蛋白質(zhì)組海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析及其在人類基因組注釋中的應(yīng)用

1、精品文檔項目名稱：蛋白質(zhì)組海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析及其在人類基因組注釋中的應(yīng)用首席科學(xué)家：劉斯奇中國科學(xué)院北京基因組研究所起止年限：2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門：中國科學(xué)院。1歡迎下載精品文檔一、研究內(nèi)容關(guān)鍵科學(xué)問題本項目將以我國蛋白質(zhì)組學(xué)界產(chǎn)生的海量 MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基本分析材料，重點放在解析這些數(shù)據(jù)中的新的蛋白質(zhì)編碼基因和蛋白質(zhì)組定量信息。 我們將運用計算化學(xué)、 工程方法學(xué)、 生物信息學(xué)、 質(zhì)譜學(xué)和生物分析化學(xué)等研究手段深入探討如何準(zhǔn)確地將 MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為相對應(yīng)的肽段信息， 如何利用這些肽段補充和修訂基因組的蛋白質(zhì)編碼基因， 如何發(fā)掘這些肽段所賦予的定量信息，

2、 并建立兼有定性和定量信息的新型蛋白質(zhì)表達譜。 簡言之，本項目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是， 如何發(fā)掘高精度 MS/MS質(zhì)譜鑒定的肽段中所蘊含的大量生物學(xué)信息。主要研究內(nèi)容1. 海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的深度解析技術(shù)研究從高精度 MS/MS數(shù)據(jù)出發(fā)，通過新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索引擎技術(shù)、 De Novo 技術(shù)、基因組數(shù)據(jù)庫搜索技術(shù)三個途徑來實現(xiàn)海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的深度解析， 具體研究：? 通過嚴(yán)格的對照實驗確定質(zhì)譜數(shù)據(jù)可解析率， 優(yōu)化和規(guī)范實驗操作流程；? 研究新一代蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎，提高鑒定可信度、靈敏度和速度；?綜合利用實驗、儀器和計算手段發(fā)展肽序列De Novo 分析技術(shù)；? 利用基因組數(shù)據(jù)庫搜索進一步提高質(zhì)譜

3、數(shù)據(jù)解析率。2高精度 MS/MS數(shù)據(jù)對基因組蛋白質(zhì)編碼基因的補充和修訂采用 De Novo 方法獨立演繹所測定肽段的氨基酸順序，進一步反轉(zhuǎn)肽段信息至基因組，試圖補充和修訂基因組的蛋白質(zhì)編碼基因，具體研究：? 構(gòu)建綜合性蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；? 建立基于肽段信息注釋基因組的方法流程；? 利用 MS/MS所鑒定的肽段補充和修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因。3 基于高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)表達譜定量計算方法的研究及應(yīng)用以鑒定的肽段頻率為基礎(chǔ)，發(fā)展兼顧準(zhǔn)確度與規(guī)模化的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)學(xué)方法，同時開發(fā)以多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)編碼基因的可視化標(biāo)識技術(shù)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達譜的定量化，具體研究：。2歡迎下載精品文檔? 蛋白

4、質(zhì)表達譜定量算法研究；? 蛋白質(zhì)組表達譜定量分析及可視化研究；? 建立以基因為中心的定量蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及分析平臺。4 基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)測結(jié)論的實驗驗證研究運用質(zhì)譜 學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等手段系統(tǒng)驗證基于 MS/MS 數(shù)據(jù)所分析的生物信息學(xué)結(jié)論， 同時為生物信息學(xué)的理論模型提供嚴(yán)格設(shè)計和控制的實驗數(shù)據(jù)，具體研究：? 建立先進的 MRM技術(shù)平臺實現(xiàn)對蛋白質(zhì)定性和定量的高通量驗證，發(fā)現(xiàn)和驗證新的蛋白編碼基因，并提供相應(yīng)的定量蛋白質(zhì)組信息；? 利用先進的質(zhì)譜技術(shù)平臺獲取高精度 MS/MS數(shù)據(jù)服務(wù)于質(zhì)譜譜圖的深度解析；? 建立通用技術(shù)平臺從核酸和蛋白質(zhì)水平上驗證通過 MS/MS所鑒定的新基因；

5、? 建立通用技術(shù)平臺從不同技術(shù)角度上驗證定量蛋白質(zhì)組。3歡迎下載精品文檔二、預(yù)期目標(biāo)1總體目標(biāo)本項目研究的總體目標(biāo)是， 發(fā)掘 MS/MS數(shù)據(jù)中的肽段信息， 開拓生物信息學(xué)在質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析中的研究領(lǐng)域， 促進高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用。本項目將通過高精度 MS/MS數(shù)據(jù)和 De Novo 方法獲取一系列與基因組注釋基因不相匹配的肽段， 并利用這些信息補充和修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因； 將采用肽段頻率為定量蛋白質(zhì)組計算的基本數(shù)據(jù)， 通過蛋白質(zhì)定量參數(shù)、 數(shù)學(xué)模型和可視化標(biāo)示等技術(shù)來建立定量蛋白質(zhì)表達譜， 并闡明其生物學(xué)意義。 通過本項目的執(zhí)行，我們將顯著提高 MS/MS數(shù)據(jù)的利用率，具

6、體回答若干相關(guān)的生物學(xué)問題，拓展生物信息學(xué)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的思路和方法。 因此，本項目將促進我國在蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)交叉領(lǐng)域的研究。2五年目標(biāo)1）發(fā)展一套針對高精度MS/MS數(shù)據(jù)的分析策略以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫和計算方法；2）顯著提高海量 MS/MS數(shù)據(jù)的利用率，深入揭示高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)所蘊含的物理化學(xué)和生物學(xué)意義；3）提升我國在質(zhì)譜信號解析和蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)研究方面的水平。4）在國際主流雜志發(fā)表論文30 篇左右，并爭取 Nature 及其它國際知名科學(xué)期刊發(fā)表 10 篇論文。申請發(fā)明專利5 10 項。5）造就一支生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)組領(lǐng)域中的高水平的科研隊伍，培養(yǎng)一批博士研究生 (10

7、-15 人 ) ，碩士研究生 (20-25 人) ，博士后研究人員 (5 10 人 ) 。4歡迎下載精品文檔三、研究方案1. 總體學(xué)術(shù)思路在蛋白質(zhì)組學(xué)誕生的短短幾年內(nèi)， 這個學(xué)科已經(jīng)取得了重大進展： 蛋白質(zhì)表達譜的建立，修飾蛋白質(zhì)的測定，和蛋白質(zhì)相互作用的分析等。但是，作為一門年輕的學(xué)科，蛋白質(zhì)組的分析技術(shù)還遠未成熟。 其中一個主要的原因是人們在蛋白質(zhì)鑒定和定量分析上仍遭遇較大的技術(shù)困難。 近年來，高精度質(zhì)譜儀的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展創(chuàng)造了一個新的發(fā)展契機。 如何深入解析高精度 MS/MS數(shù)據(jù)所蘊含的豐富的生物學(xué)信息， 是擺在蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)面前的重要課題。 本項目立足于我國蛋白質(zhì)組學(xué)界已產(chǎn)生

