第八章發(fā)酵工業(yè)染菌的防治

1、第八章第八章 工業(yè)發(fā)酵染菌的防治工業(yè)發(fā)酵染菌的防治第一節(jié)第一節(jié) 工業(yè)發(fā)酵染菌的危害工業(yè)發(fā)酵染菌的危害純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染為防止染菌，采取了一系列措施：為防止染菌，采取了一系列措施： 密閉式發(fā)酵罐、無菌空氣、無菌室、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌、無菌操密閉式發(fā)酵罐、無菌空氣、無菌室、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌、無菌操作；作；染菌無法徹底避免；據(jù)報道染菌無法徹底避免；據(jù)報道國外抗生素發(fā)酵染菌率為國外抗生素發(fā)酵染菌率為25%，國內(nèi)抗生素發(fā)酵、青霉素發(fā)酵的，國內(nèi)抗生素發(fā)酵、青霉素發(fā)酵的染菌率為染菌率為2，鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素發(fā)酵染菌率為，鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素發(fā)酵染菌率為5%，谷氨酸噬

2、，谷氨酸噬菌體感染率為菌體感染率為12染菌影響產(chǎn)率、質(zhì)量、三廢治理都有很大的影響。染菌影響產(chǎn)率、質(zhì)量、三廢治理都有很大的影響。一、 染菌對各種發(fā)酵的影響：染菌對各種發(fā)酵的影響： 菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、發(fā)酵周期以及產(chǎn)物性質(zhì)不同，菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、發(fā)酵周期以及產(chǎn)物性質(zhì)不同，受污染的危害程度不同。受污染的危害程度不同。 青霉素：產(chǎn)青霉素酶的雜菌青霉素：產(chǎn)青霉素酶的雜菌 疫苗：全部廢棄疫苗：全部廢棄 檸檬酸：主要防止前期染菌檸檬酸：主要防止前期染菌 谷氨酸：噬菌體危害大谷氨酸：噬菌體危害大 肌苷、肌苷酸：易染菌肌苷、肌苷酸：易染菌二、染雜菌種類對發(fā)酵的影響二、染雜菌種類對發(fā)酵的影響 青霉素發(fā)酵

3、污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，青霉素發(fā)酵污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，鏈霉素發(fā)酵污染細(xì)短桿菌和假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比污染粗鏈霉素發(fā)酵污染細(xì)短桿菌和假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌危害大，四環(huán)素怕污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌大桿菌危害大，四環(huán)素怕污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌三、不同染菌時期對發(fā)酵的影響：三、不同染菌時期對發(fā)酵的影響：（1）種子培養(yǎng)期染菌：易染菌、應(yīng)滅菌后除去，并對種子罐、）種子培養(yǎng)期染菌：易染菌、應(yīng)滅菌后除去，并對種子罐、管道進(jìn)行檢查和徹底滅菌。管道進(jìn)行檢查和徹底滅菌。（2）發(fā)酵前期染菌：易染菌、應(yīng)特別防止，可重新滅菌，補(bǔ)）發(fā)酵前期染菌：易染菌、應(yīng)特別防止，

4、可重新滅菌，補(bǔ)充營養(yǎng)，重新接種發(fā)酵。充營養(yǎng)，重新接種發(fā)酵。（3）發(fā)酵中期染菌：）發(fā)酵中期染菌： 發(fā)酵中期染菌，挽救處理困難，危害性大；發(fā)酵中期染菌，挽救處理困難，危害性大； 抗生素發(fā)酵：抗生素發(fā)酵： 將另一罐發(fā)酵正常、單位高的發(fā)酵液的一部分輸入染菌罐將另一罐發(fā)酵正常、單位高的發(fā)酵液的一部分輸入染菌罐中，以抑制雜菌繁殖，同時采取低通風(fēng)，低流加糖量等措施中，以抑制雜菌繁殖，同時采取低通風(fēng)，低流加糖量等措施 檸檬酸發(fā)酵：檸檬酸發(fā)酵： 污染細(xì)菌：加大通風(fēng)量，加速產(chǎn)酸，降低污染細(xì)菌：加大通風(fēng)量，加速產(chǎn)酸，降低pH，抑制細(xì)菌，抑制細(xì)菌生長；生長； 污染酵母污染酵母 ：加：加0.025-0.035g/L硫酸

