細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)講義

1、2007-9-10Bitab1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)講講 義義北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司2007年9月2007-9-10Bitab2目 錄一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論-3二、 BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備-24三、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)技術(shù)-281，鱟試劑靈敏度復(fù)核-332，干擾初篩試驗(yàn)-403，干擾試驗(yàn)-494，檢查法-62四、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展2007-9-10Bitab3一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的基礎(chǔ)理論1，細(xì)菌內(nèi)毒素2，鱟試劑3，BET用水4，BET程序5，2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法6，相關(guān)參數(shù)的計(jì)算7，試驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)2007-9-10Bitab41、細(xì)菌內(nèi)毒素、細(xì)菌內(nèi)毒素1

2、1）化學(xué)成分及特性）化學(xué)成分及特性 - - 革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物 - - 是高分子量脂多糖復(fù)合物（是高分子量脂多糖復(fù)合物（LPSLPS） 除上述性質(zhì)外，除上述性質(zhì)外，LPS還有許多其他的生物活性還有許多其他的生物活性致熱致熱性性耐熱耐熱性性酸堿性酸堿性與鱟試劑反應(yīng)與鱟試劑反應(yīng)分子極性分子極性需要在需要在250攝氏度干熱至少攝氏度干熱至少3060分鐘才能徹底滅分鐘才能徹底滅活活多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性，多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性，在水中呈不均勻分布在水中呈不均勻分布內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原性熱原，內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原性熱原，再

3、刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)與鱟試劑發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng)，形成凝與鱟試劑發(fā)生多級(jí)酶促反應(yīng)，形成凝膠膠與強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解反應(yīng)與強(qiáng)酸強(qiáng)堿水解反應(yīng)（1 1）特性特性2007-9-10Bitab5內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)內(nèi)毒素的分子結(jié)構(gòu)（2）化學(xué)結(jié)構(gòu) - 含有3個(gè)截然不同的區(qū)域O- 特異側(cè)鏈核心多糖類脂A2007-9-10Bitab62） 內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系 - 內(nèi)毒素是熱原之一種- 醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點(diǎn)是，內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原，控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱原污染。3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素經(jīng)

4、人工提取精制并經(jīng)生物效價(jià)測(cè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為BET檢查的參考品或?qū)φ掌?。主要分參考?biāo)準(zhǔn)品（RSE）及工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。CSE的效價(jià)必須用RSE來(lái)標(biāo)化。目前CSE的效價(jià)有兩種標(biāo)示方法：固定效價(jià)法（中國(guó)）及浮動(dòng)效價(jià)法（國(guó)際）。2）環(huán)境內(nèi)毒素天然產(chǎn)生的內(nèi)毒素，普遍存在于水、空氣及各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和其他雜質(zhì)，其極性不明顯，致熱性較標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素弱。BET的對(duì)象是環(huán)境內(nèi)毒素。2007-9-10Bitab74）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備溶液）的制備1）中國(guó)藥典）中國(guó)藥典2005年版的年版的BET法規(guī)定，將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)法規(guī)定，將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)

5、準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后，需在旋渦混合器上混勻準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解后，需在旋渦混合器上混勻15分鐘，以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻分鐘，以后每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘，秒鐘，其他國(guó)家藥典都有類似要求其他國(guó)家藥典都有類似要求- 具有極性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布具有極性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布2007-9-10Bitab82、鱟試劑1 1）鱟試劑的分類）鱟試劑的分類 - 根據(jù)鱟的種類分類 美洲鱟試劑(LAL) 中國(guó)鱟試劑或東方鱟試劑（TAL） - 根據(jù)檢查方法分類 凝膠法鱟試劑 光度法鱟試劑 - 根據(jù)鱟試劑的反應(yīng)特異性分類 普通鱟試劑 特異型鱟試劑

6、2007-9-10Bitab92 2）鱟試劑的規(guī)格）鱟試劑的規(guī)格 - 一般分單次試驗(yàn)試劑和多次試驗(yàn)試劑（也稱大裝量試劑）- 把自身的包裝容器作為反應(yīng)管的試劑稱為單次試驗(yàn)試劑，在國(guó)內(nèi)使用的0.1ml/支的鱟試劑就屬于單次試驗(yàn)試劑- 多次試驗(yàn)試劑有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用時(shí)應(yīng)先用相應(yīng)量的溶解液復(fù)溶鱟試劑。2007-9-10Bitab103 3）鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) - 靈敏度靈敏度 定義：再細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生凝集的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的最低濃度，單位EU/ml。 常用鱟試劑的靈敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.0