8、的海量 MS/MS數(shù)據(jù)，運用一系列的計算化學(xué)和生物信息學(xué)的方法，試圖發(fā)展一套針對高精度 MS/MS數(shù)據(jù)的分析策略以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫和計算方法；并以此為基礎(chǔ)集中解決兩個在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)亟需解決的問題，即利用肽段信息補充和修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因和以肽段頻率為基礎(chǔ)計算定量蛋白質(zhì)表達譜。 本研究項目需要生物信息學(xué)、 蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)各交叉學(xué)科團隊的通力合作，而她產(chǎn)生的科研成果又將施惠于各個研究領(lǐng)域。2. 技術(shù)途徑本項目的技術(shù)途徑包括海量 MS/MS數(shù)據(jù)的產(chǎn)生、生物信息軟件的設(shè)計和應(yīng)用、以及實驗驗證等 3 個層面的多種途徑。1） 海量 MS/MS數(shù)據(jù)的產(chǎn)生技術(shù) ：LTQ、Orbitrap 、

9、FTMS 質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組測定中的應(yīng)用， 多維高效液相層析， 高效蛋白質(zhì)提取技術(shù)平臺，SDS-PAGE/LC串聯(lián)分析技術(shù)，多重蛋白質(zhì)酶消化技術(shù)等。2 ） 生物信息軟件的設(shè)計和應(yīng)用技術(shù) ：樣品處理和儀器操作流程控制，MS/MS譜圖的計算機識別，蛋白質(zhì)搜索引擎，De Novo 分析軟件，各種數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建技術(shù)等。3） 實驗驗證技術(shù) ：MRM技術(shù)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量技術(shù)，化學(xué)修飾輔助蛋白質(zhì)末端序列測定技術(shù) , ELISA ，Western blot，基因克隆，重組蛋白質(zhì)制備技術(shù)，單克隆抗體制備， Real-Time PCR，5-RACE等。本項目研究已具備了較好的技術(shù)平臺支撐，承擔(dān)單位擁有 2 個國家重

10、點實驗室， 3 個部級重點實驗室，項目所需的絕大部分實驗儀器和實驗手段均已具備，各承擔(dān)單位間有著長期的良好合作關(guān)系和基礎(chǔ)。本項目具有豐富的前期工作積累。5歡迎下載精品文檔與相關(guān)研究成果及多學(xué)科背景的研究隊伍，已經(jīng)建立起成熟的研究手段和方法，有能力完成所計劃的研究任務(wù)。3. 創(chuàng)新性和特色本項目的創(chuàng)新之處集中表現(xiàn)在： 一整套針對于高精度 MS/MS數(shù)據(jù)的分析策略以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫和計算方法； 利用 MS/MS和 DeNovo 技術(shù)補充或修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因；建立兼有定性和定量數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)表達譜；和 Gene-centric 方法標(biāo)示組織或細胞蛋白質(zhì)表達譜。本項目的特色在于：問題明確、方法新穎、課

11、題間環(huán)環(huán)相扣。 我們立足于建立高精度串連質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的分析策略、 數(shù)據(jù)庫和算法，著眼于這些研究成果在具體生物學(xué)問題上的應(yīng)用， 結(jié)論于實驗科學(xué)對理論分析結(jié)果的嚴(yán)格驗證。同時，我們將最大程度地發(fā)揮 “集體效應(yīng) ”優(yōu)勢，整合我國在生物信息學(xué)、 蛋白質(zhì)學(xué)和基因組學(xué)優(yōu)秀團隊， 根據(jù)各團隊的專長來展開相關(guān)研究。4. 取得重大突破的可行性分析本項目瞄準(zhǔn)了當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點和重點，試圖揭示高精度MS/MS數(shù)據(jù)所蘊含的豐富的生物學(xué)信號。 在項目執(zhí)行過程中， 我們有信心在 MS/MS數(shù)據(jù)的有效利用率、 肽段信息對基因組蛋白質(zhì)編碼基因的補充和修訂、 質(zhì)譜譜圖在定量蛋白質(zhì)組中應(yīng)用、 定量蛋白質(zhì)組的圖形標(biāo)示技術(shù)等

12、方面取得突破。 我們的信心植根于： 1) 本項目計劃解決的幾個問題在國際間仍然懸而未決，我們和其他的競爭者正處在同一起跑線上； 2）參與本項目的各個團隊在相關(guān)的領(lǐng)域處在先進水平，某些課題已取得了進展； 3）在我國政府的支持下，在過去幾年中我國蛋白質(zhì)學(xué)界已積累了海量的 MS/MS數(shù)據(jù)，無論在數(shù)據(jù)的質(zhì)量還是數(shù)量上，我國的MS/MS數(shù)據(jù)庫領(lǐng)先于其他國家； 4）參與的團隊與國際優(yōu)秀的蛋白質(zhì)組學(xué)家形成了較好的合作關(guān)系，尤其在 MS/MS數(shù)據(jù)的共同開發(fā)上已取得重大進展。同時，項目首席科學(xué)家和課題組長在科研項目的組織和協(xié)調(diào)方面具有豐富的經(jīng)驗，均承擔(dān)完成多項國內(nèi)或國外的重要科研項目。 本項目計劃是基于研究團隊

13、的研究基礎(chǔ)和前期工作而提出的， 在本項目的申報過程中， 項目專家組及研究骨干多次研討，圍繞本研究計劃擬解決的重大科技問題， 制定了合理可行的研究方案和技術(shù)路線。 相信通過學(xué)科交叉、 集成多種研究方法， 我們研究團隊完全有可能在本領(lǐng)域取得突破性進展。6歡迎下載精品文檔5. 課題設(shè)置課題設(shè)置思路本項目擬在高精度MS/MS數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，采用各種數(shù)據(jù)分析手段， 從基因組蛋白質(zhì)編碼基因和蛋白質(zhì)組定量兩個生物學(xué)問題著手，深入地了解和認(rèn)識MS/MS數(shù)據(jù)所蘊含的肽段信息的生物學(xué)意義，為蛋白質(zhì)組的功能性研究提供新的方法和思路。本項目將設(shè)置四個課題， 分別為， 1）海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的深度解析技術(shù)研究； 2）高精度 MS