5、銅；硫酸銅； 污染黃曲霉；加入另一罐將近成熟的醪液，使污染黃曲霉；加入另一罐將近成熟的醪液，使pH下降，下降，黃曲霉自溶黃曲霉自溶 污染青霉：青霉能在低污染青霉：青霉能在低pH環(huán)境下生長，可考慮提前放罐。環(huán)境下生長，可考慮提前放罐。（4）發(fā)酵后期染菌）發(fā)酵后期染菌 可考慮提前放罐。可考慮提前放罐。 四、染菌程度對發(fā)酵的影響四、染菌程度對發(fā)酵的影響 染菌程度越大，即進(jìn)入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)目越多，染菌程度越大，即進(jìn)入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)目越多，對發(fā)酵的危害越大。對發(fā)酵的危害越大。 染少量雜菌，有時可以容忍；染少量雜菌，有時可以容忍； 前期和中期染菌，應(yīng)結(jié)合染菌程度綜合考慮。前期和中期染菌，應(yīng)結(jié)合染菌程度綜合

6、考慮。 五、染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響五、染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾困難菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾困難一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象 1、種子培養(yǎng)異常、種子培養(yǎng)異常（1）菌體生長緩慢：原料質(zhì)量、菌體老化、供氧不足、溫）菌體生長緩慢：原料質(zhì)量、菌體老化、供氧不足、溫度、酸堿度，種子冷藏時間長或接種量過低。度、酸堿度，種子冷藏時間長或接種量過低。（2）菌絲結(jié)團(tuán)：菌絲團(tuán)中央結(jié)實，內(nèi)部菌絲的營養(yǎng)吸收和）菌絲結(jié)團(tuán)：菌絲團(tuán)中央結(jié)實，內(nèi)部菌絲的營養(yǎng)吸收和呼吸受到影響，不能正常生長。原因多而且復(fù)雜。呼吸受到影響，不能正常生長。原因多而且

7、復(fù)雜。（3）代謝不正常：接種物質(zhì)量和培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境查，）代謝不正常：接種物質(zhì)量和培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境查，接種量小、雜菌污染等有關(guān)接種量小、雜菌污染等有關(guān)第二節(jié) 染菌的檢查、分析和防治2、發(fā)酵異常、發(fā)酵異常（1）菌體生長差：種子質(zhì)量的影響；導(dǎo)致代謝緩）菌體生長差：種子質(zhì)量的影響；導(dǎo)致代謝緩慢。慢。（2）pH不正常：培養(yǎng)基質(zhì)量、滅菌效果、補(bǔ)糖等不正常：培養(yǎng)基質(zhì)量、滅菌效果、補(bǔ)糖等影響；是所有代謝反應(yīng)的綜合反映。影響；是所有代謝反應(yīng)的綜合反映。（3）溶解氧異常）溶解氧異常 染菌：染好氧菌，染厭氧菌染菌：染好氧菌，染厭氧菌（4）泡沫過多）泡沫過多 泡沫的消長不符合規(guī)律；培養(yǎng)基滅菌時溫度過泡沫的消

8、長不符合規(guī)律；培養(yǎng)基滅菌時溫度過高或時間過長，葡萄糖變成氨基糖會引起泡沫。高或時間過長，葡萄糖變成氨基糖會引起泡沫。（5）菌體濃度過高或過低）菌體濃度過高或過低 罐溫長時間偏高；溶氧不足；營養(yǎng)條件差；種罐溫長時間偏高；溶氧不足；營養(yǎng)條件差；種子質(zhì)量差；菌體自溶。子質(zhì)量差；菌體自溶。二、染菌的檢查與判斷二、染菌的檢查與判斷1、染菌的檢查、染菌的檢查（1）顯微鏡檢查法（最簡單、最直接、最經(jīng)常）顯微鏡檢查法（最簡單、最直接、最經(jīng)常）（2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法；）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法； 平板制好后，應(yīng)先保溫平板制好后，應(yīng)先保溫24小時，確定無菌小時，確定無菌（3）肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅

9、變色）肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色pH6.8-8.4）2、以上、以上3種檢查法的不足種檢查法的不足 以上以上3種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定未被染菌；未被染菌； 原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的染菌情況（的染菌情況（1個個/ml）3、發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象來判斷染菌、發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象來判斷染菌（1）溶解氧水平異常顯示染菌（谷氨酸）溶解氧水平異常顯示染菌（谷氨酸）（2）排氣中）排氣中CO2異常顯示染菌異常顯示染菌CO2的含量變化是有規(guī)律的；的含量變化是有規(guī)律的；染菌引起糖的消耗變化，染好氧性雜菌，染菌引起糖的消耗變化，染好氧性雜

10、菌，糖耗加快，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌體，糖含量增加；染噬菌體，糖耗減慢，耗減慢， CO2含量減少。含量減少。三、發(fā)酵染菌率和染菌原因分析三、發(fā)酵染菌率和染菌原因分析（一）、發(fā)酵的染菌率（一）、發(fā)酵的染菌率發(fā)酵染菌批數(shù)發(fā)酵染菌批數(shù)總投料批數(shù)總投料批數(shù)總?cè)揪士側(cè)揪?100 染菌率與發(fā)酵的菌種、培養(yǎng)基、產(chǎn)品性染菌率與發(fā)酵的菌種、培養(yǎng)基、產(chǎn)品性質(zhì)、發(fā)酵周期、生產(chǎn)環(huán)境條件設(shè)備和管理技質(zhì)、發(fā)酵周期、生產(chǎn)環(huán)境條件設(shè)備和管理技術(shù)水平等有關(guān)。術(shù)水平等有關(guān)。（二）、染菌原因分析（二）、染菌原因分析（1）染菌原因分析就是總結(jié)染菌的教訓(xùn)，防）染菌原因分析就是總結(jié)染菌的教訓(xùn)，防范于未然。范于未然。（2）

11、主要染菌原因：種子帶菌，無菌空氣帶）主要染菌原因：種子帶菌，無菌空氣帶菌，設(shè)備滲漏，滅菌不徹底，操作管理不菌，設(shè)備滲漏，滅菌不徹底，操作管理不當(dāng)。當(dāng)。（3）染菌的雜菌種類分析：）染菌的雜菌種類分析： 雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角）雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角） 雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)備雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)備滲漏，管理操作等）滲漏，管理操作等） 雜菌是真菌（設(shè)備、冷卻盤管的滲漏、無菌室滅雜菌是真菌（設(shè)備、冷卻盤管的滲漏、無菌室滅菌不徹底或無菌操作不當(dāng)，糖液滅菌不徹底）菌不徹底或無菌操作不當(dāng)，糖液滅菌不徹底）（4）染菌的規(guī)模分析）染菌的規(guī)模分析 大批量發(fā)酵

12、罐染菌：種子、空氣；大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣； 前期：種子帶菌，滅菌問題；前期：種子帶菌，滅菌問題； 中后期：空氣帶菌；中后期：空氣帶菌； 部分發(fā)酵罐染菌：部分發(fā)酵罐染菌： 個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏（5）染菌的時間分析）染菌的時間分析 種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作；種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作； 發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作；發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作； 發(fā)酵后期：空氣，補(bǔ)料，設(shè)備滲漏，泡沫發(fā)酵后期：空氣，補(bǔ)料，設(shè)備滲漏，泡沫四、染菌途徑及預(yù)防四、染菌途徑及預(yù)防1、種子帶菌的防止、種子帶菌的防止（1）培養(yǎng)基及用具滅菌要徹底，應(yīng)防止假壓；）培養(yǎng)基及用具滅菌要

13、徹底，應(yīng)防止假壓；（2）菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當(dāng)，管理不嚴(yán)；）菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當(dāng)，管理不嚴(yán)；（緩沖間）（緩沖間）（3）菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染）菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染（試管塞，查看的時（試管塞，查看的時候要注意）候要注意）2、無菌空氣帶菌及其防止：、無菌空氣帶菌及其防止： 流程設(shè)計，介質(zhì)滅菌流程設(shè)計，介質(zhì)滅菌3、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治 （1）原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合）原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合不均勻，易結(jié)塊，團(tuán)塊中包埋的活菌不易殺滅；不均勻，易結(jié)塊，團(tuán)塊中包埋的活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和