7、6EU/ml、0.03EU/ml- 自身凝集自身凝集 部頒標(biāo)準(zhǔn)，鱟試劑的陰性對(duì)照在37度4小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)- 緩沖能力緩沖能力- 干燥失重干燥失重- 無(wú)菌無(wú)菌：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)此項(xiàng)要求2007-9-10Bitab114）鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理）鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)理C因子因子活化的活化的C因子因子內(nèi)毒素內(nèi)毒素活化的活化的B因子因子B因子因子凝固酶凝固酶凝固酶原凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原凝固蛋白原葡聚糖或葡聚糖或LAL-RM活化的活化的G因子因子G因子因子二價(jià)陽(yáng)離子二價(jià)陽(yáng)離子AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH

8、pNA405nm測(cè)吸光度值（對(duì)硝基苯胺 黃色）2007-9-10Bitab123、BET用水2000年版藥典要求，BET用水應(yīng)為與0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在371條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。2005年版藥典要求，凝膠法BET用水應(yīng)為內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水；光度測(cè)定法用的BET用水內(nèi)毒素含量應(yīng)少于0.005EU/ml。美國(guó)藥典要求的BET用水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應(yīng)的滅菌注射用水或其他水。2007-9-10Bitab134、BET程序1）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)z法凝膠法光度測(cè)定法光度測(cè)定法2）檢查法 凝膠法凝膠法光度測(cè)定法 動(dòng)態(tài)法動(dòng)態(tài)法 終點(diǎn)法終

9、點(diǎn)法：終點(diǎn)比色法試驗(yàn)靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)?zāi)z限量試驗(yàn) 凝膠半定量試驗(yàn) 動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)動(dòng)態(tài)比色法試驗(yàn)動(dòng)態(tài)終點(diǎn)法動(dòng)態(tài)終點(diǎn)法2007-9-10Bitab145、中國(guó)藥典2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法1 1）綜述部分）綜述部分細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的定義及BET方法學(xué)分類內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品及檢查用水BET器具的要求供試品溶液的要求內(nèi)毒素限值的確定最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算2007-9-10Bitab15 2 2）試驗(yàn)部分）試驗(yàn)部分（1 1）凝膠法）凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法（2 2）光度測(cè)定法）光度測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法3 3）20052005年版藥典年版藥

10、典BETBET法際驗(yàn)部分主要內(nèi)容法際驗(yàn)部分主要內(nèi)容凝膠限量試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)2007-9-10Bitab16鱟 試 驗(yàn) 方 法凝膠法光度測(cè)定法限量法半定量法動(dòng)態(tài)法終點(diǎn)法動(dòng) 態(tài)濁度法動(dòng) 態(tài)顯色法終 點(diǎn)濁度法終 點(diǎn) 顯色法靈敏度以標(biāo)示靈敏度表示以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度表示預(yù)試驗(yàn)1靈敏度復(fù)核試驗(yàn)各濃度平行4管, NC 2管標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證試驗(yàn)各濃度平行3管，NC 2管有效條件D陰性0.5c2 | |0.980 TDTC（對(duì)動(dòng)態(tài)法而言）預(yù)試驗(yàn)2干擾試驗(yàn)干擾試驗(yàn)無(wú)干擾條件A、D陰性 0.5Es2 0.5EsEt2Es | |0.980 50%R200%TDTC檢查法A、B、C、D各平行2管(共8管) A、B、C、

11、D各平行2管(共12管)有效條件 B、C陽(yáng)性 D陰性 | |0.980 50%R200%TDTC2007-9-10Bitab17 1 1）內(nèi)毒素限值）內(nèi)毒素限值 （1）藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性單位)表示；K為人每公斤體重每小時(shí)科接受的最大內(nèi)毒素劑量，以EU/(kgh)表示，注射劑K=5 EU/(kgh),放射性藥品注射劑K=2 EU/(kgh),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kgh), M為人每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)、 U/(kgh)表示，人均體重

12、按60Kg計(jì)算，注射試劑若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。6、相關(guān)參數(shù)的計(jì)算2007-9-10Bitab18（2 2）內(nèi)毒素限值計(jì)算舉例）內(nèi)毒素限值計(jì)算舉例 - 注射用的頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑量為1500mg/次 L= =0.20EU/mg - 注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為2.0至8.0g，分3至4次給藥，一日最高劑量不超過(guò)12g L= =0.075EU/mg - 對(duì)于大輸液（LVP）,美國(guó)藥典（USP）通常都取L值為0.5EU/ml 5 EU/(kgh)1500 mg/(60kgh)5 EU/(kgh)(12000mg/3) / (60kgh)2007-9-10Bitab192 2

