)內制造限制酶切點在這個非必需區(qū)內制造限制酶切點引進某些突變表型，作為選擇標記引進某些突變表型，作為選擇標記突變某些基因，使它成為安全載體突變某些基因，使它成為安全載體刪除刪除 DNA必需區(qū)段上常用的限制酶切點必需區(qū)段上常用的限制酶切點 噬菌體噬菌體DNA上本身有上本身有5個個 EcoR I 和和7 個個Hind III切點！

50、切點！刪除刪除 噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。（3）人工構建的人工構建的 噬菌體載體有兩種類型：噬菌體載體有兩種類型： 插入型載體（插入型載體（insertion vectors)：如如 gt10、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、 NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位點位于載體合成活性插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)阻遏物區(qū)域域（cI基因）內?；颍﹥?。EcoR IcI gt10插入導致載體不能合成阻遏物，插入導致載體不能合成阻遏物， 載體載體DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清

51、晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。沒有外源沒有外源DNA插入的插入的 載體感染受體菌形成載體感染受體菌形成混濁噬菌斑混濁噬菌斑。如如 NM1149載體的兩個克隆位點（載體的兩個克隆位點（EcoR I 和和Hind III）都是位于）都是位于cI基因內部?；騼炔?。2） -半乳糖苷酶失活型載體：半乳糖苷酶失活型載體：在在 基因組中引入了基因組中引入了LacZ序列。（其上含序列。（其上含有一個有一個EcoR I 克隆位點）?？寺∥稽c）。感染感染LacZ突變的大腸桿菌，經突變的大腸桿菌，經IPTG的誘導，的誘導，利用利用Xgal的顯色反應的顯色反應作選擇標記。作選擇標記。LacZEcoR ICharon16

52、A 替換型載體（替換型載體（substitution vectors)兩個多克隆位點區(qū)以反向重復形式分別位兩個多克隆位點區(qū)以反向重復形式分別位于于 DNA的非必須區(qū)兩端。的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源用同樣酶切成的外源DNADNA片斷置換。片斷置換?？芍脫Q區(qū)可置換區(qū)MCSMCS如：如： EMBL4、Charon40等。等。1） EMBL4 EMBL4的可置換片斷內部所有的可置換片斷內部所有Sal I酶切酶切位點。位點。以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。左臂左臂可置換區(qū)可置換

53、區(qū)右臂右臂EcoR IBamH ISal ISal IBamH IEcoR ISal ISal I EMBL42）Charon40Charon40的可置換片斷是由的可置換片斷是由DNA短片短片重復構成，片斷之間有重復構成，片斷之間有Hae I 切點切點。在克隆的時候，可以用在克隆的時候，可以用Hae I 酶進一步將可置酶進一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。左臂左臂可置換區(qū)可置換區(qū)右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片斷中如果包含可取代片斷中如果包含LacZ，可用，可用Xgal顯色顯色作篩選標記。作篩選標記。（4） 載體的篩

54、選標記載體的篩選標記 插入型載體插入型載體根據插入所引起的表型突變。根據插入所引起的表型突變。 置換型載體置換型載體 載體克載體克隆策略隆策略置換型載體置換型載體 DNA像質粒載體那樣直接轉化細菌時效像質粒載體那樣直接轉化細菌時效率遠比質粒低。率遠比質粒低。5. 載體的體外包裝載體的體外包裝 在試管中與在試管中與 噬菌體的噬菌體的頭部頭部和和尾部尾部蛋白人蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細菌，把重組細菌，把重組DNA注入受體菌中。注入受體菌中。必須利用噬菌體外殼的作用！必須利用噬菌體外殼的作用?。?）體外包裝：）體外包裝： 的的D基因的產物也是頭部蛋白

55、，但主基因的產物也是頭部蛋白，但主要與要與 DNA 進入頭部和頭部的成熟有進入頭部和頭部的成熟有關（只占關（只占20%）。）。（2）體外包裝過程）體外包裝過程 噬菌體外殼蛋白的合成噬菌體外殼蛋白的合成E 基因基因的的E 基因編碼頭部蛋白的主要成基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的分（占頭部總蛋白的70%）。）。D基因基因重組的重組的 載體載體DNA外源的重組外源的重組 DNA載體被誘發(fā)與內源載體被誘發(fā)與內源性原性原 DNA發(fā)生重組。發(fā)生重組。（3）體外包裝存在的問題：）體外包裝存在的問題： 包裝錯誤：包裝錯誤：既能包裝用于生產頭部蛋白的既能包裝用于生產頭部蛋白的內源性原內源性原 DNA，

