氨基酸的分析分離 為了測定蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成或從蛋

1、 氨基酸的分析分離 為了測定蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成或從蛋白質(zhì)水解液中制取氨基酸，都需要對氨基酸混合物進行分析和分離工作。其方法較多，而目前使用較多的是層析法。（1）分配層析的一般原理：所有的層析系統(tǒng)都有兩個相組成，一個為固定相或靜相（stationary phase），一個為流動相或動相（mobile phase）?；旌衔镌趦上嘀械姆蛛x決定于混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)（ partition or distribution coefficient）來描述：當一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中進行分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（Kd

2、）。用下式表示： CA 表示某一物質(zhì)在動相中的濃度 Kd= CB 表示某一物質(zhì)在靜相中的濃度 物質(zhì)分配不僅可以在互不相溶的兩種溶劑即液相-液相系統(tǒng)中進行，也可在固相-液相或氣相-液相間發(fā)生。其系統(tǒng)中的靜相可以是固相、液相或固-液混合相（半液體相）；動相可以是液相或氣相，它充滿于靜相的空隙中，并能流過靜相。 在實際層析時，其層析行為一般并不直接決定于它的分配系數(shù)，而是取決于有效分配系數(shù)Keffo： 某一物質(zhì)在A相中的總量 Keffo= 某一物質(zhì)在B相中的總量對液相-液相層析系統(tǒng)來說： CAVA Keffo = = KdRV CBVB這里，CA和CB的意義同前；VA和VB分別為A相B相的體積；RV

3、為A、B兩相的體積比。由此可見， Keffo 是RV的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)整兩相的體積比而加以改變。 利用層析法分離混合氨基酸，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異。一般差異越大，越容易分開。 若是逆流分溶或逆流分配，當轉(zhuǎn)移n次后，某一物質(zhì)在（n+1）個管中分布的分數(shù)含量是（p+q)n=1展開式的相應項的值。這里p和q分別為某一物質(zhì)在靜相和動相中的分數(shù)含量，即p+q=1。例如物質(zhì)Y的 Kd=q(動相)/(靜相)p=1 即: p+q=1/2+1/2=1轉(zhuǎn)移n次后,在第k號管中某一物質(zhì)的含量可由下式計算: n！ pn-k+1 qk-1 Tn,k= （n-k+1）

4、！（k-1）！怎么辦？例題：當某一物質(zhì)在一個層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為3時，物質(zhì)被轉(zhuǎn)移4次后在第四管中的含量是多少？解：根據(jù)分配系數(shù)公式可知： p+q=1/4+3/4=1，即在靜相中的分數(shù)含量為1/4，在動相中的分數(shù)含量3/4，則可由上述公式計算如下： 4！1/4 （3/4)3 T4,4=27/64 3！假若該物質(zhì)的總量為96，則該管中的含量應為：（27/64） 96=40.56461813123641216486481616161632329271688816逆流分溶原理分配系數(shù)為1分配系數(shù)為3上相為動相（A），下相為靜相（B） 2 4 6 8 10 12 14 16 管號302010Kd=1K

5、d=3管中物質(zhì)的總量分溶曲線結(jié)論：分配系數(shù)大的物質(zhì)沿一系列分溶管的移動速度快與分配系數(shù)小的物質(zhì)n=600n=100n=10相對濃度溶劑系統(tǒng)體積 分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)（理論板數(shù)）的依賴關系(2)分配柱層析 層析柱中的填充劑或支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。支持劑表面附著一層不會流動的結(jié)合水作為固定相，沿固定相流過的與它互不相溶的溶劑（如苯酚、正丁醇等）是流動相。由填充劑構(gòu)成的柱床可以設想為由無數(shù)的連續(xù)的板層組成，每一板層起著微觀的“分溶管”作用。當用洗脫劑洗脫時，在柱上端的氨基酸混合物在兩相之間按不同的分配系數(shù)進行連續(xù)不斷的進行分配移動。分部收集層析柱下端的洗脫液，然后

6、分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）（3）濾紙層析 濾紙層析也是分配層析的一種。這里的濾紙纖維素吸附水作為固定相，展層用的溶劑是流動相。層析時，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。 層析時，將樣品點在濾紙的一個角上，稱為原點。然后將其放入一個密閉的容器中，用一種溶劑系統(tǒng)進行展層，層析后烘干濾紙，再將其旋轉(zhuǎn)90度采用第二種溶劑系統(tǒng)進行第二相展層。由于各種氨基酸在兩個不同的溶劑系統(tǒng)中具有不同的遷移率

7、（ Rf ），因此它們就會彼此分開，當用茚三酮顯色時，就會在濾紙上面出現(xiàn)各種氨基酸的斑點。當然，若氨基酸種類較少或一相就能分開，進行一相層析即可。 溶劑前沿氨基酸顯色點濾紙原點XY濾紙層析中的Rf值， Rf =X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的雙向濾紙層析圖譜（4）薄層層析（thin-layer chromatography)：該層析分辨率高，需量極少，層析速度快，可使用的支持劑種類多，如纖維素粉、硅膠、氧化鋁等。其步驟大體如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成為一個均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進行展層，使樣品中各個成分分開，最后進行鑒定和定量分析。

8、蓋子層析缸溶劑薄層板（側(cè)面）薄層層析裝置（5）離子交換層析（ion-exchange column chromatography) 這是一種用離子交換樹脂作支持劑的層析法。離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進行聚合和交聯(lián)反應生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹脂的基質(zhì)，帶電基團是通過后來的反應引入基質(zhì)的，樹脂一般都制成球形顆粒。 CH2CH2CHCH2CH2CHSO3 CH CH2CH2CH苯環(huán)SO3有氫型和鈉型H+或Na+H+或Na+樹脂分陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交