13、）最大有效稀釋倍數(shù)）最大有效稀釋倍數(shù) - 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按以下公式計(jì)算 MVD=CL/ C為供試品溶液的濃度，其中當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí),C的單位為mg/ml或 U/ml。凝膠發(fā)中，為鱟試劑的靈敏度光度測(cè)定法中，為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度- 如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉（濃度為10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀釋倍數(shù)為 MVD= =8 (倍)10mg/ml x 0.2EU/mg0.25EU/ml2007-9-10Bitab203 3）最低有效稀釋濃度）最低有效稀釋濃度(MVC)(

14、MVC) - MVC=/ L - 如使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴鈉的最低有效濃度為 MVC= = 1.25mg/ml4) 4) 樣品稀釋過(guò)程中加液量的計(jì)算樣品稀釋過(guò)程中加液量的計(jì)算 - 稀釋過(guò)程中，假設(shè)從溶液S1?。▁）ml溶液稀釋（n）倍至S2，加液量為（y）,則滿足： y= (n-1) X x - 如從溶液S1取0.5ml稀釋3.8倍至S2,則加液量為： y=(3.8-1) X 0.5=1.4ml 即0.5ml的S1加1.4ml稀釋液即得S1的3.8倍稀釋液S20.20EU/mg0.25EU/ml2007-9-10Bitab217、試驗(yàn)相關(guān)知識(shí)1) 1) 內(nèi)毒

15、素標(biāo)準(zhǔn)品的使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的使用（1 1）復(fù)溶）復(fù)溶 - 復(fù)溶2ml安瓿裝的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，為了避免溶液再混合時(shí)溢出安瓿，我們建議在安瓿頸部上方開口加液。復(fù)溶液的體積一般為1ml,或根據(jù)使用說(shuō)明書加液。（2 2）效價(jià)）效價(jià)- 廠家必須向用戶提供一份效價(jià)分析證書（Certificate of Analysis,CoA）效價(jià)分析證書應(yīng)注明：RSE/CSE _EU/mg; _ng/瓶2007-9-10Bitab222) 2) 鱟試劑的使用鱟試劑的使用 - 使用前，應(yīng)將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其大道室溫溫度鱟再?gòu)?fù)溶使用 - 復(fù)溶鱟試劑鱟，應(yīng)避免強(qiáng)烈振動(dòng)產(chǎn)生泡沫 - 由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的不可逆性，反

16、應(yīng)過(guò)程中必須避免反應(yīng)試管的振動(dòng)造成假陽(yáng)性3）內(nèi)毒素的清除）內(nèi)毒素的清除（1） 沖洗沖洗適用于器械組件、塞子等可用于加熱等方法提高清除效率（2）蒸餾）蒸餾，折流系統(tǒng)和地心引力阻止大分子量的LPS轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝麪顟B(tài)逸出（3）反滲）反滲透 （4） 超濾 （5）活性炭吸附2007-9-10Bitab234）內(nèi)毒素的滅活）內(nèi)毒素的滅活（1 1） 酸酸/ /堿水解堿水解（2 2）氧化）氧化 - H2O2（3 3）干熱）干熱 - 250，30分鐘的干烤2007-9-10Bitab24二、BET試驗(yàn)前的準(zhǔn)備1. 在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)中，凡是與試驗(yàn)樣品或試劑接觸的器具必須經(jīng)過(guò)除熱原處理。n玻璃器皿一般用洗液浸泡4小

17、時(shí)后，用自來(lái)水沖洗，再用真餾水沖洗、晾干。最后在280干烤至少120分鐘。2007-9-10Bitab252. 試驗(yàn)所試用的器具主要包括有：n無(wú)熱原稀釋管n無(wú)熱原玻璃移液管n無(wú)熱原玻璃毛細(xì)管n稀釋試管架n安瓿試管架n反應(yīng)試管架n可調(diào)移液器n連接膠粒n無(wú)熱原吸頭n安瓿開啟器n70%的異丙醇浸泡的無(wú)紡布拭布2007-9-10Bitab263. 實(shí)驗(yàn)中也可用一次性的無(wú)熱原塑料器械。n如用可調(diào)移液器和無(wú)熱原吸頭代替無(wú)熱院玻璃移液管取液等。n在使用可調(diào)移液器連接無(wú)熱原毛細(xì)管吸取微量溶液時(shí)，采用多吸少打方式。避免由于毛細(xì)管的虹吸作用帶來(lái)的加樣誤差；也可避免微量加樣時(shí)產(chǎn)生氣泡。2007-9-10Bitab2

