病理學(xué)常用技術(shù)的原理及應(yīng)用PPT課件

1、病理學(xué)常用技術(shù)的原病理學(xué)常用技術(shù)的原理及應(yīng)用理及應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 大體與組織病理學(xué)技術(shù)大體與組織病理學(xué)技術(shù) 大體觀察大體觀察主要運(yùn)用肉眼或輔以放大鏡、主要運(yùn)用肉眼或輔以放大鏡、量尺和磅秤等工具，對(duì)大體標(biāo)本及其病變性量尺和磅秤等工具，對(duì)大體標(biāo)本及其病變性狀進(jìn)行細(xì)致的觀察和檢測(cè)。狀進(jìn)行細(xì)致的觀察和檢測(cè)。 組織和細(xì)胞學(xué)觀察組織和細(xì)胞學(xué)觀察 將病變組織制成切片將病變組織制成切片染色，或脫落、穿刺細(xì)胞涂片染色，顯微鏡染色，或脫落、穿刺細(xì)胞涂片染色，顯微鏡觀察。觀察。第二節(jié)第二節(jié) 組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)組織化學(xué)與免疫組織化學(xué) （一）（一） 組織化學(xué)組織化學(xué) 一般稱(chēng)特殊染色，通過(guò)應(yīng)用某些組織化一般稱(chēng)特殊染色

2、，通過(guò)應(yīng)用某些組織化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，顯示病變組學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，顯示病變組織細(xì)胞的化學(xué)成分織細(xì)胞的化學(xué)成分( (如蛋白質(zhì)、酶類(lèi)、核酸、如蛋白質(zhì)、酶類(lèi)、核酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)等）糖類(lèi)、脂類(lèi)等），從而加深對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)和代從而加深對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)和代謝改變的認(rèn)識(shí)，弄清形態(tài)改變與代謝改變的謝改變的認(rèn)識(shí)，弄清形態(tài)改變與代謝改變的關(guān)系。如過(guò)碘酸關(guān)系。如過(guò)碘酸SchiffSchiff反應(yīng)（反應(yīng)（PASPAS）或區(qū)別骨或區(qū)別骨EwingEwing肉瘤和淋巴瘤，前者胞漿內(nèi)含有糖原呈肉瘤和淋巴瘤，前者胞漿內(nèi)含有糖原呈陽(yáng)性，后者陰性，磷鎢酸蘇木精染色可顯示陽(yáng)性，后者陰性，磷鎢酸蘇木精染色可顯示橫紋肌肉瘤中瘤

3、細(xì)胞胞漿中的橫紋。橫紋肌肉瘤中瘤細(xì)胞胞漿中的橫紋。（二）免疫組織化學(xué)（二）免疫組織化學(xué) 是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定位組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)的一種技術(shù)，有較高的敏感性和特異性，能將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來(lái)，直接在組織切片、細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位某些蛋白質(zhì)或多肽類(lèi)物質(zhì)，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)或激光掃描共聚顯微術(shù)等，對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析。1 1、免疫組織化學(xué)染色方法、免疫組織化學(xué)染色方法 按標(biāo)記物性質(zhì)分按標(biāo)記物性質(zhì)分：熒光法、酶法、：熒光法、酶法、免疫金、銀及鐵標(biāo)記技術(shù)等。免疫金、銀及鐵標(biāo)記技術(shù)等。 按染色步驟分按染色步驟分：直接法、間接法。：直接法、間接法。 按

4、結(jié)合方式分按結(jié)合方式分：抗原：抗原- -抗體結(jié)合法、抗體結(jié)合法、親和連接法、標(biāo)記的鏈親和素親和連接法、標(biāo)記的鏈親和素- -生物生物素法等。素法等。2 2、免疫組化染色的質(zhì)量控制和結(jié)果、免疫組化染色的質(zhì)量控制和結(jié)果 陽(yáng)性表達(dá)方式：陽(yáng)性表達(dá)方式：（1 1）胞漿陽(yáng)性）胞漿陽(yáng)性（2 2）核周胞漿陽(yáng)性）核周胞漿陽(yáng)性（3 3）胞漿局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性）胞漿局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性（4 4）細(xì)胞膜陽(yáng)性）細(xì)胞膜陽(yáng)性（5 5）細(xì)胞核陽(yáng)性）細(xì)胞核陽(yáng)性肌動(dòng)蛋肌動(dòng)蛋白白雄激素受體雄激素受體CD3-T細(xì)胞細(xì)胞雌激素受體（雌激素受體（ER）影響免疫組化染色質(zhì)量的因素：影響免疫組化染色質(zhì)量的因素： 取材及固定取材及固定 抗體質(zhì)量抗體質(zhì)量