14、/MS數(shù)據(jù)對基因組蛋白質(zhì)編碼基因的補充和修訂； 3）基于高精度 MS/MS 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)表達譜定量計算方法的研究及應(yīng)用； 4）基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)測結(jié)論的實驗驗證研究。 建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計數(shù)學(xué)模型分析有賴于實驗數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性。目前的質(zhì)譜數(shù)據(jù)廣泛存在兩個基本問題，一是缺乏不同的質(zhì)譜儀所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖譜的共享標(biāo)準(zhǔn)， 二是譜圖解讀和肽段判斷的標(biāo)準(zhǔn)沒有達到共識。因此，我們把質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化放在本項目頭等重要的位置。在深度解析MS/MS數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，我們設(shè)定兩個課題組具體研究如何發(fā)掘MS/MS信號所蘊含的生物信息，即補充和修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因及定量表達蛋白質(zhì)組。前者注重于剖析 MS/MS數(shù)據(jù)，

15、通過 De Novo 方法直接分析與數(shù)據(jù)庫搜索獲得 MS/MS所含有的肽段序列信息，然后建立 MS/MS對應(yīng)的肽段數(shù)據(jù)庫， 并以此數(shù)據(jù)庫為基點開展基因組的相關(guān)研究；后者則集中于研究 MS/MS所產(chǎn)生的肽段頻率與蛋白質(zhì)豐度之間的相關(guān)性，試圖建立基于非標(biāo)記性肽段頻率的蛋白質(zhì)定量判據(jù)， 并應(yīng)用于估算蛋白質(zhì)定量表達譜，同時還要開發(fā)具備定性和定量信息的蛋白質(zhì)表達譜的可視化標(biāo)示方法。本項目聚焦于如何運用生物信息學(xué)方法處理高精度 MS/MS數(shù)據(jù)，抽象和演繹出蛋白質(zhì)組相關(guān)的生物學(xué)信息。 與傳統(tǒng)的生物信息學(xué)研究項目不同的是， 我們還充分意識到，生物信息學(xué)的理論分析離不開對蛋白質(zhì)或肽段化學(xué)性質(zhì)的知識水平和實驗數(shù)據(jù)

16、的支持， 為此設(shè)定了第四課題組， 專職與生物信息課題相配合， 對理論預(yù)測的結(jié)果進行實驗驗證， 同時也通過方法學(xué)的探索為生物信息理論分析提供具有針對性的實驗數(shù)據(jù)，特別是高精度的 MS/MS數(shù)據(jù)。課題的關(guān)聯(lián)本項目的四個課題中，一個課題注重 MS/MS數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化分析，為蛋白質(zhì)生物信息學(xué)研究提供可靠的肽段信息和計算工具； 兩個課題集中于肽段信息在具。7歡迎下載精品文檔體生物學(xué)問題中應(yīng)用研究； 另一個課題則從實驗技術(shù)層面上對生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果進行系統(tǒng)的驗證， 并為理論分析提供和補充相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)。 本項目的各個課題之間既存在學(xué)術(shù)邏輯上必然聯(lián)系， 又有研究內(nèi)容上的互為補充， 還有研究成果的相互驗證。這

17、樣如圖一所示，四個課題之間形成了較為完整的研究關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，在不同的層次和角度上共同發(fā)掘高精度 MS/MS數(shù)據(jù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用以及它們的生物學(xué)意義。圖一：課題設(shè)置及各子課題之間的相關(guān)性課題 1.海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的深度解析技術(shù)研究課題背景海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析是蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)，而自動化的數(shù)據(jù)分析軟件是海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析的基本工具。 蛋白質(zhì)組過去十年的研究歷程，主要依靠蛋白質(zhì)鑒定兩大商業(yè)軟件Mascot 和 SEQUEST來實現(xiàn)海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的基本解析，其最大的。8歡迎下載精品文檔問題在于：僅僅有 10%左右的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以得到肽鑒定結(jié)果， 其余數(shù)據(jù)無法解析，因而其中所蘊涵的信息無法利用。造成這種局面的原因

18、是多方面的。 首先，對于分子生物學(xué)的規(guī)律， 比如基因水平上的基因預(yù)測、 基因突變、可變剪接及蛋白質(zhì)水平上的氨基酸突變、 翻譯后修飾等，目前還沒有完整、準(zhǔn)確的認(rèn)識。其次，對于包括樣品制備和質(zhì)譜儀操作在內(nèi)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)生成過程的設(shè)計和規(guī)范化控制缺乏系統(tǒng)的研究， 加上質(zhì)譜儀的分辨率和準(zhǔn)確度不足， 造成原始數(shù)據(jù)質(zhì)量不高。 再次，數(shù)據(jù)分析方法和軟件發(fā)展滯后，表現(xiàn)在兩大商業(yè)軟件核心鑒定算法多年來沒有大的改進， 鑒定可信度評價方法沒有達到共識和規(guī)范化， 鑒定靈敏度研究長期缺乏關(guān)注， 而鑒定速度不夠高則直接限制了對于海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的全面探索性分析， 比如非特異酶切、 可變翻譯后修飾的鑒定。近年來，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，

19、高精度質(zhì)譜儀 ( 如 FTMS、Orbitrap) ，配以基于電子的離子裂解新方式 ( 如電子捕獲裂解 ECD、電子轉(zhuǎn)運裂解 ETD)，已經(jīng)開始在國內(nèi)外和本項目申請單位安裝和應(yīng)用，因此質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量近期將會大大提高。同時，由于認(rèn)識到基于數(shù)據(jù)庫搜索的質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析與蛋白質(zhì)鑒定本質(zhì)上是一種特殊的信息檢索，而信息檢索領(lǐng)域的搜索引擎技術(shù)經(jīng)過了十多年的成功發(fā)展， 因此，海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的專用搜索引擎設(shè)計可以從中獲得充分的借鑒， 數(shù)據(jù)分析的速度和質(zhì)量有望大大提高。 本項目申請單位在過去幾年中參加過人類肝臟蛋白質(zhì)組表達譜的完整實驗和數(shù)據(jù)分析，對于海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析積累了比較豐富的一手經(jīng)驗，而獨立自主開發(fā)蛋白質(zhì)鑒定軟