18、74. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)的恒溫反應(yīng)在37的恒溫器中進(jìn)行。nTAL-40型試管恒溫儀（安度斯設(shè)計(jì)生產(chǎn)），專門用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的恒溫儀器。具有A, 溫度穩(wěn)定；B, 加熱均勻；C, 定時(shí)報(bào)警等特點(diǎn)2007-9-10Bitab28三、凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)1，凝膠法，凝膠法BET試驗(yàn)程序試驗(yàn)程序2，試驗(yàn)器具，試驗(yàn)器具3，鱟試劑靈敏度復(fù)核，鱟試劑靈敏度復(fù)核4，干擾初篩試驗(yàn)，干擾初篩試驗(yàn)5，干擾試驗(yàn)，干擾試驗(yàn)6，檢查法，檢查法2007-9-10Bitab291、凝膠法、凝膠法BET的實(shí)驗(yàn)程序的實(shí)驗(yàn)程序1）試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)用具等）試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)用具等2）確定供試品的內(nèi)毒素限值（）

19、確定供試品的內(nèi)毒素限值（L）3）選擇鱟試劑（）選擇鱟試劑（）4）計(jì)算供試品的最大有效稀釋（）計(jì)算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度）或最低有效濃度（MVC）5）鱟試劑靈敏度復(fù)核）鱟試劑靈敏度復(fù)核6）供試品干擾初篩試驗(yàn)（建議試驗(yàn)）供試品干擾初篩試驗(yàn)（建議試驗(yàn)）7）供試品干擾驗(yàn)證試驗(yàn)）供試品干擾驗(yàn)證試驗(yàn)8）供試品日常檢查）供試品日常檢查2007-9-10Bitab302、試驗(yàn)器具、試驗(yàn)器具1）器具的要求及處理器具的要求及處理-玻璃器皿需除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，玻璃器皿需除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后250至

20、少干烤至少干烤1小時(shí)小時(shí) -塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械 -首選首選硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2）孵育反應(yīng)儀器）孵育反應(yīng)儀器q溫度精確：溫度精確：37370.2 0.2 q發(fā)熱均勻：發(fā)熱均勻：0.1 0.1 q可定時(shí)提示：可定時(shí)提示：0 0至至9090分鐘可設(shè)定定時(shí)蜂鳴提示分鐘可設(shè)定定時(shí)蜂鳴提示q試管免封口試管免封口2007-9-10Bitab313 、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)1）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)?zāi)康模c試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)?zāi)康?）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條

21、件是否滿足）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條件是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求實(shí)驗(yàn)的要求2）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求實(shí)驗(yàn)的要求 3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET用水等）是否滿足用水等）是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要實(shí)驗(yàn)的要求求2）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)的步驟）鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)的步驟1）恒溫儀器預(yù)熱）恒溫儀器預(yù)熱2）C溶液（標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液）的制備溶液（標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液）的制備3）鱟試劑制備）鱟試劑制備4）加樣及恒溫反應(yīng)）加樣及恒溫反應(yīng)5）結(jié)果判斷）結(jié)果判斷6）數(shù)據(jù)處理）數(shù)據(jù)處理2007-9-10Bitab32

22、稀釋為稀釋為2、0.5、0.25內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液C溶液反應(yīng)：溶液反應(yīng)：0.1mlTAL0.1mlCSE(RSE)，平行，平行4管管D溶液反應(yīng)：溶液反應(yīng)：0.1mlTAL0.1mlBET水，平行水，平行2管管單次管：原安瓿單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管多次管：反應(yīng)試管輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合每步稀釋于旋渦混合器混合30s旋渦混合器混合旋渦混合器混合15min混勻混勻混合混合BET水復(fù)溶水復(fù)溶BET水復(fù)溶水復(fù)溶RSE或或CSE鱟試劑鱟試劑TAL371，60min60min2min2min混勻（水浴恒溫需封口）混勻（水浴恒溫需封口）3）操作步驟示意圖）操作

23、步驟示意圖2007-9-10Bitab334）靈敏度復(fù)核試驗(yàn)舉例）靈敏度復(fù)核試驗(yàn)舉例 (1) 試劑試劑試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.25EU/ml18內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯50ml/瓶 0.003EU/ml12007-9-10Bitab34（2）實(shí)驗(yàn)前，將恒溫儀器預(yù)熱至）實(shí)驗(yàn)前，將恒溫儀器預(yù)熱至37（3）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液（C溶液）的制備溶液）的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水水1.0ml10EU/ml0.4ml3.