14、加淀粉酶?？缮郎厍皵嚢韬图拥矸勖?。 （2）實罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假）實罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假壓，升溫時，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。壓，升溫時，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。 （3）連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未）連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底。達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底。 （4）設(shè)備和管道存在）設(shè)備和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該到達(dá)的局部滅菌部位，從而不充分到達(dá)預(yù)定應(yīng)該到達(dá)

15、的局部滅菌部位，從而不能達(dá)到徹底滅菌的要求。能達(dá)到徹底滅菌的要求。 常見的設(shè)備、管道常見的設(shè)備、管道“死角死角” 發(fā)酵罐的發(fā)酵罐的“死角死角”：不銹鋼襯里破裂造成死角，：不銹鋼襯里破裂造成死角，發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢。 管道安裝不當(dāng)形成的死角 4、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止 （1）發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門長期使用，由于腐蝕、）發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門長期使用，由于腐蝕、摩擦和振動等原因，造成滲漏。摩擦和振動等原因，造成滲漏。 （2）微小滲漏的檢查：加入堿性水，用浸濕酚酞）微小滲漏的檢查：加入堿性水，用浸濕酚酞 指示劑的白布擦，有滲漏則白布顯紅色。指示劑的白

16、布擦，有滲漏則白布顯紅色。5、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治（1）滅菌過程中嚴(yán)防泡沫升頂，盡可能添加）滅菌過程中嚴(yán)防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生；消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生；（2）傳感器探頭用化學(xué)試劑浸泡法滅菌可能）傳感器探頭用化學(xué)試劑浸泡法滅菌可能導(dǎo)致滅菌不徹底。導(dǎo)致滅菌不徹底?？股厝揪鷮嵗治?1、現(xiàn)象： 一級種子罐連續(xù)染菌，菌型一致，均為芽孢桿菌，接種后24小時就當(dāng)班片子種發(fā)現(xiàn)，量相當(dāng)大。5批染34批。罐內(nèi)無攪拌，夾套降溫。 2、分析：母瓶無菌斜面正常，不接種的白料無菌試驗罐也染菌（種子原因排除），消后無菌斜面正常，接種后12小時左右的斜面能鏡檢出雜菌（操

17、作原因基本排除）。罐體內(nèi)只有一取樣管和一空氣管，較干凈，蒸汽壓力和儀表溫度對應(yīng)良好，消毒工都有十幾年的工作經(jīng)驗，操作問題不大（為了排除操作問題，我和技術(shù)員和消毒工共同消了幾個罐，無菌仍不正常）。判斷有罐體內(nèi)可能有料垢和死角。 3、結(jié)論： 根據(jù)我在生產(chǎn)中碰到和解決的無菌問題來看，靠罐閥的檢修不到位造成的染菌站15左右，包括密封墊脫落、老化，閥頭脫落，外漏，內(nèi)漏等等，作大生產(chǎn)，要不有錢買好設(shè)備，要沒錢必須要有好的制度和好的操作工。根據(jù)我的生產(chǎn)經(jīng)驗看，買好設(shè)備要劃算的多，染一罐少則損失幾百元，多則幾十萬。6、噬菌體污染和防治、噬菌體污染和防治 （1）、噬菌體污染的預(yù)防）、噬菌體污染的預(yù)防 嚴(yán)格活菌體排放，切斷噬菌體的糧源嚴(yán)格活菌體排放，切斷噬菌體的糧源 做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體與雜菌做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體與雜菌 嚴(yán)防噬菌體與雜菌進(jìn)入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi)嚴(yán)防噬菌體與雜菌進(jìn)入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi) 抑制罐內(nèi)噬菌體的生長抑制罐內(nèi)噬菌體的生長（2）、污染噬菌體后的處理方法）、污染噬菌體后的處理方法 并罐法并罐法 轉(zhuǎn)換使用菌種或使用抗性菌株轉(zhuǎn)換使用菌種或使用抗性菌株 放罐重消法放罐重消法 罐內(nèi)滅噬菌體的方法罐內(nèi)滅噬菌體的方法 添加噬菌體抑制劑的方法添加噬菌體抑制