9、換樹脂含有的酸性基團如SO3H（強酸型）或COOH（弱酸型）可解離出H+離子，當溶液中含有其它陽離子時，例如酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子，它們可以和H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。同樣地陰離子交換樹脂含有的堿性基團如N（CH3）3OH（強堿型）或NH3OH（弱堿型）可解離出OH-，它能和溶液中的陰離子如堿型環(huán)境中的氨基酸陰離子發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 氨基酸在樹脂上結(jié)合的牢固程度即氨基酸與樹脂的親和力，主要決定于：它們之間的靜電引力；氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用。在PH為3左右的氨基酸與陽離子交換樹脂之間的靜電引力的大小次序是堿性氨基酸（R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型

10、氨基酸（R0）。因此，氨基酸的洗脫順序大體上是酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸。但有時并不是這樣，這是因為某些氨基酸和樹脂之間還存在著疏水作用。 為了使氨基酸從樹脂上洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步提高洗脫劑的PH和鹽濃度（離子強度），這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。（6）氣相色譜 當層析系統(tǒng)的流動相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體時，此層析技術稱為氣-液色譜（gas-liquid chromatography）或簡稱為氣相色譜。它是利用樣品組分在流動的氣相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同而達到分離組分的目的。 氣相色譜需要氣相色譜儀進行。 氣相色譜

11、具有微量快速的優(yōu)點。（7）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）：這是近十幾年來發(fā)展起來的一種快速、靈敏、高效的分離技術。 HPLC的特點是：使用的固定相支持劑顆粒很細，因而表面積很大；溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。因此多種類型的柱層析都可用HPLC來代替，例如分配層析、離子交換層析、吸附層析以及凝膠過濾等。 蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定 1 1 蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量測定 DSD-DSD-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 凝膠排阻層析凝膠排阻層析 電噴質(zhì)譜電噴質(zhì)譜 核磁共振核磁共振 2 2 蛋白質(zhì)等電點的測定

12、蛋白質(zhì)等電點的測定 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 PBE-SepharosePBE-Sepharose聚焦層析聚焦層析1 1概述概述1.11.1什么是蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定什么是蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個最基本技術蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個最基本技術, ,是確定是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題, ,尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時顯得更重要。研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性時顯得更重要。研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進行分離純化，最質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本

13、性質(zhì)進行分離純化，最終用純品對其進行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚終用純品對其進行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技未搞清楚，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術主要是對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進行分析鑒定。術主要是對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進行分析鑒定。1.21.2蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù)蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù)蛋白質(zhì)分子是非常復雜的生物大分子蛋白質(zhì)分子是非常復雜的生物大分子, ,能代表其特征參數(shù)很多能代表其特征參數(shù)很多. .但在但在普通實驗室能夠進行測定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下普通實驗室能夠進行測定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下幾種

14、。幾種。(1)(1)蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定( (分子量分子量) )(2)(2)蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點）蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點）(3)(3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定( (一、二級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、一、二級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、N N和和C-C-末端末端) )(4)(4)蛋白質(zhì)生物學功能鑒定蛋白質(zhì)生物學功能鑒定( (生物活性、比活、酶促動力學生物活性、比活、酶促動力學) )( (5)5)免疫學鑒定（抗原免疫學鑒定（抗原- -抗體反應、酶聯(lián)免疫反應）抗體反應、酶聯(lián)免疫反應） 2 2蛋白質(zhì)鑒定方法蛋白質(zhì)鑒定方法 蛋白質(zhì)可鑒定的參數(shù)很多，這里主要介紹蛋白質(zhì)的分子量和等電蛋白質(zhì)可鑒定

15、的參數(shù)很多，這里主要介紹蛋白質(zhì)的分子量和等電點兩個主要參數(shù)。點兩個主要參數(shù)。2.12.1蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量測定 早期測定蛋白質(zhì)分子量的方法是采用超速離心和光散射等方法。早期測定蛋白質(zhì)分子量的方法是采用超速離心和光散射等方法。由于這些方法需要高級的精密儀器設備和大量的蛋白樣品才能進行由于這些方法需要高級的精密儀器設備和大量的蛋白樣品才能進行測定，所以目前采用的不多了。測定，所以目前采用的不多了。 自從葡聚糖凝膠層析介質(zhì)自從葡聚糖凝膠層析介質(zhì)(Sephadex G(Sephadex G系列產(chǎn)品系列產(chǎn)品) )及排阻層析技術及排阻層析技術問世以來，就被廣泛應用于蛋白質(zhì)的分子量測定。它是目前實

16、驗室問世以來，就被廣泛應用于蛋白質(zhì)的分子量測定。它是目前實驗室測定白質(zhì)分子量常用技術之一。但是這種層析介質(zhì)剛性較差，在層測定白質(zhì)分子量常用技術之一。但是這種層析介質(zhì)剛性較差，在層析過程流速較慢，分離時間長。析過程流速較慢，分離時間長。 近年來又研究出剛性的耐壓的凝膠層析介質(zhì)，被用于高效液相近年來又研究出剛性的耐壓的凝膠層析介質(zhì)，被用于高效液相色譜。大大的提高了工作效率和測定精度。色譜。大大的提高了工作效率和測定精度。 隨著聚丙烯酰胺凝膠電泳的出現(xiàn)和發(fā)展，隨著聚丙烯酰胺凝膠電泳的出現(xiàn)和發(fā)展，DSD-PAGEDSD-PAGE電泳成了常電泳成了常用的方法。從用的方法。從9090年代初期隨著毛細管電泳