24、6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml2007-9-10Bitab35（4）鱟試劑的準(zhǔn)備）鱟試劑的準(zhǔn)備取0.1ml裝量，靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對(duì)照溶液D兩支，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列： 用精確移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解0.5U/ml陰性對(duì)照溶液D0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml2007-9-10Bitab36CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1m

25、l0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlNC0.1ml（5）加）加 樣樣 用精確移液器分別吸取0.1ml的0.06EU/ml、 0.125EU/ml、 0.25EU/ml、0.5EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，加入已復(fù)溶的鱟試劑中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外兩支鱟試劑內(nèi)，作為陰性對(duì)照。加樣順序一般從低濃度到高濃度2007-9-10Bitab37（6 6）恒溫反應(yīng)）恒溫反應(yīng) - - 將加樣完的混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），將加樣完的混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），放入放入37371 1 的恒溫

26、器中孵育的恒溫器中孵育60602 2分鐘（孵育過(guò)程中分鐘（孵育過(guò)程中避免振動(dòng)影響凝膠形成）避免振動(dòng)影響凝膠形成） -若保溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將若保溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。的反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染。的混合液需封口后再將其放入水浴中恒溫反應(yīng)混合液需封口后再將其放入水浴中恒溫反應(yīng)2007-9-10Bitab38 （6）結(jié)果判斷）結(jié)果判斷將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為凝膠，并且凝膠不變形、

27、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為“”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為記錄為“- -”。 陽(yáng)性陽(yáng)性陰性陰性結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180 陽(yáng)性陽(yáng)性(+)(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性陰性(-)(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實(shí)驗(yàn)符合要求的基本條件：實(shí)驗(yàn)符合要求的基本條件： NCNC管全部陰性管全部陰性 （）（） 22管全部陽(yáng)性管全部陽(yáng)性 （）（） 0.250.25管全部陰性管全部陰性 （）（）2007-9-10Bit

28、ab39（7）數(shù)據(jù)處理）數(shù)據(jù)處理c =lg-1（X/4） =lg-1(0.903)(0.602)(0. 602)(0. 602)/4 = 0.210EU/ml 即在本批號(hào)鱟試劑的復(fù)核靈敏度（即在本批號(hào)鱟試劑的復(fù)核靈敏度（ c ）為）為0.21EU/ml 藥典要求：藥典要求：c在在0.5 2.0（包括包括0.5和和22）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度值。為該批鱟試劑的靈敏度值。結(jié)論：本批結(jié)論：本批TALTAL的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定，按標(biāo)示值使用的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定，按標(biāo)示值使用! ! 平平行行管管C溶液溶液(EU/ml

29、)D溶溶液液反應(yīng)終反應(yīng)終點(diǎn)濃度點(diǎn)濃度X（lg反應(yīng)終反應(yīng)終點(diǎn)濃度）點(diǎn)濃度）0.50.250.1250.0610.1250.90320.250. 60230.250. 60240.250. 6022007-9-10Bitab404、干擾初篩試驗(yàn)1 1）目的及原理：）目的及原理： -本試驗(yàn)是藥品與鱟試劑相容性的篩選試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)一系列含2內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無(wú)干擾的濃度。 -本試驗(yàn)可減少干擾試驗(yàn)的盲目性2 2）試驗(yàn)步驟）試驗(yàn)步驟 供試品限值的確定供試品限值的確定 供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定 試劑的選擇試劑的選擇 反應(yīng)溶液的制備反應(yīng)溶液的制

30、備 加樣及反應(yīng)加樣及反應(yīng) 結(jié)果判斷結(jié)果判斷2007-9-10Bitab41 （1）供試品限值）供試品限值 -硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； -藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U（2）最大有效稀釋倍數(shù)的確定）最大有效稀釋倍數(shù)的確定 -最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/； -使用=0.5EU/ml靈敏度的鱟試劑時(shí)， MVD0.5= =20 倍 -由此可計(jì)算出使用不同時(shí)所對(duì)應(yīng)的MVD:3) 干擾初篩試驗(yàn)舉例干擾初篩試驗(yàn)舉例20000U/ml x 0.5EU/1000U0.5EU/ml2007-9-10Bitab42 靈敏度（EU/ml）0.50.250.1250.0

