高氧誘導(dǎo)新生鼠急性肺損傷模型的制備及其機(jī)制探討

1、高氧誘導(dǎo)新生鼠急性肺損傷模型的制備及其機(jī)制探討                     作者：潘佳容肖志輝張晨美【摘要】  建立新生兒高氧急性肺損傷的動(dòng)物模型,并探討其發(fā)病機(jī)制。方法采用新生Sprague-Dawley(SD)大鼠持續(xù)暴露于9095的常壓氧氣造成高氧急性肺損傷。實(shí)驗(yàn)3、7d時(shí)分別檢測(cè)高氧模型組和對(duì)照組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶（SOD）、腫瘤壞死

2、因子-（TNF-)，測(cè)定肺組織核因子B（NFB）染色強(qiáng)度，并觀察肺組織病理表現(xiàn)。結(jié)果與對(duì)照組比，高氧組3d時(shí)BALF中MDA、TNF-含量升高(t分別7.07、6.45，P均 0.05)，SOD活性下降(t4.56，P 0.05)，肺組織NFB活性上升(t50.08，P 0.05)，肺組織見(jiàn)小血管擴(kuò)張、充血和肺泡內(nèi)少量出血及以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；7d時(shí)，高氧組BALF中MDA、TNF-含量進(jìn)一步升高(t分別9.70、7.20，P均 0.05)，SOD活性進(jìn)一步下降(t7.15，P 0.05)， NFB染色強(qiáng)度進(jìn)一步升高(t98.05，P 0.05)，肺組織充血、水腫，間質(zhì)內(nèi)

3、浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等增多，肺泡間隔輕度增寬，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。結(jié)論新生鼠持續(xù)暴露于高濃度氧氣可制備新生兒高氧急性肺損傷動(dòng)物模型。高濃度氧致脂質(zhì)過(guò)氧化，抗氧化酶系統(tǒng)活性降低，NFB過(guò)度活化，TNF-過(guò)度釋放，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡和過(guò)度炎癥反應(yīng)是肺損傷的重要發(fā)病機(jī)理。 【關(guān)鍵詞】  高氧；肺損傷；疾病模型；動(dòng)物；核因子B         To establish an optimal animal model of oxygeninduced acute lung injury(ALI) in neonate，and to

4、 study the possible underlying mechanism. Methods Persistence exposure of 9095 oxygen resulting in ALI was practiced in neonatal Sprague-Dawley(SD) rats. At the third day and seventh day of exposure，malondialdehyde(MDA ) ，superoxide dismutase (SOD) and TNF-in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were

5、 determined and the intension of nuclear factor -B(NF -B) expression in rat lung was analyzed by the method of immunohistochemistry，and lung histopathological changes were examined in hyperoxic group and control group. Results After 3 days， compared with the control group，hyperoxic group showed ALI

6、characterized by the increase in the concentration of MDA ， TNF- in BALF and the intension of NF -B in rat lung while the decrease in the activity of SOD in BALF (t7.07,6.45,50.08,4.56, P0.05) and presence of congestion， edema， inflammatory infiltration. After 7 days， continuous increase  

7、 in the concentration of MDA ， TNF- in BALF and the intension of NF -B in rat lung and continuous decrease in the activity of SOD in BALF  were observed(t9.70,7.20,98.05,7.15, P0.05)， and lung histopathological presence showed more severe changes in hyperoxic group.Conclusions An optimal animal

8、 model of oxygeninduced ALI in neonate was established by persistence exposure of 9095 oxygen with neonatal S-D rats. Excesses of lipid peroxidation， decrease of activity of antioxidase， increase of activity of NFB and excess release of TNF- are associated with hyperoxia. The mechanisms of imbalance

9、 of oxidant/antioxidant and inflammation may play important roles in the development of  早在1967 年Northway就首次提出新生兒高氧性肺損傷的概念。目前在新生兒領(lǐng)域，高氧肺損傷愈加引起人們的重視，但是至今對(duì)于高氧肺損傷的確切機(jī)理及其干預(yù)措施仍未取得理想進(jìn)展。建立一種合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行高氧性肺損傷研究的前提。本次研究以新生Sprague-Dawley(SD)大鼠制備科學(xué)、簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的新生兒高氧急性肺損傷動(dòng)物模型,并探討其發(fā)病機(jī)制。   1材料與方法 