5、抗原封閉和修復(fù)抗原封閉和修復(fù) 技術(shù)操作技術(shù)操作3 3、免疫組化的應(yīng)用、免疫組化的應(yīng)用 大量商品化的單克隆和多克隆抗體出現(xiàn)、配套試劑盒的使用及方法學(xué)的不斷完善，使免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和病理外檢中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一。 免疫組化技術(shù)可用于各種蛋白質(zhì)或肽類(lèi)物質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)、細(xì)胞屬性的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究，激素受體和耐藥基因蛋白表達(dá)檢測(cè)，以及細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究等。 免疫組織化學(xué)染色技術(shù)也是非放射性原位雜交、原位PCR和原位末端標(biāo)記DNA片段等技術(shù)的基礎(chǔ)。第三節(jié)第三節(jié) 電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù) 透射電子顯微鏡是最早、最廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一

6、種電鏡，以后又相繼誕生了掃描電鏡、超高壓電鏡等。電鏡的使用大大地開(kāi)闊了我們的視野，看清了細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)的各種細(xì)胞器和細(xì)胞核的細(xì)微結(jié)構(gòu)及其病理變化，并由此產(chǎn)生了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理學(xué)，又稱(chēng)超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)。電鏡技術(shù)的應(yīng)用 在生命科學(xué)領(lǐng)域可用于胚胎及組織發(fā)生學(xué)方面的研究和觀察；在臨床上可用于多種疾病亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)病變的觀察和診斷，特別是腎小球疾病及肌病的診斷，以及一些疑難腫瘤的組織來(lái)源和細(xì)胞屬性判定，如一些去分化、低分化或多向分化腫瘤的診斷和鑒別診斷；最早關(guān)于細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)描述也是源于電鏡的觀察。 隨著電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，以及與其他方法的綜合使用，還出現(xiàn)了免疫電鏡、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡圖像分析技術(shù)及全息

7、顯微術(shù)等。 電鏡技術(shù)也有其局限性，如電鏡設(shè)備昂貴、樣本制備較復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較高；另外，由于樣本取材少，觀察范圍有限，有時(shí)還可能會(huì)遺漏信息；當(dāng)用于輔助腫瘤外檢診斷時(shí)，只能判定組織或細(xì)胞的來(lái)源，不能確定腫瘤的良惡性。第四節(jié)原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)第四節(jié)原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) 原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)的一部分，是在體外經(jīng)酶促反應(yīng)將某一特定DNA序列進(jìn)行高效、快速擴(kuò)增，它可將單一拷貝或低拷貝的待測(cè)核酸以指數(shù)的形式擴(kuò)增而達(dá)到常規(guī)方法可檢測(cè)的水平。原位PCR(in situ PCR)技術(shù)是將PCR的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞及組織

8、學(xué)定位相結(jié)合，在冷凍或石蠟包埋組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上來(lái)檢測(cè)和定位核酸的技術(shù)。原位原位PCRPCR技術(shù)方法技術(shù)方法 原位PCR技術(shù)有直接法原位PCR、間接法原位PCR、原位反轉(zhuǎn)錄PCR和原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)等方法，其中應(yīng)用相對(duì)較廣泛的是間接原位PCR方法。 主要程序有組織固定、預(yù)處理(如蛋白酶K和RNA酶消化)、原位擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的原位雜交和檢測(cè)等。由于使用原位雜交技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物作檢測(cè)，使該方法的特異性較直接法高。原位原位PCRPCR技術(shù)的應(yīng)用及存在的問(wèn)題技術(shù)的應(yīng)用及存在的問(wèn)題 應(yīng)用：原位PCR技術(shù)能用于低拷貝的內(nèi)源性基因的檢測(cè)和定位，可用于基因突變、基因重排和染色體易位等的研究和