17、的出現(xiàn)，應用毛細管電泳年代初期隨著毛細管電泳的出現(xiàn)，應用毛細管電泳無膠篩分技術來測定蛋白質(zhì)分子量，是一種較好的選擇。無膠篩分技術來測定蛋白質(zhì)分子量，是一種較好的選擇。 蛋白質(zhì)氨基酸測序技術，質(zhì)譜技術和核磁共振波譜技術的發(fā)展，蛋白質(zhì)氨基酸測序技術，質(zhì)譜技術和核磁共振波譜技術的發(fā)展，給蛋白質(zhì)分子量測定技術增添了新的途徑。尤其是采用電噴質(zhì)譜測給蛋白質(zhì)分子量測定技術增添了新的途徑。尤其是采用電噴質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量，既快捷有準確。該技術在生物領域應用越來越廣，定蛋白質(zhì)分子量，既快捷有準確。該技術在生物領域應用越來越廣，是一種快速精確的好方法。是一種快速精確的好方法。 蛋白質(zhì)的分子量測定技術歸納起來大致

18、分三大類電泳技術，層蛋白質(zhì)的分子量測定技術歸納起來大致分三大類電泳技術，層析技術，光譜分析技術。析技術，光譜分析技術。2.1.1 SDS-2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定法聚丙烯酰胺凝膠電泳測定法 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉- -聚聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)polyacrylamide gel electrophoresis

19、, SDS-PAGE)。主要用于蛋白質(zhì)亞基分子量的測定。它具有操作簡單，主要用于蛋白質(zhì)亞基分子量的測定。它具有操作簡單，重復性好，對樣品的純度要求不高等特點，是目前使用重復性好，對樣品的純度要求不高等特點，是目前使用較為廣泛的測定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種方法。較為廣泛的測定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種方法。 (1)(1)原理：原理：a.a.蛋白質(zhì)分子狀態(tài)蛋白質(zhì)分子狀態(tài)在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電

20、荷的分子。在電場下向自身電荷相反的方向移動。定凈電荷的分子。在電場下向自身電荷相反的方向移動。b. b. 還原劑的解聚作用還原劑的解聚作用 在蛋白溶液和分離凝膠介質(zhì)中加入還原劑在蛋白溶液和分離凝膠介質(zhì)中加入還原劑 - -巰基乙醇巰基乙醇( ( - mercaptoethanol)- mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇或二硫蘇糖醇(Dithiothretiol, (Dithiothretiol, DTT)DTT)。蛋白質(zhì)分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚。蛋白質(zhì)分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打開，形成長短不一體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打

21、開，形成長短不一的單鏈亞基。的單鏈亞基。c. SDSc. SDS的包裹作用的包裹作用 SDSSDS分子中含有大量的帶負電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成分子中含有大量的帶負電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成的氨基酸側(cè)鏈與的氨基酸側(cè)鏈與SDSSDS結(jié)合，在結(jié)合，在SDSSDS的重量達到蛋白重量的的重量達到蛋白重量的3-43-4倍時蛋倍時蛋白質(zhì)分子表面完全被白質(zhì)分子表面完全被SDSSDS包裹，形成帶負電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，包裹，形成帶負電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，稱之為蛋白質(zhì)稱之為蛋白質(zhì)-SDS-SDS復合物復合物( protein-SDS micelles)( protein-SDS micelles)。

22、由于蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)- -SDSSDS復合物所帶負電荷遠大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就復合物所帶負電荷遠大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)-SDS-SDS復合物在水溶液復合物在水溶液中的形狀象一個長橢圓棒。這種棒狀物的長短與亞基的分子量大小中的形狀象一個長橢圓棒。這種棒狀物的長短與亞基的分子量大小成正比。在電場下，蛋白質(zhì)成正比。在電場下，蛋白質(zhì)-SDS-SDS復合物就會向正極移動，移動的速復合物就會向正極移動，移動的速度與蛋白質(zhì)本身帶是什麼樣的電荷和帶多少電荷無關，只與橢圓棒度與蛋白質(zhì)本身帶是什麼樣的電荷

23、和帶多少電荷無關，只與橢圓棒狀的長短有關，也就是與亞基的分子量的大小有關，利用這一性質(zhì)狀的長短有關，也就是與亞基的分子量的大小有關，利用這一性質(zhì)可以測定蛋白質(zhì)的分子量。可以測定蛋白質(zhì)的分子量。d. d. 聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用 不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它對蛋白不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它對蛋白質(zhì)質(zhì)-SDS-SDS復合物具有阻滯作用。在電場下，分子量大的亞基受阻大，復合物具有阻滯作用。在電場下，分子量大的亞基受阻大，電泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亞基受阻小，電泳速電泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亞基受阻小，

24、電泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)度快，走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分開。開。 (2)(2)操作過程操作過程制膠制膠 加樣加樣 電泳電泳 固定固定 染色染色 脫色脫色 計算計算(3)(3)結(jié)果處理結(jié)果處理a. a. 電泳圖譜電泳圖譜1 2 3b. b. 標準曲線標準曲線繪制標準曲線：以標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)繪制標準曲線：以標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)log(M)log(M)為縱坐標，為縱坐標，RfRf值值為橫坐標，繪制標準曲線。為橫坐

25、標，繪制標準曲線。44.24.44.64.855.200.20.40.60.81mRlgMr兔肌動蛋白牛血清白蛋白兔磷酸化酶牛碳酸酐酶胰蛋白酶抑制劑雞蛋清溶菌酶c.c.未知蛋白分子量計算：未知蛋白分子量計算： 將未知蛋白的將未知蛋白的mRmR值查到值查到log(M)log(M)值，便可知其分子量。計算分子量值，便可知其分子量。計算分子量方法除了用標準曲線法外方法除了用標準曲線法外, ,還可以用比較法和機讀法還可以用比較法和機讀法. .比較法比較法: : 通常標準蛋白的相對位置與未知蛋白的位置進行比較，初步判通常標準蛋白的相對位置與未知蛋白的位置進行比較，初步判斷。這是在發(fā)表論文時常用的表示方法