10、0; 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2005年4月至2006年1月生后3d新生SD大鼠48只,體重9.011.0g，平均（9.81±0.68 ）g，性別不限, 新生鼠未斷奶,與哺乳母鼠共同飼養(yǎng),系清潔級(jí)動(dòng)物,蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。   1.2建立高氧環(huán)境自制25cm×25cm×35cm的有機(jī)玻璃容器，頂部一進(jìn)氣孔（直徑0.5cm），側(cè)面有等大的排氣孔，進(jìn)氣孔持續(xù)通入純氧，測(cè)氧儀（由浙江利達(dá)儀器廠生產(chǎn)）連續(xù)監(jiān)測(cè)箱內(nèi)氧濃度，使氧濃度維持在9095。容器內(nèi)置有飼料、水、鈉石灰250g（由上海陸都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)）以及墊料。環(huán)境溫度2226，相對(duì)濕度保持60%70%

11、。   1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理生后3d新生SD大鼠48只編號(hào)、稱重后隨機(jī)分為對(duì)照組和高氧組，每組24只。高氧組新生鼠置于上述高氧環(huán)境。對(duì)照組新生鼠則置于同一室內(nèi), 接受常壓空氣。高氧組每天開(kāi)箱兩次(更換墊料、鈉石灰、水及飼料，并與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒致護(hù)理能力下降，兩次開(kāi)箱總時(shí)間不超過(guò)1h)。   1.4實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)   1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行處理與分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示,組間比較行方差分析及t檢驗(yàn)。設(shè)P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。   2結(jié)果

12、   2.1BALF中MDA、總SOD、TNF-a及肺組織NF-B染色強(qiáng)度變化見(jiàn)表1    由表1可見(jiàn)，高氧暴露3d，BALF中MDA、總SOD、TNF-a及肺組織NF-B染色強(qiáng)，高氧組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別7.07、4.56、6.45、50.08，P均 0.05)； 7d時(shí)上述指標(biāo)高氧組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別9.70、7.15、7.20、98.05，P均 0.05)。   2.2病理表現(xiàn)見(jiàn)封二圖46高氧組3d時(shí)見(jiàn)小血管擴(kuò)張、充血和肺泡內(nèi)少量出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn); 7d時(shí)高氧組毛細(xì)血管擴(kuò)張，

13、充血，組織水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加重，肺泡間隔輕度增寬,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。            3討論    臨床治療中，吸入高濃度的氧氣是一種常見(jiàn)和必要的措施。但是長(zhǎng)時(shí)間高濃度氧氣吸入對(duì)多個(gè)器官和系統(tǒng)均具有毒性作用1，對(duì)于早產(chǎn)新生兒或本身存在疾病的新生兒尤為突出。早在1967年Northway就首次提出新生兒支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）的概念，并推測(cè)其發(fā)生與長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧有密切關(guān)系。但是，高氧肺損傷的確切機(jī)理至今

14、仍未闡明。    新生SD大鼠在組織發(fā)育、病理生理、免疫反應(yīng)等方面與新生兒有很強(qiáng)相似性，利用新生SD大鼠建立高氧肺損傷模型并在此基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)研究具有科學(xué)性、可行性。SD大鼠生后肺發(fā)育分為三期，即膨脹期(生后14 d)、肺泡化期(413 d)和平衡生長(zhǎng)期(1421 d)。新生兒階段肺發(fā)育處于肺泡階段，相當(dāng)于SD大鼠肺泡化期。本次研究對(duì)象為生后310d的新生SD大鼠，保持了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床病理生理較高相似度。氧濃度維持在9095，選擇該濃度的原因在于可以較短時(shí)間造成急性肺損傷。本次研究對(duì)以往的間斷監(jiān)測(cè)作了改進(jìn)，作連續(xù)監(jiān)測(cè),避免氧濃度不穩(wěn)定對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不利影響。氧濃度在