20、件系統(tǒng) pFind 則為進一步設(shè)計新的搜索引擎奠定了基礎(chǔ)。這都為深度解析海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供了希望。深度解析海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)， 首先要在嚴(yán)格對照實驗的條件下認(rèn)識質(zhì)譜數(shù)據(jù)的規(guī)律，特別是質(zhì)譜數(shù)據(jù)有多大比例可以解析， 有多大比例可以得到可信的肽鑒定結(jié)果，在這個基礎(chǔ)上設(shè)計新一代搜索引擎并確立合理的解析率指標(biāo)。 新一代搜索引擎的設(shè)計，立足于在現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上充分解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)， 從而把現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中沒有包含的新肽段的鑒定限定在未鑒定的質(zhì)譜數(shù)據(jù)上， 這是對基因組注釋最可能有意義的地方。 新肽段的鑒定分為兩種途徑， 一是不依賴蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，直接從串聯(lián)質(zhì)譜圖中提取肽段完整序列或者序列片段， 即所謂的 De

21、Novo 技術(shù)；二是將搜索數(shù)據(jù)庫的范圍從蛋白質(zhì)組擴展到基因組， 獲得更多的肽段序列。9歡迎下載精品文檔來達到鑒定更多質(zhì)譜數(shù)據(jù)的目的。通過新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索引擎技術(shù)、DeNovo 技術(shù)、基因組數(shù)據(jù)庫搜索技術(shù)三個途徑來實現(xiàn)海量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的深度解析，提高解析率，并進一步利用控制實驗來驗證。研究目標(biāo)本課題的研究目標(biāo)是發(fā)展海量 MS/MS數(shù)據(jù)的深度解析技術(shù)， 顯著提高數(shù)據(jù)解析率。具體分為四點：一） 通過嚴(yán)格的對照實驗確定質(zhì)譜數(shù)據(jù)可解析率，優(yōu)化和規(guī)范實驗操作流程；二）研究新一代蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎，提高鑒定可信度、靈敏度和速度；三）綜合利用實驗、儀器和計算手段發(fā)展肽序列De Novo 分析技術(shù)；四）利用基

22、因組數(shù)據(jù)庫搜索進一步提高質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析率。研究內(nèi)容一）通過嚴(yán)格的對照實驗確定質(zhì)譜數(shù)據(jù)可解析率，優(yōu)化和規(guī)范實驗操作流程MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)的鑒定成功率約為5%-15%，無鑒定結(jié)果的MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)中可能蘊含著許多蛋白質(zhì)或肽段信息，如基因組數(shù)據(jù)庫中不存在的新蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)剪切體，或可能存在的錯誤的注釋信息等。所以，確定無鑒定結(jié)果的MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)的產(chǎn)生原因并發(fā)掘其隱含信息極其必要和迫切。 此外，在蛋白質(zhì)表達譜中所普遍采用的 Shotgun 路線中，蛋白質(zhì)鑒定覆蓋率往往很低， 其原因也需要探索。計劃以高純度標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為樣本， 在優(yōu)化和規(guī)范化實驗操作流程的基礎(chǔ)上，獲取蛋白酶切肽段 MS/MS數(shù)據(jù)，明確

23、每一張串聯(lián)質(zhì)譜圖歸屬， 分析圖譜鑒定或未鑒定原因。合成若干類， 每類若干條具有代表性理化性質(zhì)肽段， 分析其單獨質(zhì)譜行為和在復(fù)雜體系中的質(zhì)譜行為和鑒定成功率， 找出未鑒定原因， 為發(fā)展新的數(shù)據(jù)分析算法 / 軟件和檢索工具提供依據(jù)。同時研究實驗設(shè)計、樣品處理和儀器操作流程對于質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量及其解析的影響，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化和規(guī)范實驗操作流程。更具體地，計劃選取高純度標(biāo)注蛋白質(zhì)若干種作為初步研究分析對象。其中蛋白選取將主要考慮蛋白分子量、酶切肽段理化性質(zhì)等因素。采用Shotgun策略，首先分別對單個蛋白進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，并將全部串聯(lián)圖譜進行多搜索引。10歡迎下載精品文檔擎檢索和手工平行分析， 以確定全部圖

24、譜的身份和發(fā)現(xiàn)方法及其比例。 目前考慮到可能的原因包括：非肽段信號、未知修飾、碎片信息過差、非規(guī)則酶切肽段、混合碎片、非數(shù)據(jù)庫包含序列、檢索算法問題、未知因素等。在整合產(chǎn)生這些結(jié)果原因的基礎(chǔ)上初步設(shè)計相應(yīng)檢索分析軟件。之后將標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合， 用于檢驗分析效果，并進行調(diào)整。進一步選取簡單模式生物標(biāo)本，如 E.Coli 、Yeast 等，采用軟件自動分析結(jié)合手工分析， 完成全部串聯(lián)圖譜身份分析， 并再次調(diào)整分析策略和軟件。二）研究新一代蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎,提高鑒定可信度、靈敏度和速度基于蛋白質(zhì)序列庫搜索的蛋白質(zhì)鑒定軟件，本質(zhì)上是一個信息檢索系統(tǒng)，其核心是搜索引擎。 現(xiàn)有的蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎， 在質(zhì)譜

25、數(shù)據(jù)分析上面臨著很多挑戰(zhàn)和困難，比如質(zhì)譜圖解析率低、 鑒定結(jié)果可信度低、 數(shù)據(jù)庫搜索速度慢， 等。除了由于我們對肽段離子碎裂和串聯(lián)質(zhì)譜圖生成機制的認(rèn)識有限之外， 很重要的原因在于，目前廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎沒有及時集成新方法和新技術(shù)，從預(yù)處理到打分排序和可信度評價都普遍存在缺陷，比如沒有深入挖掘肽 - 譜匹配的特征，沒有利用機器學(xué)習(xí)和搜索引擎的新技術(shù)。 為此，我們將開展如下方面的研究。1) 提高蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎的可信度通過對數(shù)據(jù)進行深入的分析， 考察隨機匹配產(chǎn)生的原因， 在此基礎(chǔ)上提取特征，對隨機匹配的搜庫結(jié)果進行分類處理， 建立理論性比較強的模型； 整合搜索引擎提供的多個匹配打分參數(shù)

26、， 建立適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型， 為每個非冗余鑒定肽段賦予一個適當(dāng)?shù)呐袆e分值， 實現(xiàn)肽段水平的可信度控制； 利用隨機數(shù)據(jù)庫搜索等對單個搜索引擎和數(shù)據(jù)集肽段可信度控制結(jié)果， 構(gòu)建合適的算法模型， 實現(xiàn)對不同搜索引擎、不同數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)的整合； 考慮基于圖譜計數(shù)的半定量、 蛋白質(zhì)序列長度、數(shù)據(jù)庫大小、蛋白質(zhì)的酶切肽段和鑒定肽段等信息構(gòu)建基于超幾何分布的蛋白質(zhì)鑒定可信度評估概率模型。2) 提高蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎的靈敏度融合多種信息源， 提取和篩選有效的肽譜匹配特征， 基于機器學(xué)習(xí)技術(shù)， 將肽打分函數(shù)構(gòu)造問題， 轉(zhuǎn)化為排序?qū)W習(xí)或者分類問題， 通過迭代搜索或者迭代打分，動態(tài)地、自適應(yīng)地更新肽打分函數(shù)， 從而使之能夠