26、。斷。這是在發(fā)表論文時常用的表示方法。機讀法：機讀法： 用凝膠掃描儀用凝膠掃描儀, ,將凝膠圖譜掃描輸入計算機中，通過影像文件系將凝膠圖譜掃描輸入計算機中，通過影像文件系統(tǒng)處理，便很快得知未知樣品的分子量。但發(fā)表論文時統(tǒng)處理，便很快得知未知樣品的分子量。但發(fā)表論文時, ,仍然要注仍然要注重原始圖譜，經(jīng)計算機處理的圖譜有作假之嫌。重原始圖譜，經(jīng)計算機處理的圖譜有作假之嫌。(4)(4)影響因素影響因素 影響影響SDS-SDS-復合物形成的主要因素。復合物形成的主要因素。SDS-SDS-電泳成敗關之一，是在電泳成敗關之一，是在制備樣品的過程中，蛋白質(zhì)與制備樣品的過程中，蛋白質(zhì)與SDSSDS結(jié)合的程度

27、直接影響電泳分離效結(jié)合的程度直接影響電泳分離效果。影響結(jié)合的因素主要有三個果。影響結(jié)合的因素主要有三個: :A A、溶液中溶液中SDSSDS單體的濃度單體的濃度 SDSSDS在水溶液中以單體和在水溶液中以單體和SDSSDS復合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)復合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)合的只能是單體。單體的濃度與合的只能是單體。單體的濃度與SDSSDS總濃度，溫度和離子強度有關。總濃度，溫度和離子強度有關。在一定溫度和離子強度下，在一定溫度和離子強度下，SDSSDS處于一飽和值，即單體濃度不再隨處于一飽和值，即單體濃度不再隨SDSSDS中濃度增加而增加。為了使中濃度增加而增加。為了使SDSSDS與

28、蛋白質(zhì)結(jié)合充分，與蛋白質(zhì)結(jié)合充分，SDSSDS和蛋白和蛋白質(zhì)結(jié)合的重量比一般是質(zhì)結(jié)合的重量比一般是4:14:1或或3:13:1。B B、樣品緩沖液離子強度樣品緩沖液離子強度 因為因為SDSSDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時SDSSDS單體濃度，單體濃度，而不是總濃度，只有在較低的離子強度溶液中，而不是總濃度，只有在較低的離子強度溶液中，SDSSDS單體才具有較單體才具有較高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應選用低離子強度，通常是高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應選用低離子強度，通常是10-10-100mmol/l100mmol/l之間。之間。C C、二硫鍵是否完全

29、打開二硫鍵是否完全打開 只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被打開，蛋白質(zhì)分子完全解聚，只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被打開，蛋白質(zhì)分子完全解聚，SDSSDS充分與亞基分子結(jié)合，才能準確測定出亞基分子量。二硫鍵完充分與亞基分子結(jié)合，才能準確測定出亞基分子量。二硫鍵完全被打開要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。若蛋白質(zhì)分子的全被打開要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。若蛋白質(zhì)分子的二硫鍵只是部分被打開，這是測出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分二硫鍵只是部分被打開，這是測出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分子的混合物。子的混合物。2.1.22.1.2凝膠排阻層析凝膠排阻層析(1)(1)原理：原理： 凝膠排阻色譜凝膠排

30、阻色譜( Exclusion chromatography)( Exclusion chromatography)，也稱為分子篩層，也稱為分子篩層析、凝膠過濾層析。凝膠排阻色譜介質(zhì)是以不同濃度的凝膠交聯(lián)聚析、凝膠過濾層析。凝膠排阻色譜介質(zhì)是以不同濃度的凝膠交聯(lián)聚合而成的多孔徑的，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球體。在色譜柱內(nèi)不同大小凝膠的合而成的多孔徑的，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球體。在色譜柱內(nèi)不同大小凝膠的孔徑可以通過不同大小的蛋白質(zhì)分子。因此，凝膠排阻色譜介質(zhì)對孔徑可以通過不同大小的蛋白質(zhì)分子。因此，凝膠排阻色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)分子具有排阻作用。在凝膠排阻色譜分離的分離過程中，大蛋白質(zhì)分子具有排阻作用。在凝膠排阻色譜分離的分離

31、過程中，大分子先流出，小分子后流出。分子先流出，小分子后流出。(2)(2)蛋白質(zhì)分子形狀：蛋白質(zhì)分子形狀： 蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性分子。在色譜過程中，大分子不能進入或不能完全進入凝膠內(nèi)部孔分子。在色譜過程中，大分子不能進入或不能完全進入凝膠內(nèi)部孔徑而沿凝膠顆粒之間的空隙向前移動，遷移距離短，最先流出柱外徑而沿凝膠顆粒之間的空隙向前移動，遷移距離短，最先流出柱外來。小分子可以進入凝膠內(nèi)部孔徑慢慢向前移動，遷移距離長，最來。小分子可以進入凝膠內(nèi)部孔徑慢慢向前移動，遷移距離長，最后流出柱外來。線性蛋白質(zhì)分子與球形分

32、子比較，同樣大小分子量后流出柱外來。線性蛋白質(zhì)分子與球形分子比較，同樣大小分子量的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，在凝膠色譜柱中無論是球形分子還是線性分子都可進行分離，但是在凝膠色譜柱中無論是球形分子還是線性分子都可進行分離，但是球形分子比線性分子的分離度好。球形分子比線性分子的分離度好。(3) (3) 凝膠層析介質(zhì)凝膠層析介質(zhì) 凝膠層析介質(zhì)主要有五類凝膠層析介質(zhì)主要有五類Sephadex, BioSephadex, Bio gel, Sepharose, gel, Sepharose, utrol gel,