56、也能包裝，也能包裝重組的重組的 DNA載體載體。 重組：重組： 體外包裝的容量限制：體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的必須在正常野生型容量的75%105%（3651kb）之間。之間。比一般的質粒載體的容量大的多。比一般的質粒載體的容量大的多。（4） DNA載體的優(yōu)點載體的優(yōu)點用在真核生物基因組文庫的建立。用在真核生物基因組文庫的建立。Sau3ABamHI1978年年J. Collins和和B. Hohn等人發(fā)展出等人發(fā)展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid) DNA：46kb（1）大?。┐笮?（2）組成）組成 cos序列和控制包裝的的序列。序

57、列和控制包裝的的序列。pBR322：質粒的復制子質粒的復制子抗藥性基因抗藥性基因幾個限制性酶的單一位點幾個限制性酶的單一位點具有具有 噬菌體的特性：噬菌體的特性：（3）cosmid vector的特點的特點 克隆外源克隆外源DNA后可以后可以體外包裝體外包裝成噬菌成噬菌體顆粒。體顆粒。在寄主細胞內形成環(huán)化在寄主細胞內形成環(huán)化DNA（但不能形（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌成新的噬菌體顆粒而溶菌 ）。）。具有質粒載體的特性：具有質粒載體的特性：大多帶有大多帶有pMB1或或ColE1的復制子，的復制子，能像質粒一樣復制。能像質粒一樣復制。有抗菌素抗性基因，和插入失活的有抗菌素抗性基因，和插入失活的

58、克隆位點?？寺∥稽c。方便的選擇：方便的選擇：高容量的克隆能力高容量的克隆能力（4）部分）部分cosmid vector應用應用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組片端的真核基因組DNA技術，叫技術，叫“柯柯斯克隆斯克隆”（cosmid cloning）。）。（5）cosmid cloning 理論依據：理論依據：cos位點位點: 噬菌體的生命周期中，會產生數百個噬菌體的生命周期中，會產生數百個 DNA通過通過cos位點連接的位點連接的“多聯體多聯體”分子。分子?！岸嗦擉w多聯體”復制：復制：包裝識別。包裝識別。在包裝的時候，在包裝的時候， 噬菌體具有位點特異噬

59、菌體具有位點特異的的末端酶（末端酶（terminase）體系）體系（Ter體體系），識別系），識別cos位點，把多聯體切成單位點，把多聯體切成單個個 DNA長度。長度。兩個兩個cos位點之間，必須保持位點之間，必須保持3845kb的的DNA，Ter體系才能識別。體系才能識別。Ter體系：體系：包裝限制：包裝限制：用特定的核酸內切酶消化真核生物用特定的核酸內切酶消化真核生物DNA。（6）cosmid克隆的一般過程克隆的一般過程用同樣的內切酶消化用同樣的內切酶消化cosmid載體。載體。產物中將有一定比例的分子是兩端各產物中將有一定比例的分子是兩端各有一個有一個cos位點、長度位點、長度40kb左

60、右的真左右的真核核DNA與載體的連接物。與載體的連接物。連接連接切割切割合適長度合適長度的的DNA連接物，并包裝入連接物，并包裝入噬菌體頭部。噬菌體頭部。注入到細菌體內的注入到細菌體內的DNA分子環(huán)化，并分子環(huán)化，并按質粒的方式復制。按質粒的方式復制。感染大腸桿菌感染大腸桿菌 Ter體系識別并切割體系識別并切割載體片斷自我連接。載體片斷自我連接。外源外源DNA片斷自我連接。片斷自我連接。多個本來不在一起的外源多個本來不在一起的外源DNA片斷連接片斷連接起來同時插入載體。起來同時插入載體。（7）cosmid載體克隆的缺點載體克隆的缺點用用堿性磷酸酶堿性磷酸酶除去線性質粒片斷除去線性質粒片斷5端的