27、更好地適應(yīng)不同特點的質(zhì)。11歡迎下載精品文檔譜數(shù)據(jù)，在保證足夠可信度的條件下， 顯著提高肽鑒定的靈敏度和譜圖的解析率。對串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行聚類研究，揭示譜圖間的相互關(guān)系， 建立譜圖數(shù)據(jù)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。通過限制性譜圖聚類識別冗余譜圖，生成代表譜，改善譜圖的質(zhì)量，提高譜圖解析的精度。 通過非限制性聚類識別相關(guān)譜圖，發(fā)現(xiàn)含有修飾、 氨基酸突變的譜圖、以及由非特異酶切肽段產(chǎn)生的譜圖，以進一步提高譜圖解析率。3) 提高蛋白質(zhì)鑒定搜索引擎的速度采用高效的數(shù)據(jù)索引技術(shù)及與之相配合的高效搜索流程設(shè)計，以加速候選肽查詢的過程。 優(yōu)化肽譜匹配打分算法的實現(xiàn)， 使之適應(yīng)多種翻譯后修飾以及非限定修飾、非特異性酶切等帶來的候

28、選肽規(guī)模膨脹問題。 采用以序列標(biāo)簽手段為主，對數(shù)據(jù)庫候選肽進行過濾的方式， 突破傳統(tǒng)的搜索引擎框架。 通過實際典型數(shù)據(jù)的運行時間測量， 確定搜索引擎流程模塊的運行熱點， 研究任務(wù)級并行的靜態(tài)和動態(tài)負載均衡算法， 在此基礎(chǔ)上進一步研究算法級負載均衡算法， 將鑒定流程中的熱點模塊分配到多個節(jié)點進行運算，以進一步提高蛋白質(zhì)搜索引擎的速度，實現(xiàn) 12 個量級的加速。三）綜合利用實驗、儀器和計算手段發(fā)展肽序列De Novo 測序技術(shù)蛋白質(zhì)鑒定從頭測序算法的主要思想是只利用串聯(lián)質(zhì)譜中的譜峰信息推斷肽段序列。 De Novo 方法不依賴于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，在數(shù)據(jù)庫信息不完整的情況下 De Novo 比數(shù)據(jù)庫搜索

29、具有一定的優(yōu)勢。然而， De Novo 算法的應(yīng)用范圍有比較大的局限性， 它可以處理的數(shù)據(jù)通常為 CID 碎裂方式下的高質(zhì)量譜圖， 而且，DeNovo 方法的譜圖鑒定率相對比較低，通常情況下，對于質(zhì)量比較好的 MS/MS譜圖，利用從頭測序算法僅可以得到約 30%的正確鑒定結(jié)果。隨著質(zhì)譜儀精度的逐漸提高， 利用高精度譜圖的一系列優(yōu)勢，提高鑒定序列的準(zhǔn)確性，越來越受到人們的關(guān)注。 另外，利用同一肽段不同碎裂方式等方法產(chǎn)生的多張譜圖的內(nèi)在聯(lián)系進行從頭測序的方法也逐漸成為蛋白質(zhì)鑒定問題中的研究熱點。利用特殊化學(xué)修飾，如磺酸化修飾等，可以為De Novo提供更豐富的技術(shù)路線。為此，本課題將與課題4 密切

30、合作開展如下方面的研究。1) 利用高精度 MS/MS數(shù)據(jù)進行 De Novo 測序利用課題 4 提供的 LTQ-Orbitrap高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可以更有效地進行從頭測序。首先，高度精確的母離子及碎片離子質(zhì)量使得不同氨基酸殘基的區(qū)分度更。12歡迎下載精品文檔好，提高了氨基酸殘基識別的可靠性； 利用離子峰同位素模式的差異， 可以進一步區(qū)分質(zhì)量相似的氨基酸， 如谷氨酸與賴氨酸等。 其次，低精度質(zhì)譜儀下不同離子類型的碎片質(zhì)量可能重疊的現(xiàn)象， 在高精度情況下可能性大大降低， 從而可以進一步提高從頭測序算法的精度。 此外，利用高精度的有效離子峰， 可以計算出離子的理論氨基酸組成，從而更有效地過濾候選肽序列

31、。2) 利用譜圖相關(guān)性信息進行 De Novo 測序CID 與 EXD(如電子捕獲裂解ECD、電子轉(zhuǎn)運裂解ETD等) 是蛋白質(zhì)或多肽在質(zhì)譜儀中的不同碎裂方式，通常 EXD碎裂方式可以更好地保存完整的修飾信息，而且碎裂譜峰有較好的連續(xù)性， 與 CID 的特性形成很好的互補。 利用課題 4 提供的同一肽段的 CID/ETD碎裂形成的譜圖，我們可以利用不同譜圖間的譜峰信息相互驗證，區(qū)分有效峰與噪音峰， 進而將不同碎裂方式下的譜峰進行聚合， 可以提高譜圖的信噪比； 通過不同碎裂方式下相關(guān)離子的質(zhì)量差值， 可以識別譜峰所屬的離子類型；結(jié)合基于譜峰圖的從頭測序方法， 不僅可以提高鑒定肽段的置信度，而且可以

32、鑒定到單一碎裂方式下難以鑒定到的肽段。3) 利用化學(xué)修飾方法輔助 De Novo 測序近年來很多研究都通過各種化學(xué)小分子修飾策略來輔助肽段的裂解與質(zhì)譜測序。例如，通過磺酸化修飾在肽段上引入磺酸基， 不僅可以提高肽段的碎裂效率，還可以抑制其它離子的產(chǎn)生， 得到以 y 系列離子為主的 MS/MS數(shù)據(jù)；利用嘧啶化合物修飾多肽羧基可以有效增強修飾譜譜峰的信號強度。因此，利用課題 4 提供的高清晰串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)， 基于譜峰圖的方法進行從頭測序， 不僅可以更準(zhǔn)確地挑選有效峰， 而且減少了單個譜峰匹配多種可能離子類型的風(fēng)險， 從而提高從頭測序算法的精度。四）利用基因組數(shù)據(jù)庫搜索進一步提高質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析率基于蛋白