33、 perfusonutrol gel, perfuson等。等。A A、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠(Sephadex)(Sephadex) 葡聚糖凝膠是以葡聚糖為原料合成的珠狀凝膠，其主要技術指標葡聚糖凝膠是以葡聚糖為原料合成的珠狀凝膠，其主要技術指標介質(zhì)規(guī)格介質(zhì)規(guī)格溶脹體積溶脹體積(ml/mg)球形分子量范圍球形分子量范圍(Da)Sephardex G-102-3700Sephardex G-2541000-5000Sephardex G-5061500-30000Sephardex G-75103000-80000Sephardex G-10015-204000-100000Sephardex

34、G-20020-255000-250000 后面的阿拉伯數(shù)字越大，表示交聯(lián)越小，凝膠孔徑越大，分子量后面的阿拉伯數(shù)字越大，表示交聯(lián)越小，凝膠孔徑越大，分子量分離范圍越大。凝膠的溶脹體積。分離范圍越大。凝膠的溶脹體積。 凝膠性能：凝膠性能： 耐高溫耐高溫100 沸水煮沸水煮 pH范圍范圍pH2 11穩(wěn)定穩(wěn)定 在高鹽濃度下體積易收縮在高鹽濃度下體積易收縮B B、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(Boi(Boi gel)gel) Bio Bio gelgel是由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)制成的球狀凝膠色是由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)制成的球狀凝膠色譜介質(zhì)。根據(jù)溶脹性質(zhì)可分譜介質(zhì)。根據(jù)溶脹性質(zhì)可分Bi

35、oBio gel gel 、P P 2 2、P P 4 4 P P 300300等等1010種。種。其主要技術指標是：其主要技術指標是：介質(zhì)規(guī)格介質(zhì)規(guī)格溶脹體積溶脹體積(ml/mg)球形分子量范圍球形分子量范圍(Da)Bio-gel P-23.8200-2000Bio-gel P-45.8500-4000Bio-gel P-68.81000-5000Bio-gel P-1012.45000-17000Bio-gel P-3014.920000-50000Bio-gel P-6019.030000-70000Bio-gel P-10019.040000-100000Bio-gel P-15024

36、.050000-150000Bio-gel P-20034.080000-300000Bio-gel P-30040.0100000-400000 “P” “P”后面的拉伯數(shù)字越大，表示吸水性越大，凝膠的交聯(lián)度越后面的拉伯數(shù)字越大，表示吸水性越大，凝膠的交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大與小，分子量分離范圍越大與 SephadexSephadex相似。相似。 性能性能 ： 剛性好流速快剛性好流速快 在在pH 2-11pH 2-11的溶液中穩(wěn)定的溶液中穩(wěn)定 高溫下酰胺基易被水解產(chǎn)生羧酸高溫下酰胺基易被水解產(chǎn)生羧酸 對酸、堿性較強的物質(zhì)及芳香族化類合物均用不同程度的吸附。對酸、堿性較強的物質(zhì)及芳香族化

37、類合物均用不同程度的吸附。 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠SepharoseSepharose系列系列 瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖經(jīng)特殊工藝制成的珠狀凝膠，瓊脂糖中凝瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖經(jīng)特殊工藝制成的珠狀凝膠，瓊脂糖中凝膠的結(jié)構(gòu)是氫鍵而不是共價鍵，因此膠的結(jié)構(gòu)是氫鍵而不是共價鍵，因此, ,物理穩(wěn)定性較差。通常把瓊物理穩(wěn)定性較差。通常把瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)浸泡在水溶液中。其主要技術指標是：脂糖凝膠層析介質(zhì)浸泡在水溶液中。其主要技術指標是：型號凝膠濃度(w/v)分子量分離范圍sepharose2B2510515107sepharose4B4210515106sepharose6B651042106sepharos

38、e8B821047105sepharose12B1251035104 阿拉伯數(shù)字后面的阿拉伯數(shù)字后面的B B表示瓊脂糖凝膠的百分濃度，瓊脂糖濃度越大表示瓊脂糖凝膠的百分濃度，瓊脂糖濃度越大表交聯(lián)度越大，表交聯(lián)度越大， 分子量分離范圍越小。與此相反瓊脂糖濃度越小分子量分離范圍越小。與此相反瓊脂糖濃度越小表交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大。表交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大。 性能：性能： 耐溫：耐溫： 交聯(lián)交聯(lián)瓊脂糖凝膠可耐受瓊脂糖凝膠可耐受100100120120 耐酸堿：在耐酸堿：在pH3pH31212范圍內(nèi)穩(wěn)定范圍內(nèi)穩(wěn)定 耐鹽：在耐鹽：在6M6M尿素中穩(wěn)定尿素中穩(wěn)定(4)(4)方法方法介質(zhì)溶脹

39、介質(zhì)溶脹 裝柱裝柱 平衡平衡 上樣上樣 洗脫洗脫 計算分子量計算分子量 分離過程分離過程5) 5) 結(jié)果處理結(jié)果處理a a層析圖譜層析圖譜B B、 標準曲線標準曲線 分子量的測定方法，一般都采用標準曲線法。使用幾種不同分子分子量的測定方法，一般都采用標準曲線法。使用幾種不同分子量的混合標準蛋白，經(jīng)排阻色譜進行分離會得到不同標留值的色譜量的混合標準蛋白，經(jīng)排阻色譜進行分離會得到不同標留值的色譜峰，以分子量的對數(shù)值峰，以分子量的對數(shù)值(lgMr)(lgMr)為縱坐標，以收集體積為縱坐標，以收集體積(ml)(ml)為橫坐標，為橫坐標，繪制標準曲線圖。然后將未知樣的標流體積在準曲線先上查得分子繪制標準