31、60.03對(duì)應(yīng)的MVD(倍)204080160320 -由此可計(jì)算出使用不同時(shí)所對(duì)應(yīng)的MVD:（3）試劑）試劑試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.25EU/ml24內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯50ml/瓶 0.003EU/ml12007-9-10Bitab43 （4）各反應(yīng)溶液的制備）各反應(yīng)溶液的制備 溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容 S20 E2 S40 E2 S80 E2 S160 E2 S320 E2 E2 平行管2007-9-10Bitab44溶液溶液

32、C的制備的制備E100 E10 E1 E0.5溶液溶液A的制備的制備S原液 S10 S20 S40 S80 S160 S3203.6ml W3.6ml W0.5ml0.4ml0.5ml W3.6ml W0.4ml1.4ml0.4ml1.4ml1.4ml1ml1.4ml1.4ml W 1ml W1.4ml W1.4ml W1.4ml W溶液C: E 2 溶液A2007-9-10Bitab45溶液溶液B的制備的制備E1 E1 E1 S20 E0.5 S40 E0.5 S80 E0.5 S10 S20 S40 E1 E1 S160 E0.5 S320 E0.5S80 S160 注意事項(xiàng)：制備溶液C和

33、B時(shí)，每一步的混合液需在旋渦混合器上混合至少30秒 0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-10Bitab46 （5）加樣及反應(yīng)加樣及反應(yīng) 用移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水將鱟試劑復(fù)溶 取0.1ml相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管 另外取0.1mlBET水作為陰性對(duì)照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管2007-9-10Bitab47 （4）結(jié)果判斷）結(jié)果判斷 溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容 S20 E2 S40 E2 S80 E2 S160 E2 S3

34、20 E2 E2 平行管-+-+-+-2007-9-10Bitab48-當(dāng)溶液當(dāng)溶液A A、D D均為陰性；溶液均為陰性；溶液C C均為陽(yáng)性時(shí)，試均為陽(yáng)性時(shí)，試驗(yàn)有效。驗(yàn)有效。-溶液溶液B B系列中，第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的濃度即系列中，第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無(wú)干擾濃度。本試驗(yàn)初步將其判斷為樣品的無(wú)干擾濃度。本試驗(yàn)中的樣品無(wú)干擾濃度為中的樣品無(wú)干擾濃度為S S40402007-9-10Bitab49 5 、干擾試驗(yàn) - 通過(guò)比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來(lái)確定供試品在該濃度下是否對(duì)BET檢查有干擾。 - 至少對(duì)3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。 1）試驗(yàn)步驟：

35、）試驗(yàn)步驟： - 供試品限值的確定。 - 鱟試劑的選擇 - 最大有效稀釋倍數(shù)的確定 - 反應(yīng)溶液的制備 - 加樣及反應(yīng) - 結(jié)果判斷2007-9-10Bitab50何種情況下要做干擾試驗(yàn)？何種情況下要做干擾試驗(yàn)？ 干擾試驗(yàn)是一個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)干擾試驗(yàn)是一個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)新品種建立新品種建立BET方法方法鱟試劑的來(lái)源改變鱟試劑的來(lái)源改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的來(lái)源改變供試品的來(lái)源改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變?cè)囼?yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗(yàn)試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化結(jié)果的變化2007-9-10Bitab51 （1 1）

36、供試品限值）供試品限值 - 硫酸慶大霉素，20000U/ml； 藥典要求內(nèi)毒素限值L=0.5EU/1000U（2 2）試劑選擇）試劑選擇試劑名稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.125EU/ml36內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng（CoA）1BET水 安度斯25ml/瓶 0.003EU/ml12007-9-10Bitab52 - 根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果，供試品在40倍稀釋（對(duì)應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml）時(shí)無(wú)干擾。 - 一般不選擇第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的供試品濃度作干擾試驗(yàn)。本試驗(yàn)我們選擇靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。（

37、3 3）最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算）最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算 MVD = cL/ =80（倍） MVD- = 80(倍) 20000U/ml X 0.5EU/1000U0.125EU/ml2007-9-10Bitab53 （4）各反應(yīng)溶液的制備）各反應(yīng)溶液的制備 溶液編號(hào)溶液編號(hào)B BA A溶液內(nèi)容溶液內(nèi)容S S80 80 E E0.250.25 S S80 80 E E0.1250.125 S S80 80 E E0.060.06 S S80 80 E E0.030.03S S8080平平行行管管溶液編號(hào)溶液編號(hào)C CD D溶液內(nèi)容溶液內(nèi)容E E0.250.25 E E0.1250.125 E E