33、質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索的質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析與蛋白質(zhì)鑒定方法的成敗， 強烈依賴蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫是否完整， 如果不存在相應(yīng)的條目， 即使是質(zhì)量很好的譜圖， 也無法得到鑒定。因此，在常規(guī)鑒定方法的基礎(chǔ)上擴大搜索范圍，對更全面的 EST 或基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索，就成為提高質(zhì)譜鑒定率的另一種有效方法。目前存在各種不同的基因組學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫： 原始基因組數(shù)據(jù)，信息最全面，但數(shù)據(jù)量巨大，沒有可變剪接信息，所以目前一般只進行原核生物的直接搜索；。13歡迎下載精品文檔表達序列標(biāo)簽 EST（ Expressed Sequence Tag）庫，是指從不同組織來源的 cDNA 片段序列積累得到的數(shù)據(jù)庫， 可確定是轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)據(jù)， 且基本

34、覆蓋整個基因組；可變剪接數(shù)據(jù)庫，通過選取有可變剪接注釋的肽序列，進行搜索、序列比對、篩選和分類構(gòu)建而成，可以看作基因組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的橋梁。針對不同層次的數(shù)據(jù)庫，可以對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行多步驟、多策略的迭代搜索：先對常規(guī)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜索鑒定； 沒有得到解釋的質(zhì)譜數(shù)據(jù)再利用 EST庫和可變剪接數(shù)據(jù)庫進行搜索； 對于仍然無法解釋的質(zhì)譜， 采用直接搜索六個開放閱讀框翻譯的氨基酸序列的方法進行鑒定； 或通過譜圖解析得到肽片段信息， 再對基因進行序列比對。最終鑒定出常規(guī)方法無法解釋的譜圖數(shù)據(jù)?；驇焖阉髅媾R的主要挑戰(zhàn)包括： 如何構(gòu)建面向多層次海量基因數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)？如何加快鑒定速度， 應(yīng)對劇烈膨脹

35、的數(shù)據(jù)庫搜索量？如何有效估計和控制譜圖解析的錯誤率？為此本課題將與課題2 密切合作開展如下方面的研究。1）構(gòu)建多層次的、相互關(guān)聯(lián)的、海量的基因組- 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫基因組數(shù)據(jù)非常龐大復(fù)雜， 如何有效設(shè)計數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)予以存儲和表達，是非常關(guān)鍵的問題。本項目的課題 2 將構(gòu)建一個基于基因組序列的， 比當(dāng)前公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包含序列種類更多、 數(shù)量更大的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫； 而我們將通過設(shè)計索引數(shù)據(jù)格式和讀取接口， 解決海量規(guī)模數(shù)據(jù)庫的存儲和快速檢索問題。 借鑒現(xiàn)有成熟的蛋白質(zhì)和肽數(shù)據(jù)索引技術(shù)方案， 設(shè)計合理的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)， 便于系統(tǒng)內(nèi)數(shù)據(jù)的讀取、存儲、壓縮、表達，查詢和關(guān)聯(lián)。2）提高蛋白質(zhì)鑒定引擎的搜索速度基因組或

36、 EST數(shù)據(jù)庫相對于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫， 規(guī)模擴大了不止一個數(shù)量級，面臨著搜索速度上的挑戰(zhàn)。除了利用各種常規(guī)思路對搜素引擎進行加速外，重點利用基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，將常規(guī)蛋白數(shù)據(jù)庫搜索或者DeNovo測序鑒定出的肽段 / 蛋白質(zhì)映射到對應(yīng)的核酸序列上，然后枚舉出該基因區(qū)域經(jīng)過突變、 可變剪接、 翻譯等種種變化得到的所有可能的氨基酸序列，對沒有得到鑒定結(jié)果的譜圖進行二次搜索，既可能提高譜圖解析率， 同時又可以大大減小基因組數(shù)據(jù)庫產(chǎn)生的候選肽規(guī)模，從而加速鑒定。3）研究搜索結(jié)果可靠性問題，有效估計和控制譜圖解析的錯誤率。數(shù)據(jù)庫規(guī)模的擴大， 不僅僅帶來速度問題： 基因組數(shù)據(jù)或 EST數(shù)據(jù)庫

37、遠大于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫， 同時含有一定的測序誤差， 發(fā)生隨機匹配的概率更大； 并且因為。14歡迎下載精品文檔預(yù)測錯誤的開放閱讀框和低質(zhì)量的 EST序列，以及串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)本身帶有的噪音和復(fù)雜性，將導(dǎo)致更多錯誤的隨機匹配。 因此需要深入分析傳統(tǒng)方式下隨機誤匹配產(chǎn)生的原因，構(gòu)建模型提取特征，進一步建立完善的估計檢驗算法。課題承擔(dān)單位：中國科學(xué)院計算技術(shù)研究所課題參加單位：復(fù)旦大學(xué)課題負責(zé)人 :賀思敏科研骨干：孫瑞祥、趙屹、張揚經(jīng)費比例： 23%課題 2.高精度 MS/MS數(shù)據(jù)對基因組蛋白質(zhì)編碼基因的補充和修訂課題背景：基因組DNA序列的測定標(biāo)志著人類在探索生命之謎的征程中邁出了關(guān)鍵一步。 但是，解讀基因

38、組中所富含的遺傳秘密和生物功能信息的研究工作還剛剛開始。根據(jù) 2007 年在 PNAS上發(fā)表的研究表明， 人類基因組中的蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量可能會少于24,500; 而 Broad 研究所的研究指出，人類基因數(shù)據(jù)庫如Ensembl、RefSeq 和 Vega 包括了許多任意出現(xiàn)的而非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的開放閱讀框，實際上人類基因組中的蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)目可能只有20,500 左右。 2007年康奈爾大學(xué)的研究人員發(fā)表在 GenomeResearch 的研究工作， 通過利用超級計算機比較人類、 小鼠、大鼠和雞的基因組部分， 發(fā)現(xiàn)了 300 個之前沒有確定的人類基因，還確定了幾百個已知基因的范圍。 這意味

39、著，有許多基因會在目前的生物分析方法下被漏掉。 傳統(tǒng)的基因注釋方法對廣泛表達基因的發(fā)現(xiàn)非常有效， 卻會遺漏只在特定器官表達或在胚胎發(fā)育早期表達的基因。傳統(tǒng)上，開放閱讀框（ open reading frame ， ORF）的一些原則正在受到大量實驗數(shù)據(jù)的挑戰(zhàn)，尤其是對于內(nèi)含子的可變剪切豐富的真核生物基因組而言， 基因組的注釋的缺陷尤其明顯。例如，即使是研究較透徹的模式生物果蠅，大概 30%的轉(zhuǎn)錄本都沒有被注釋。通過比對人的 EST和基因組， 產(chǎn)生了約 62000 個不相重疊的聚類， 但大多數(shù)。15歡迎下載精品文檔都不包含 ORF的 5端區(qū)域，提示了僅依靠測序cDNA來完整注釋動物基因組是不切實