40、曲線圖。然后將未知樣的標流體積在準曲線先上查得分子量。量。、C C、未知蛋白分子量計算未知蛋白分子量計算 將未知蛋白排阻層析的洗脫體積從標準曲線上查到相應的將未知蛋白排阻層析的洗脫體積從標準曲線上查到相應的log(M)log(M)值，便可求出其分子量。值，便可求出其分子量。(6)應注意的問題：應注意的問題：A、樣品、樣品: 前處理前處理: 樣液要進行適當?shù)那疤幚順右阂M行適當?shù)那疤幚? 如離心，沉淀，抽提等如離心，沉淀，抽提等濃度濃度: 樣液濃度不宜太稀樣液濃度不宜太稀組分組分: 樣液組分不宜太多，目標組分與相鄰組分之間的分子量至少樣液組分不宜太多，目標組分與相鄰組分之間的分子量至少要相差要相

41、差 2000以上。以上。B、上樣：、上樣：對組別分離對組別分離: 上樣體積不超過柱床體積的上樣體積不超過柱床體積的30左右左右對組分分離對組分分離: 上樣體積不超過柱床體積的上樣體積不超過柱床體積的1-2左右左右C C、流速流速: : 流速是指在單位面積液體所流過的量，排阻色譜要選擇較理想的流速是指在單位面積液體所流過的量，排阻色譜要選擇較理想的流速才能得到好的結(jié)果，選擇的原則是：流速才能得到好的結(jié)果，選擇的原則是：根據(jù)介質(zhì)顆粒大小選擇根據(jù)介質(zhì)顆粒大小選擇根據(jù)上樣體積根據(jù)上樣體積根據(jù)樣品中的組分多少。根據(jù)樣品中的組分多少。 2.32.3質(zhì)譜法質(zhì)譜法2.3.12.3.1原理：原理： 質(zhì)譜儀是利用

42、電磁學的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進行質(zhì)譜儀是利用電磁學的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進行分離的裝置。離子電離后經(jīng)過加速進入磁場中。其動能與加速電壓分離的裝置。離子電離后經(jīng)過加速進入磁場中。其動能與加速電壓及電荷及電荷Z Z有關。有關。Z Z：電荷數(shù)：電荷數(shù) ZeU=mvZeU=mv2 2/2 e/2 e：電荷：電荷(e = 1.60 x10(e = 1.60 x10-19-19C)C)U U：加速電壓：加速電壓m m：離子的質(zhì)量：離子的質(zhì)量v v：離子被加速后的運動速度：離子被加速后的運動速度 具有速度具有速度v v的帶電離子進入質(zhì)譜儀的電磁場中，根據(jù)所選擇的分的帶電離子進入質(zhì)譜儀的電

43、磁場中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終實現(xiàn)各種離子按離方式，最終實現(xiàn)各種離子按m/zm/z進行分離。進行分離。 根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動態(tài)和靜態(tài)儀器根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動態(tài)和靜態(tài)儀器兩大類，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場，按空間位置來區(qū)別兩大類，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場，按空間位置來區(qū)別m/zm/z不同不同的離子。動態(tài)儀器采用變化的電磁場，按時間不同來區(qū)分的離子。動態(tài)儀器采用變化的電磁場，按時間不同來區(qū)分m/zm/z不同不同 的離子。的離子。 分離生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動態(tài)質(zhì)譜儀?；驹蛛x生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動態(tài)質(zhì)譜儀?；驹硎巧锎蠓肿釉?/p>

44、很高的電場下電離。樣品溶液以很低的流速，在理是生物大分子在很高的電場下電離。樣品溶液以很低的流速，在高的電場下使生物分子從毛細管中流出來。高的電場下使生物分子從毛細管中流出來。2.3.22.3.2方法：方法： 樣品溶液以很低的流速樣品溶液以很低的流速(1-20l/(1-20l/分鐘分鐘) )從毛細管中流出來。在毛從毛細管中流出來。在毛細管的柱頭上施加一個高電壓細管的柱頭上施加一個高電壓(1-5kv)(1-5kv)，是柱頭液體霧化成很細的，是柱頭液體霧化成很細的帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷密度增大。直到產(chǎn)生的

45、庫侖斥與液滴表面張力的雷利極限值相等時，密度增大。直到產(chǎn)生的庫侖斥與液滴表面張力的雷利極限值相等時，液滴就會發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又液滴就會發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又會形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴變得非常小，它的表面的電會形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴變得非常小，它的表面的電荷密度變得非常大，形成很強的電場，并從液滴中解離出帶多電荷荷密度變得非常大，形成很強的電場，并從液滴中解離出帶多電荷的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以正離子或負離子譜上會觀察到譜峰。生物

46、大分子在正離子或負離子譜上會觀察到譜峰。生物大分子在ESIESI譜上往往是譜上往往是一組帶不同的電荷的分子離子峰。一組帶不同的電荷的分子離子峰。2.3.32.3.3結(jié)果結(jié)果2.42.4核磁共振波譜核磁共振波譜 核磁共振波譜核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).NMR).是將具有磁矩的核放入磁場后，用適宜的頻率的電磁波照射，是將具有磁矩的核放入磁場后，用適宜的頻率的電磁波照射，它們就會吸收能量，發(fā)生原子核能級的躍遷，同時產(chǎn)生核磁共振信它們就會吸收