38、0.060.06 E E0.030.03 w平平行行管管2007-9-10Bitab54 溶液溶液C的制備的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min1.8ml100EU/ml0.4mlCSEBET水水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml1.8ml3.6ml1.8ml1.8ml0.125EU/ml30s1.8ml1.8ml0.06EU/ml30s1.8ml1.8ml2007-9-10Bitab55 溶液溶液A的制備（供試品的制備（供試品的稀釋）的稀釋）硫酸慶大霉素注射液0.3ml20000U/ml0.6ml1.0mlBET水水3.0ml2.7ml1:1

39、01:400.6ml1:80S10S40S802007-9-10Bitab56 溶液溶液B的制備的制備E0.5 E0.25 S80 E0.25 S80 E0.125 S40 S40 E0.125 E0.0625 S80 E0.0625 S80 E0.03125S40 S40 0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-10Bitab57 （5 5）加樣及反應(yīng)）加樣及反應(yīng) S80 E0.25 （S80E2）0.25EU/ml （2）0.125EU/ml （）0.06EU/ml （1/2）BET水0.03EU/ml （1/4） S80 E0.125

40、 （S80E） S80 E0.06 （S80E1/2） S80 E0.03 （S80E1/4）S802007-9-10Bitab58 - 36支鱟試劑，先用0.1mlBET復(fù)溶，再加相應(yīng)的溶液0.1ml - 37 1 反應(yīng)60 2分鐘（6）結(jié)果判斷）結(jié)果判斷2007-9-10Bitab59 反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)結(jié)果 溶液編號(hào)溶液編號(hào)B BA A溶液內(nèi)容溶液內(nèi)容S S80 80 E E0.250.25 S S80 80 E E0.1250.125 S S80 80 E E0.060.06 S S80 80 E E0.030.03S S8080平平行行管管溶液編號(hào)溶液編號(hào)C CD D溶液內(nèi)容溶液內(nèi)容E E

41、0.250.25 E E0.1250.125 E E0.060.06 E E0.030.03 w平平行行管管+-+-+-+-+-2007-9-10Bitab60結(jié)果計(jì)算及判斷 Es=lg-1（Xs/4）=lg-1=0.125EU/ml Et=lg-1（Xt/4）=lg-1 =0.104EU/ml Es 、Et分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值。 Xs、Xt分別為系列C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。(lg0.125) x44(lg0.06)+(lg0.125) x442007-9-10Bitab61結(jié)論：使用靈敏度=0.125EU/ml的鱟試劑對(duì)樣品（S）的80倍稀釋液（S80）作

42、BET，無(wú)干擾。當(dāng)溶液A和溶液D（陰性對(duì)照）的所有平行管都為陰性，且0.5 Es 2時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng) 0.5 Es Et 2.0 Es時(shí)，供試品在該濃度下對(duì)檢查無(wú)干擾。本試驗(yàn)： 0.5=0.06， 2=0.25 Es=0.125， 0.5 Es 2，有效 0.5 Es=0.06 ， 2 Es=0.25 Et =0.104，0.5Es Et 2.0 Es，無(wú)干擾藥典規(guī)定：2007-9-10Bitab626 6、 檢查法檢查法 1 1）凝膠法限量試驗(yàn)）凝膠法限量試驗(yàn) （1）反應(yīng)設(shè)置： 溶液編號(hào)ABCD溶液內(nèi)容SS E2E2W平行管2007-9-10Bitab63 （2 2）試劑選擇）試劑選擇試劑名

43、稱 廠 家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù) 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.125EU/ml8內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯25ml/瓶 0.003EU/ml1硫酸慶大霉素(S)-100ml/支 20000U/ml1- 根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，供試品在80倍稀釋，使用鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml條件下，對(duì)BET無(wú)干擾- 本試驗(yàn)選擇TAL靈敏度為0.125EU/ml,供試品稀釋80倍檢查2007-9-10Bitab64溶液溶液C的制備的制備E100 E10 E1 E0.5 E0.25 溶液溶液A的制備的制備S原液 S10 S40 S80 溶液溶液B的制備的制備 2.7