15、每日開(kāi)艙更換飼料、墊料和母鼠的過(guò)程中艙內(nèi)的氧濃度會(huì)迅速下降，這是模型建立的一個(gè)不利因素，但是在本次研究中每日開(kāi)艙時(shí)間控制在1h之內(nèi)，使新生SD大鼠絕大多數(shù)時(shí)間處在高氧環(huán)境中；考慮到高濃度的氧也會(huì)對(duì)母鼠造成損傷，造成其護(hù)理能力的下降，在本次研究中每日將氧艙中的母鼠與空氣中的母鼠進(jìn)行交換，這樣既避免母鼠護(hù)理能力的下降，又使各組的條件盡量齊同。檢測(cè)指標(biāo)和病理學(xué)檢查清晰顯示高氧組新生SD大鼠呈現(xiàn)急性肺損傷，本次研究成功建立新生兒高氧急性肺損傷的動(dòng)物模型。    MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，而SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶系，同時(shí)檢測(cè)這兩項(xiàng)指標(biāo)可以一定程度反映機(jī)體氧化/抗氧化平衡。

16、本次研究中高氧組BALF中MDA含量高于對(duì)照組,總SOD活性低于對(duì)照組（P均0.05），提示高氧引起脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和機(jī)體抗氧化酶活性降低，氧化/抗氧化失衡。目前許多研究表明，炎癥反應(yīng)也是高氧肺損傷的重要機(jī)理之一。TNF-是一重要促炎因子，NF-B是炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子。TNF-通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑激活NFB，激活了的NFB又可進(jìn)一步促進(jìn)TNF-a表達(dá)上調(diào)，形成正反饋，加重肺損傷。本次研究中高氧組TNF-增加，免疫組化提示NF-B活化，進(jìn)一步驗(yàn)證炎癥反應(yīng)在高氧肺損傷中的發(fā)揮重要作用。與對(duì)照組相比，高氧組BALF中MDA、SOD、TNF-的變化，結(jié)合免疫組化NF-B檢測(cè)以及病理學(xué)檢查結(jié)

17、果，清晰地表明： 高氧暴露僅3d即誘發(fā)新生SD大鼠急性肺損傷；隨時(shí)間延長(zhǎng)，7d時(shí)肺損傷加重：毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血，組織水腫，間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等增多，肺泡間隔輕度增寬，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，與國(guó)內(nèi)外的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致57。新生SD大鼠高氧急性肺損傷早期病理生理改變主要為彌漫性炎癥表現(xiàn)，纖維化的慢性改變尚不明顯，與新生兒高氧急性肺損傷病變相似。早期的過(guò)度炎癥反應(yīng)是后續(xù)纖維化改變的基礎(chǔ)，提示早期干預(yù)新生兒高氧性急性肺損傷對(duì)于挽救患兒生命并預(yù)防慢性肺疾病具有積極意義。    本研究研究成功建立新生SD大鼠高氧肺損傷模型，制作方法簡(jiǎn)便,可重復(fù)性高,能定量研究；本次研

18、究提示高濃度氧致脂質(zhì)過(guò)氧化，抗氧化酶系統(tǒng)活性降低，NFB過(guò)度活化，TNF-過(guò)度釋放，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡和過(guò)度炎癥反應(yīng)是肺損傷的重要發(fā)病機(jī)理。【參考文獻(xiàn)】  Cynthia M, Henry R, Elsie M. The impact of hyperoxia on the neonatal and adult developing dendritic cellJ. Pediatr Res, 2007, 62(1):78-82.2 金漢珍, 黃德珉, 官希吉. 實(shí)用新生兒學(xué)M. 第3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2004. 388390.3 Chetty A, Cao GJ, Manzo N, et al. The role of IL-6 and IL-11 in hyperoxic injury in developing lungJ. Pediatr Pulmo- nol, 2008, 43(3):297-304.4 Wong HR, Odoms KK, Denenberg AG, et al. Hyperox