實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1、精品實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)1. 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái),超聲波清洗器,漩渦振蕩器,CP224S 電子秤量?jī)x,隔水式恒溫箱 ,Q/CYAB10-2001 手提式壓力蒸汽滅菌鍋 ,電冰箱 ,蒸汽消毒器 ,PH 計(jì) :PH_3C, 培養(yǎng)皿 ,試管 , 牛津杯，電爐等 試管 ,三角燒瓶 ,燒杯 ,量筒 ,玻璃棒 ,培養(yǎng)基分裝器 ,扭力天平 ,牛角匙 ,高壓蒸汽滅菌鍋 ,pH 試紙 （pH5 5 9 0 ） ,棉花 ,牛皮紙 ,記號(hào)筆 ,麻繩 ,紗布等。2. 實(shí)驗(yàn)方案3.1培養(yǎng)基的制備MRS 培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基： 蛋白胨 10g, 牛肉膏 10g, 酵母膏 5g, 檸檬酸二銨2g, 乙酸鈉 5g,磷酸氫二鉀2g, 硫

2、酸鎂 .7H 2 O0.58g, 硫酸錳0.25g, 吐溫 -801ml, 蒸餾水1000ml, P H6.2-6.4.,瓊脂 18g, 葡萄糖 20g.LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化鈉 10g/l3.2試驗(yàn)方法3.2.1 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備將活化好的菌株以2% 的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中 ,37 下培養(yǎng)24小時(shí)后 ,離心（4 ,6000r/min,15min）取發(fā)酵上清通過(guò)直徑為0.22 納米的威龍濾菌器過(guò)濾,取過(guò)濾后的上清液 ,置于 4的冰箱中保存并使用.3.2.2 指示菌懸濁液的制備將活化后的指示菌培養(yǎng)液接種于LB 培養(yǎng)基的試管中,培養(yǎng) 24 小時(shí)后得到菌懸液

3、待用.先配置 100ml生理鹽水，加入250ml三角瓶中，再在其中加入20 粒左右玻璃珠，高壓滅菌，然后用接種環(huán)將斜面上的菌苔刮下，接入三角瓶中，一般接1-2環(huán)接可，或者用少量的無(wú)菌生理鹽水倒入斜面中，用接種環(huán)將菌苔刮下，然后倒入三角瓶中，將三角瓶震搖 1 分鐘左右，即可生成菌懸液。3.2.3 抑菌物質(zhì)的理化特性（ 1）不同熱處理對(duì)菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響分別在不同的溫度（45 ,60 ,80 ,100 ）下將菌株發(fā)酵上清液處理10min, 大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn),未經(jīng)處理的發(fā)酵液作對(duì)照.welcome精品1)倒平板：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基 加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15ml

4、 （下層），待其凝固。此外，將融化的LB 培養(yǎng)基冷卻到50 左右混入試驗(yàn)菌，將混有菌的培養(yǎng)基5 ml 加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。2)擺放牛津杯：以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基 表面直接垂直放上牛津杯（內(nèi)徑6mm 、外徑8mm 、高 10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。3) 溫度處理 : 分別在不同的溫度 （45 ,60 ,80 ,100 ）下將菌株發(fā)酵上清液處理 10min ）。4) 加入待撿藥業(yè)：在杯中加入待檢樣品（發(fā)酵液），牛津杯一般可以裝240 微升 ,勿使其外溢。5) 培養(yǎng)：加滿后置 37 培養(yǎng) 16-18 小時(shí)。6)結(jié)果報(bào)告：觀

5、察結(jié)果，抑菌圈用尺直接量就可以。不同值對(duì)菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響1) 分別用 1mol LHCI 和 2mol LNaOH 將菌株發(fā)酵上清液調(diào)至不同的值（ 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0 ） ,并以大腸桿菌作指示菌進(jìn)行抑菌的試驗(yàn) ,從未接種的 MRS 液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至上述相應(yīng)的 P值作對(duì)照 .2)倒平板：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基 加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15ml （下層），待其凝固。此外，將融化的LB 培養(yǎng)基冷卻到50 左右混入試驗(yàn)菌，將混有菌的培養(yǎng)基5 ml 加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。welcome精品3)擺放牛津杯：以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基 表面直接垂

6、直放上牛津杯（內(nèi)徑6mm 、外徑8mm 、高 10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。4) PH 處理 : 分別用 1mol LHCI 和 2mol LNaOH 將菌株發(fā)酵上清液調(diào)至不同的值（ 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0 ）5)加入待撿藥業(yè)：在杯中加入待檢樣品（發(fā)酵液），牛津杯一般可以裝240 微升 ,勿使其外溢。6) 培養(yǎng)：加滿后置 37 培養(yǎng) 16-18 小時(shí)。7)結(jié)果報(bào)告：觀察結(jié)果，抑菌圈用尺直接量就可以。( 一 ) 蛋白酶處理對(duì)發(fā)酵上清液抑菌物質(zhì)的影響分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶，分別在它們最適p H （ 2

7、.0 ， 7.6 ），用濃度為100 g/m L 的酶液在 37 處理1 h ，之后100 水浴1min滅活，處理后將p H調(diào)到起點(diǎn)值再測(cè)定抑菌能力。1)倒平板：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基 加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15ml （下層），待其凝固。此外，將融化的LB 培養(yǎng)基冷卻到50 左右混入試驗(yàn)菌，將混有菌的培養(yǎng)基5 ml 加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。2)擺放牛津杯：以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基 表面直接垂直放上牛津杯（內(nèi)徑6mm 、外徑8mm 、高 10 mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。welcome精品3) 蛋白酶處理 : 分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶，分別在它們最適p H （2.0 ，7.6 ），用濃度為100 g/m L 的酶液在 37 處理 1 h ，之后 100 水浴 1min 滅活