47、能量，發(fā)生原子核能級的躍遷，同時產(chǎn)生核磁共振信號，得到核磁共振波譜。在有機化合物中，經(jīng)常用于號，得到核磁共振波譜。在有機化合物中，經(jīng)常用于1 1H H和和1313C C核的共核的共振吸收波譜。在生物學方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。振吸收波譜。在生物學方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。到目前為止，采用到目前為止，采用1 1H 2D-NMRH 2D-NMR（二維（二維NMRNMR）能解決的最大蛋白質(zhì)分子）能解決的最大蛋白質(zhì)分子量在量在10000Da10000Da左右。如果采用雜核多維左右。如果采用雜核多維NMRNMR技術，能解決的最大蛋白技術，能解決的最大蛋白質(zhì)分子量大在質(zhì)分子量大在2

48、5000Da25000Da左右。左右。6 6幾種測定蛋白質(zhì)分子量方法的比較幾種測定蛋白質(zhì)分子量方法的比較方法方法機理機理分子量計算分子量計算關鍵技術關鍵技術特點特點電泳電泳分子表面電荷分子表面電荷電泳條帶電泳條帶(mR)SDS包裹包裹單鏈分子單鏈分子層析層析分子質(zhì)量分子質(zhì)量層析峰的位置層析峰的位置介質(zhì)交聯(lián)度介質(zhì)交聯(lián)度球形分子球形分子質(zhì)譜質(zhì)譜質(zhì)荷比質(zhì)荷比質(zhì)譜峰直接標識質(zhì)譜峰直接標識樣品質(zhì)子化樣品質(zhì)子化整體分子整體分子核磁核磁核磁共振波譜核磁共振波譜核磁譜線計算核磁譜線計算磁場能量磁場能量整體分子整體分子3 3蛋白質(zhì)的等電點測定技術蛋白質(zhì)的等電點測定技術3.13.1等電聚焦電泳等電聚焦電泳(Iso

49、electrofocusing(Isoelectrofocusing，簡寫，簡寫IEF)IEF)3.1.13.1.1原理原理 通常是指聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。它是通常是指聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。它是6060年代初建立起來年代初建立起來的一種蛋白質(zhì)分離手段，現(xiàn)在已經(jīng)成為單向蛋白質(zhì)電泳分辨率最高的一種蛋白質(zhì)分離手段，現(xiàn)在已經(jīng)成為單向蛋白質(zhì)電泳分辨率最高的一種分離技術，其分辨率可以達到的一種分離技術，其分辨率可以達到0.010.01個個pHpH值，有的文獻報道可值，有的文獻報道可以達到以達到0.0010.001個個pHpH值。它是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電值。它是利用蛋白質(zhì)分子或其它

50、兩性分子的等電點的差異進行電泳分離和分析。蛋白質(zhì)在一個穩(wěn)定的線性點的差異進行電泳分離和分析。蛋白質(zhì)在一個穩(wěn)定的線性pHpH梯度的梯度的凝膠中電泳，蛋白質(zhì)朝著與自身電荷相反的方向移動，在移動的過凝膠中電泳，蛋白質(zhì)朝著與自身電荷相反的方向移動，在移動的過程中不斷被凝膠中的反離子中和，最后靜電荷完全被中和而停止運程中不斷被凝膠中的反離子中和，最后靜電荷完全被中和而停止運動，聚焦在等電點的位置。動，聚焦在等電點的位置。3.1.23.1.2蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì)(1)(1)載體兩性電解質(zhì)：載體兩性電解質(zhì)： 在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具有以下兩種功能：在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具

51、有以下兩種功能：A 中和功能：中和功能： 兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在分離系統(tǒng)中形成一個平衡穩(wěn)定的兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在分離系統(tǒng)中形成一個平衡穩(wěn)定的pHpH梯度，提梯度，提供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有pHpH緩沖能。緩沖能。B 載電功能：載電功能： 兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運載兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運載“電流電流”的能力，有良好的能力，有良好的導電性能的導電性能(2)(2)蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的pHpH環(huán)境中所帶的正負電荷環(huán)境中所帶的正負電荷不同。若在某特定的不同。若在某特定的pHpH環(huán)境中其凈

52、電荷為零，此時的環(huán)境中其凈電荷為零，此時的pHpH為該蛋白質(zhì)為該蛋白質(zhì)的等電點，在電場下不泳動。的等電點，在電場下不泳動。3.1.33.1.3載體兩性電解質(zhì)分類及載體兩性電解質(zhì)分類及pHpH范圍范圍 根據(jù)建立根據(jù)建立pHpH梯度的原理的不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)梯度的原理的不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)pHpH梯度梯度(Carrier Ampholytes pH Gradient)(Carrier Ampholytes pH Gradient)和固相和固相pHpH梯度梯度(Immobilized (Immobilized pH Gradient)pH Gradient)。前者是在電場中通過兩性

53、緩沖離子建立。前者是在電場中通過兩性緩沖離子建立pHpH梯度，后梯度，后者將緩沖基團作為凝膠介質(zhì)的一部分，分辨率比前者高一個數(shù)量級。者將緩沖基團作為凝膠介質(zhì)的一部分，分辨率比前者高一個數(shù)量級。 名名 稱稱產(chǎn)產(chǎn) 家家組組 成成分子范圍分子范圍pH范圍范圍AmpholinePharmacia (LKB)脂肪族多氨基脂肪族多氨基,多多羧基的異構(gòu)體和羧基的異構(gòu)體和同系物組成同系物組成1000-6000Da2.5-4.5 4-6.5 5-8.0 3.5-9.5PharmalytePharmacia七氨基多羧基七氨基多羧基1000-15000Da2.5-5 4-5.55-8.0 8-10 3-10Serv