9、觀察；還可用于外源性基因的檢測(cè)和定位，如對(duì)各種感染性疾病病原的基因檢測(cè)，如EB病毒、人乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒和人免疫缺陷病毒基因組及結(jié)核、麻風(fēng)桿菌基因的檢測(cè)等；在臨床上還可用于對(duì)接受了基因治療患者體內(nèi)導(dǎo)人基因的檢測(cè)等。存在的問(wèn)題：存在的問(wèn)題： 特異性不高，特別是假陽(yáng)性的問(wèn)題。產(chǎn)生的原因有引物與模板的錯(cuò)配、在擴(kuò)增中因細(xì)胞內(nèi)受損傷DNA的修復(fù)而形成的非特異性序列和特異性擴(kuò)增序列的彌散等。 技術(shù)操作復(fù)雜，影響因素太多。 需要特殊的設(shè)備，即原位PCR儀，價(jià)格昂貴。第五節(jié)核酸原位雜交第五節(jié)核酸原位雜交 原位雜交是核酸分子雜交的一部分，是原位雜交是核酸分子雜交的一部分，是將組織化學(xué)與分子生物學(xué)

10、技術(shù)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)將組織化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)和定位核酸的技術(shù)。用標(biāo)記了的已知序列的和定位核酸的技術(shù)。用標(biāo)記了的已知序列的核苷酸片段作為探針核苷酸片段作為探針，通過(guò)雜交直接在組織通過(guò)雜交直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上檢測(cè)和定切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上檢測(cè)和定位某一特定的靶位某一特定的靶DNADNA或或RNARNA的存在。其生物的存在。其生物化學(xué)基礎(chǔ)是化學(xué)基礎(chǔ)是DNADNA變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對(duì)變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。根據(jù)所選用的探針和待檢靶序列的不結(jié)合。根據(jù)所選用的探針和待檢靶序列的不同，有同，有DNA-DNADNA-DNA雜交、雜交、DNA-RNADNA-RNA

11、雜交和雜交和RNA-RNARNA-RNA雜交。雜交。 探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記 用于原位雜交的探針有雙鏈cDNA探針、單鏈cDNA探針、單鏈cRNA探針和合成的寡核苷酸探針等。 探針的長(zhǎng)度以50-300個(gè)堿基為宜，用于染色體原位雜交的探針可為1.21.5kb。探針標(biāo)記物有放射性同位素如3H、35S、32p等，這類(lèi)探針的敏感性高；非放射性探針標(biāo)記物有熒光素、地高辛和生物素等，其敏感性不如放射性標(biāo)記探針，但有性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、成本低和耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。原位雜交的主要程序原位雜交的主要程序 實(shí)驗(yàn)材料：常規(guī)石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、細(xì)胞涂片和培養(yǎng)細(xì)胞爬片等。 主要程序：包括雜交前準(zhǔn)備、預(yù)處

12、理、雜交、雜交后處理-清洗和雜交體的檢測(cè)等。 應(yīng)注意的問(wèn)題：DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交，需滅活RNA酶處理；使用雙鏈cDNA探針和/或待測(cè)靶序列是DNA時(shí)，需進(jìn)行變性處理使DNA解鏈；雜交溫度應(yīng)低于雜交體的解鏈溫度(Tm)25度左右；對(duì)照實(shí)驗(yàn)：有組織對(duì)照、探針對(duì)照、雜交反應(yīng)體系對(duì)照和檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照等，根據(jù)具體情況選用。 熒光原位雜交熒光原位雜交 可以用直接法或間接法進(jìn)行，直接法以熒光素直接標(biāo)記已知DNA探針，間接法以非熒光標(biāo)記物標(biāo)記已知DNA探針，再橋連一個(gè)熒光標(biāo)記的抗體。 本法是一種DNA-DNA雜交，實(shí)驗(yàn)材料可以是間期細(xì)胞、分裂中期的染色體，也可以是冰凍或石蠟切片等。探針有不同

13、的類(lèi)型，如重復(fù)序列探針、位點(diǎn)特異性探針和全染色體探針等，目前已有大量商品化的熒光標(biāo)記探針。 原位雜交技術(shù)的應(yīng)用原位雜交技術(shù)的應(yīng)用 原位雜交可應(yīng)用于：原位雜交可應(yīng)用于：細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位可用于基因圖譜、基因表達(dá)和基因組進(jìn)化的研究；感染組織中病毒DNARNA的檢測(cè)和定位；癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化的檢測(cè)；基因在染色體上的定位；檢測(cè)染色體的變化，如染色體數(shù)量異常和染色體易位等；分裂間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學(xué)劑量測(cè)定等。第六節(jié)第六節(jié) 顯微切割術(shù)顯微切割術(shù) 顯微切割術(shù)是90年代初發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，