44、ml W3.6ml W1.6ml0.4ml1.6ml W3.6ml W0.4ml0.6ml0.3ml0.6ml1.8ml W0.6ml W溶液C溶液A0.6ml0.6ml wE0.5 S40S80E0.250.6ml0.6ml溶液B(3)(3)各反應(yīng)溶液制備各反應(yīng)溶液制備2007-9-10Bitab65反應(yīng)項(xiàng)目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1ml TAL+0.1ml A溶液B0.1ml TAL+0.1ml B溶液C0.1ml TAL+0.1ml C溶液D0.1ml TAL+0.1ml BET水（4）加樣及反應(yīng)）加樣及反應(yīng)試管封口 混合 孵育（37/ 602分鐘） 8支鱟試劑，先加0.1mlBET水復(fù)溶

45、，再加入相應(yīng)溶液（如圖）2007-9-10Bitab66溶液編號(hào)內(nèi)容溶液編號(hào)內(nèi)容A A（S S8080）B B（S S8080E E0.250.25）C C（E E0.250.25）D DW W合格不合格需復(fù)檢復(fù)檢合格復(fù)檢不合格試驗(yàn)無(wú)效試驗(yàn)無(wú)效試驗(yàn)無(wú)效(5)(5)結(jié)果判斷結(jié)果判斷2007-9-10Bitab67舉例：注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素日常檢查舉例：注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素日常檢查試劑名稱廠 家劑型復(fù)溶體積或裝 量標(biāo)示靈敏度() 或效價(jià)數(shù)量（支）TAL安度斯凍干品0.5ml/支0.125EU/ml3CSE中檢所凍干品1.0ml/支20EU/支1BET水安度斯5ml/支注射用頭孢拉定注射用無(wú)菌粉

46、末0.5g/支12007-9-10Bitab68參數(shù)確定參數(shù)確定: 供試品的內(nèi)毒素限值供試品的內(nèi)毒素限值L：中國(guó)藥典上規(guī)定注射用頭孢拉定的內(nèi)毒素限值L為0.2EU/mg。 鱟試劑靈敏度的選擇鱟試劑靈敏度的選擇根據(jù)干擾試驗(yàn)的結(jié)果，可選擇靈敏度為0.125EU/ml的TAL對(duì)注射用頭孢拉定按最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)進(jìn)行日常檢查。 MVD MVD計(jì)算計(jì)算: :加加5ml BET5ml BET水溶解一支供試品水溶解一支供試品, ,得濃度得濃度C=100mg/mlC=100mg/ml的供試液。的供試液。倍）(160125. 02 . 0100CLMVD2007-9-10Bitab692） 制備供試液制

47、備供試液: 供試品溶液（供試品溶液（A）的）的制備制備0.4ml100mg/ml頭頭孢孢拉拉定定5.0mlBET水水1:801:100.5ml3.6ml3.5ml1.0ml1.0ml1:1602007-9-10Bitab70 內(nèi)毒素溶液（內(nèi)毒素溶液（C）的制備的制備0.25EU/ml30s30s15min20EU/ml0.4mlCSEBET水水1.0ml2.0EU/ml0.5EU/ml1.0ml1.0ml3.0ml1.0ml3.6mlE0.5E0.252007-9-10Bitab71 含含2內(nèi)毒素的供試液（內(nèi)毒素的供試液（B）的制備的制備1:160 （ 0.625mg /ml）2CSE2CSE

48、（0.25EU/ml0.25EU/ml）E E0.50.51.0ml注射用頭孢拉定稀釋液1.0ml1:802007-9-10Bitab72 加樣反應(yīng)加樣反應(yīng)反應(yīng)項(xiàng)目每管加樣內(nèi)容管數(shù)A0.1ml TAL+0.1ml A溶液B0.1ml TAL+0.1ml B溶液C0.1ml TAL+0.1ml C溶液D0.1ml TAL+0.1ml BET水試管封口 混合 孵育（37/602分鐘）2007-9-10Bitab732. 凝膠法半定量試驗(yàn) 應(yīng)用舉例2007-9-10Bitab741. 供試品及試劑1.1 供試品(S):葡萄糖氯化鈉注射液， 內(nèi)毒素限值 L=0.5EU/mL1.2 TAL：=0.06EU/mL1.3 CSE1.4 檢查用水（W）2007-9-10Bitab752. 凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液檢查用水12482222B2/供試品溶液122C2/檢查用水檢查用水1248210.50.252222D無(wú)/檢查用水2注：