54、alyteServa丙烯基乙胺與乙丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合烯基亞胺縮合800-1200Da2-4.04-6.0 6-8.0 2-11 載體兩性電載體兩性電解質(zhì)解質(zhì)國產(chǎn)國產(chǎn)脂肪族的多氨基脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體多羧基的異構(gòu)體和同系物組成和同系物組成800-1200 Da3-9.5 3.5-5.54.0-6.0 6.0-9.0 7.0-103.1.43.1.4電極液電極液根據(jù)不同的根據(jù)不同的pHpH范圍范圍, ,選用不同的電極液選用不同的電極液, ,見下表見下表pH范圍范圍陽極電極液陽極電極液陰極電極液陰極電極液3.5-9.51mol/L 磷酸磷酸1 mol/L NaOH2.5-4.51

55、mol/L磷酸磷酸0.4M HEPES4.0-6.50.5 mol/L 醋酸醋酸0.5 mol/L NaOH5.0-8.00.5 mol/L 醋酸醋酸0.5mol/L NaOH2.5-4.01 mol/L 磷酸磷酸2%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH6-83.5-5.21 mol/L 磷酸磷酸2%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH5-74.5-7.01 mol/L 磷酸磷酸1 mol/L NaOH5.5-7.72%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH4-61 mol/L NaOH6.0-8.52%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH4-61 mol/L NaOH7.8-102%兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì) pH4-61 mol/L N

56、aOH3.1.53.1.5方法方法制膠制膠 加樣加樣 電泳電泳 固定固定 染色染色 脫色脫色 計算計算3.1.6 pH3.1.6 pH值測定值測定(1)(1)標準曲線法：標準曲線法： 標準樣品參照，繪制標準曲線標準樣品參照，繪制標準曲線(2)(2)微電極法：微電極法： 微電極直接測定微電極直接測定3.23.2聚焦層析聚焦層析(chromatofocusing)(chromatofocusing)3.2.13.2.1原理原理(1)pH(1)pH梯度的形成梯度的形成 一般的離子交換色譜中，一般的離子交換色譜中，pHpH梯度的產(chǎn)生，通常利用梯度的產(chǎn)生，通常利用pHpH梯度混合器梯度混合器來制造連續(xù)的

57、來制造連續(xù)的pHpH梯度。而聚焦色譜則是利用離子交換劑本身的帶電梯度。而聚焦色譜則是利用離子交換劑本身的帶電基團的緩沖作用形成梯度。當洗脫緩沖液通過聚焦離子交換介質(zhì)時，基團的緩沖作用形成梯度。當洗脫緩沖液通過聚焦離子交換介質(zhì)時，就會自動形成就會自動形成pHpH梯度。在高梯度。在高pHpH緩沖液的平衡，使色譜柱內(nèi)的介質(zhì)均緩沖液的平衡，使色譜柱內(nèi)的介質(zhì)均處于堿性條件，帶有電負性的堿性基團，根據(jù)載體兩性電解質(zhì)的等處于堿性條件，帶有電負性的堿性基團，根據(jù)載體兩性電解質(zhì)的等電點不同，所帶的電荷有差異而形成電點不同，所帶的電荷有差異而形成pHpH梯度。梯度。(2)(2)聚焦效應聚焦效應 當一種蛋白質(zhì)在色譜

58、柱內(nèi)隨洗脫液前移至接近其當一種蛋白質(zhì)在色譜柱內(nèi)隨洗脫液前移至接近其pIpI處時處時, ,此時的此時的移動速度明顯減慢。如果同樣的組分第二次加樣，起初它帶負電荷移動速度明顯減慢。如果同樣的組分第二次加樣，起初它帶負電荷, ,向正電荷向正電荷( (低低pH)pH)方向移動速度快，直至追上慢速移動的第一次加樣方向移動速度快，直至追上慢速移動的第一次加樣的組分，而聚焦到一起，然后兩次加樣的同一組分一起前移，直至的組分，而聚焦到一起，然后兩次加樣的同一組分一起前移，直至停留在停留在pIpI處。處。3.2. 2 3.2. 2 聚焦介質(zhì)聚焦介質(zhì) 聚焦介質(zhì)是以交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為載體合成的聚焦介質(zhì)是以交聯(lián)的瓊脂

59、糖凝膠為載體合成的, ,具有凝膠介質(zhì)的具有凝膠介質(zhì)的基本特性，也有兩性電解質(zhì)的特性。目前用的較多主要基本特性，也有兩性電解質(zhì)的特性。目前用的較多主要(1)PBE118(1)PBE118偏堿性介質(zhì)偏堿性介質(zhì)(2)PBE94(2)PBE94偏中性介質(zhì)偏中性介質(zhì)3.2.33.2.3緩沖液緩沖液(1)(1)緩沖液分類緩沖液分類a.a.起始緩沖液起始緩沖液(start buffer)(start buffer)， 如：乙醇胺如：乙醇胺-HCl-HClb.b.樣品緩沖液樣品緩沖液(sample buffer), (sample buffer), 如：如：Tris-HAcTris-HAcc.c.洗脫緩沖液洗

60、脫緩沖液(eluting buffer), (eluting buffer), 如：如： polybuffer 96-HClpolybuffer 96-HCl(1)(1)始緩沖液及洗脫緩沖液的配制方法始緩沖液及洗脫緩沖液的配制方法介質(zhì)介質(zhì)pH范圍范圍起始緩沖液起始緩沖液PBE118(pH10.5-7)三乙胺三乙胺-HCl pH11.0PBE 94(pH9-6)乙醇胺乙醇胺-HCl pH9.4PBE 94(pH8-5)Tris-HCl pH8.3PBE 94(pH7-4)咪唑咪唑-HAc pH7.4PBE 94(pH6-4)組氨酸組氨酸-HCl pH6.2PBE 94(pH5-4)哌嗪哌嗪-HC