40、際的。普遍使用的基因預(yù)測軟件GENSCAN在對小鼠和人的ORF預(yù)測上正確率僅為 15%和 10%；在哺乳動物基因預(yù)測方面表現(xiàn)最好的CONTRAST算法，對人的ORF預(yù)測也只有 58%的正確率。近年來，高精度質(zhì)譜儀（ FT、Orbit-Trap）的發(fā)展以及肽段解析技術(shù)的進步為基因組的蛋白質(zhì)編碼注釋開辟了新的研究方向。 采用 MS/MS數(shù)據(jù)注釋基因組有其獨到的技術(shù)優(yōu)勢。 首先，肽段反映的是基因最終表達的產(chǎn)物， 它比 RNA分子更為直接地傳遞了基因的編碼信息。 其次，大規(guī)模 MS/MS數(shù)據(jù)庫的建立， 使得傳統(tǒng)的一個基因一個 cDNA一次測序的觀念受到?jīng)_擊，利用 De Novo 技術(shù)分析 MS/MS

41、數(shù)據(jù)庫，可能極大地豐富肽段信息。蛋白質(zhì)組基因組學(xué)是近幾年誕生的一門用蛋白質(zhì)組信息解構(gòu)基因組的新興學(xué)科。 MS/MS質(zhì)譜實驗輔助基因組注釋已經(jīng)在多種物種中（原核生物，酵母，植物和人等）使用，涉及到基因組注釋的多個研究內(nèi)容，如：確認(rèn)預(yù)測基因、發(fā)現(xiàn)新基因、判斷假基因、證實可變剪切等。此外，串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)還和基因預(yù)測算法整合，提高了基因預(yù)測準(zhǔn)確率。 然而必須認(rèn)識到， 蛋白質(zhì)組基因組學(xué)領(lǐng)域還存在很多技術(shù)上的挑戰(zhàn)， 目前研究還大多局限于低等生物， 結(jié)果局限在對基因組注釋的補充與修訂，離全基因組水平基因注釋還相距很遠。據(jù)估計約 40-60%的人類基因存在可變剪切， 但 Tanner 等從一千八百萬張 MS/M

42、S質(zhì)譜里只找到了 40 多個可變剪切。造成這樣結(jié)果的原因主要有： 1）質(zhì)譜鑒定肽段的過程一般利用數(shù)據(jù)庫搜索法，只有數(shù)據(jù)庫中存在的蛋白質(zhì)才可能被預(yù)測到； 2）肽段和蛋白質(zhì)的鑒定有一定的假陽性，錯誤率隨著數(shù)據(jù)庫的增大而增大； 3）只有 10% 20%的質(zhì)譜能匹配到肽段， 絕大多數(shù)的質(zhì)譜都沒有被解讀。 課題 1 已就這些問題提出了一系列解決方案，著重解決公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫局限性問題以及肽段鑒定算法覆蓋率和重復(fù)率低的問題。 本課題將密切與課題 1 合作，利用課題 1 剖析 MS/MS數(shù)據(jù)的研究成果，通過 De Novo 方法直接分析和改善數(shù)據(jù)庫搜索效率以獲得盡可能多的肽段序列信息，然后建立 MS/MS數(shù)

43、據(jù)所對應(yīng)的肽段數(shù)據(jù)庫， 基于此數(shù)據(jù)庫進一步開展補充和修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因的研究工作。研究目標(biāo)一） 構(gòu)建綜合性蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；。16歡迎下載精品文檔二） 建立基于肽段信息注釋基因組的方法流程；三） 利用 MS/MS所鑒定的肽段補充和修訂基因組蛋白質(zhì)編碼基因。研究內(nèi)容一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建為適應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索鑒定， 構(gòu)建一個基于基因組序列的， 比當(dāng)前公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包含序列種類更多、 數(shù)量更大的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫， 能使我們更有效地利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。 在這個方面， 我們和課題 1 既有密切合作， 又有各自專攻方向。 課題 1 通過設(shè)計索引數(shù)據(jù)格式和讀取接口， 提高蛋白質(zhì)鑒定引擎的

44、搜索速度，有效估計和控制譜圖解析的錯誤率以解決海量規(guī)模數(shù)據(jù)庫的存儲和快速檢索問題，而本課題組則從如下幾個方面提供構(gòu)建綜合數(shù)據(jù)庫的策略：1) 整合現(xiàn)有的蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫當(dāng)前蛋白質(zhì)序列公共數(shù)據(jù)庫，如 NCBI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫， Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，以及 EMBL-EBI的 IPI 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫等囊括了絕大多數(shù)已知蛋白質(zhì)的序列信息。整理這些數(shù)據(jù)庫中的人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)， 包括不同庫間數(shù)據(jù)進行相互補充和驗證、通過 Blast 方法去除冗余蛋白質(zhì)、 統(tǒng)一蛋白質(zhì)編號、 使用 FASTA格式存儲包含對應(yīng)基因組定位信息在內(nèi)的蛋白質(zhì)序列信息， 從而構(gòu)建一個含有絕大多數(shù)已知人類蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)集合。2) 使用

45、 “六位移碼翻譯 ”方法得到全基因組 ORF數(shù)據(jù)集使用 “六位移碼翻譯 ”方法從基因序列中尋找潛在的 ORF，能最大范圍地覆蓋所有基因可能的轉(zhuǎn)錄本。從 NCBI基因組數(shù)據(jù)庫， Ensembl 基因組數(shù)據(jù)庫和 UCSC 基因組數(shù)據(jù)庫搜集到完整的基因組序列信息。 潛在的 ORF起始位點開始于每一個染色體的第一個堿基，每翻譯到終止密碼子時即為 ORF的終止位點。下一個 ORF 的起始位點定為上一個 ORF終止位點的下一個堿基。 基因組中不明確的堿基使用隨機方式以一種堿基代替。 這種方法應(yīng)用于基因組 DNA雙鏈的各三個閱讀框， 即“六位移碼翻譯 ”。每一個 ORF均標(biāo)示出基因組的坐標(biāo)與方向， 便于將肽