14、能夠從組織切片或細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個(gè)、幾十個(gè)同類(lèi)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞，再進(jìn)行有關(guān)的分子生物學(xué)方面的研究，如PCR，PCR-SSCP及比較基因組雜交等。 材料：材料：冰凍或石蠟包埋組織切片或細(xì)胞涂片。切片的厚度為4-10um，冰凍切片需經(jīng)甲醛或乙醇固定。用于顯微切割的組織切片必須染色，以便于進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞群或單一細(xì)胞的定位。操作方法：有手工操作法和激光顯微切割法。激光捕獲顯微切割技術(shù)的基本原理是：將組織切片放在倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，激光束從切片的上方垂直照射下來(lái)，落在要切割的區(qū)域。該區(qū)的乙烯乙酸乙烯酯膜受激光照射后，瞬間溫度升高并與其下方的細(xì)胞相粘連；當(dāng)將膜揭起來(lái)時(shí)，與之相連的細(xì)胞也隨

15、之被完好地從切片上切割下來(lái)；將帶有細(xì)胞的膜放入試管內(nèi)經(jīng)蛋白酶消化使細(xì)胞與膜分開(kāi)，同時(shí)也將細(xì)胞裂解，獲得待提物質(zhì)，如DNA、RNA或蛋白質(zhì)等。 意義：意義：可從構(gòu)成復(fù)雜的組織中獲得某一特定的同類(lèi)細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞，適用于腫瘤的分子生物學(xué)研究，如腫瘤的克隆性分析、腫瘤發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程中各階段細(xì)胞基因改變的比較研究和腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些酶活性的定量檢測(cè)等。不足之處是技術(shù)難度大；需特殊的設(shè)備，激光器造價(jià)高。第七節(jié) 生物芯片技術(shù) (一)基因芯片 基因芯片又稱(chēng)DNA芯片(DNA chip)，是指固著在固相載體上的高密度的DNA微點(diǎn)陣。就是將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龍膜等

16、載體上，這就是基因芯片。一套完整的基因芯片分析系統(tǒng)包括芯片陣列儀、激光掃描儀、計(jì)算機(jī)及生物信息軟件處理系統(tǒng)等?；蛐酒姆诸?lèi)和工作原理基因芯片的分類(lèi)和工作原理 按基因芯片的功能分：表達(dá)譜基因芯片、診斷芯片和檢測(cè)芯片，前者主要用于基因功能的研究；后兩者可用于遺傳病、代謝病和某些腫瘤的診斷或病原微生物的檢測(cè)等。 表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)的基本原理：用不同的熒光染料通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將不同組織的mRNA分別標(biāo)記制成探針，將探針混合后與芯片上的DNA片段進(jìn)行雜交、洗滌，用特有的熒光波長(zhǎng)掃描芯片，得到這些基因在不同組織或細(xì)胞中的表達(dá)譜圖片，再通過(guò)計(jì)算機(jī)分析出這些基因在不同組織中表達(dá)差異的重要信息?；蛐酒膽?yīng)用：

17、基因芯片的應(yīng)用： 基礎(chǔ)研究方面有基因表達(dá)譜分析、基因分型、基因突變的檢測(cè)、新基因的尋找、遺傳作圖和重測(cè)序等；臨床上可用于抗生素和抗腫瘤藥物的篩選和疾病的診斷等方面。 利用基因芯片可以大規(guī)模、高通量地對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行研究，從而解決了傳統(tǒng)的核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少和檢測(cè)效率低等問(wèn)題。 實(shí)驗(yàn)材料是從新鮮組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取的mRNA，對(duì)外周血或培養(yǎng)細(xì)胞樣本的研究相對(duì)容易，對(duì)實(shí)體瘤的研究受到限制。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片是繼基因芯片之后發(fā)展起來(lái)的對(duì)基因功能產(chǎn)物表達(dá)水平檢測(cè)的技術(shù)。也是在一個(gè)載體上點(diǎn)布高密度不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)，再用熒光標(biāo)記的已知抗體或配體與待測(cè)樣本中的抗體或配體一起同芯片上蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，在掃描儀上讀出熒光強(qiáng)弱，再經(jīng)計(jì)算機(jī)分析計(jì)算出待測(cè)樣本結(jié)果。 檢測(cè)容量已達(dá)一萬(wàn)三千多個(gè)點(diǎn)，并實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過(guò)程全自動(dòng)化檢測(cè)，具有高效率、低成本的特點(diǎn)，尤其適合于蛋白表達(dá)的大規(guī)模、多種類(lèi)篩查，并能用于受體配體、多種感染因素的篩查和腫瘤