46、段信息匹配到基因組上。從每一個染色體得到的氨基酸序列以 FASTA格式保存。3) 構(gòu)建可變剪切數(shù)據(jù)庫可變剪切是單個基因編碼眾多蛋白質(zhì)亞型的重要機制。通過多種方法構(gòu)建可變剪切數(shù)據(jù)庫對于驗證已有的及發(fā)現(xiàn)新的可變剪切方式、發(fā)現(xiàn)新 ORF與新基因。17歡迎下載精品文檔具有重要意義。我們整合已有的（如 Ensembl 數(shù)據(jù)庫）和預(yù)測軟件（如 “AUGUSTUS”）預(yù)測的外顯子與內(nèi)含子信息， 構(gòu)建含有基因多種可變剪切模型的數(shù)據(jù)庫。具體步驟包括： 1）將基因（正鏈）的同一個轉(zhuǎn)錄本內(nèi)的已知與預(yù)測的外顯子按5' 至 3'順序排列后，依次按順序選取外顯子序列拼合組成所有可能的剪切方式；2）對于每一

47、種拼接結(jié)果，截取拼接點左右各90 個堿基序列（如果外顯子堿基數(shù)少于90，則取其全部序列，截取過程中保留拼接點位置信息），從該序列 5' 端每次移動一個堿基共移動三次分別按通用密碼子翻譯成含有近60 個氨基酸的肽段序列；3）去除不連續(xù)的無意義的蛋白質(zhì)序列； 4）位于反鏈上的基因?qū)⑵滢D(zhuǎn)錄本反轉(zhuǎn)成相應(yīng)的正鏈堿基序列后按照前三個步驟構(gòu)建可變剪切序列。為了應(yīng)對MS/MS搜索后續(xù)的結(jié)果評估，上述三個數(shù)據(jù)庫還會與一個將靶序列打亂（ shuffle）生成的 “誘餌 ”（decoy ）庫相結(jié)合，生成最終用于搜索的大型數(shù)據(jù)庫。任何一個在靶序列庫和誘餌序列庫中同時出現(xiàn)的8 氨基酸以上的序列都會被重新打亂 （

48、re-shuffled），以保證靶序列與誘餌序列之間的重合度最小，方便后續(xù)鑒定結(jié)果假陽性率（false-discovery rate, FDR）的估算。二）建立基于肽段信息注釋基因組的方法流程通過 De Novo方法直接分析和改善數(shù)據(jù)庫搜索效率， 我們將盡可能從高精度MS/MS數(shù)據(jù)獲得豐富的肽段序列，并建立 MS/MS對應(yīng)的肽段數(shù)據(jù)庫。以此數(shù)據(jù)庫為基點可通過與對應(yīng)的蛋白質(zhì)信息聯(lián)配（ alignment ）至基因組上，將這些肽段延伸成開放閱讀框（ORF），最終生成一個“蛋白質(zhì)組基因組學(xué)圖譜”（ proteogenomic map）。這些基于肽段序列的基因組注釋方法學(xué)將主要包括下列七個方面：1）

49、鑒定已知蛋白質(zhì)的診斷（ diagnostic ）肽段結(jié)合完全匹配文本搜索和本地序列聯(lián)配方法 （如 Perl 編寫的正則表達式），可鑒定出映射到已知編碼區(qū)域的基因內(nèi)診斷肽段。由這種方法無法鑒定的肽段，運用 TBLASTN（使用 PAM30矩陣）對它們親本（ parent ）基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行聯(lián)配，只考慮 100%匹配的鑒定結(jié)果。2） 分類已知基因內(nèi)的新診斷肽段將不能聯(lián)配于任意已知蛋白質(zhì)的基因內(nèi)診斷肽段聯(lián)配到從 UCSC基因組網(wǎng)站上獲得的人類 ESTs庫，MEGABLAST使用步長 12。新肽段完全包含在已注釋外顯。18歡迎下載精品文檔子之內(nèi)定義為IE （ intronic exon），肽段與已

50、注釋外顯子部分重疊分類為OE（ overlappingexon ），而 完全 未處于已 注釋外顯 子中 的肽段定 義為NE（ non-overlapping exon ）。3） 定義新編碼區(qū)域?qū)υ\斷肽段 NE和 OE編碼區(qū)域兩側(cè)延伸 1000堿基對由 BLASTN聯(lián)配到 ESTs，只接受匹配重疊于肽段編碼區(qū)域且E 值小于 1e-6 的結(jié)果。新編碼區(qū)域的相應(yīng)基因位置來自于從重疊ESTs生成的最長鄰近聯(lián)配窗。4）鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（ domain）分類為 OE的診斷肽段以BLASTP聯(lián)配到他們的親本基因?？赡馨码亩蔚南鄳?yīng)蛋白質(zhì)隨后被計算確定。 每個蛋白質(zhì)序列使用UNIPROT和 PROSITE搜

51、索其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。從數(shù)據(jù)庫中挑出重疊到新肽段區(qū)域的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。包括新OE肽段序列的理論蛋白質(zhì)亦基于如上所述的BLASTP相應(yīng)產(chǎn)物生成。這些理論蛋白質(zhì)也由 PROSITE分析，并與原始蛋白質(zhì)相比較， 以額外氨基酸殘基的存在確定引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的變化。5）校正開放閱讀框在當(dāng)前基因模型之外發(fā)現(xiàn)的新肽段中，當(dāng)有些新肽段位于已知的基因座（ gene locus ）時，這些與基因座的編碼區(qū)域重合的肽段將位于一個新閱讀框內(nèi)。為了（至少在一定程度上） 證實這些被錯誤預(yù)測的基因的存在， 我們用幾個特征篩選這些新肽段： 位于已知閱讀框外的新肽段要多次出現(xiàn)， 超出閱讀框外的氨基酸個數(shù)至少為 3，與已知數(shù)據(jù)庫中的序

52、列沒有沖突。6） 分析基因的可變剪切可采用兩種策略，篩選跨越基因組上剪切位點邊界的肽段，對已知的基因可變剪切模式進行注釋或發(fā)現(xiàn)基因的新剪切方式： 1）利用整合的現(xiàn)有的蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫與使用 “六位移碼翻譯 ”方法得到全基因組ORF數(shù)據(jù)集，將高通量質(zhì)譜鑒定到的肽段以無間隙（no gap）方式匹配到這些蛋白質(zhì)序列。將匹配到的蛋白質(zhì)重新比對到基因組后得到這些肽段在基因組上的位置信息。2）直接利用構(gòu)建的 “可變剪切庫 ”及其保留的可變剪切位置信息，合并入一個競爭性數(shù)據(jù)庫。 篩除最佳匹配出現(xiàn)在競爭性數(shù)據(jù)庫中的肽段，篩出跨越可變剪切位點的肽段。7）整合肽段開發(fā)新的基因預(yù)測算法。19歡迎下載精品文檔將質(zhì)譜鑒定到的肽段用TBLASTN算法對齊到基因組序列上。根據(jù)肽段在基因組上的位置為每個核苷酸指派狀態(tài)，用隱馬爾可夫方法建立基因預(yù)測模型，并估計模型參數(shù)。用此模型與