酚氯仿法提取DNA的一些試劑的作用

1、酚氯仿法提取DNA的一些試劑的作用酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提細胞DNA時，有什么作用？使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1,有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了DNase的降解作用。缺點：1,能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。2,不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？（酚易溶于氯仿中）氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。用酚一氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中

2、加少許異戊醇，為什么？異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl或NaAc,Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。原理：動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或濃鹽溶液（如1mol/L氯化鈉），但在0.14mol/L氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）則在0.14mol/L氯化鈉中溶解度

3、最大，利用這一性質(zhì)可將其分開。將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使DNA與蛋白質(zhì)分離開。加入固體氯化鈉使其濃度達到1mol/L,使DNA溶解。加氯仿-異戊醇去除蛋白質(zhì)，也可重復(fù)該步操作得較純DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。溶解：將離心后除去RNA的沉淀，用30ml生理鹽水溶解，充分?jǐn)嚢韬螅瑒驖{一次。加4毫升10%SDS溶液，使溶液的SDS濃度達到1%左右，邊加邊攪拌，放置60C水浴保溫10分鐘（不停攪拌），冷卻。加固體氯化鈉，使溶液氯化鈉濃度達到1mol/L,充分?jǐn)嚢?0分鐘；除雜質(zhì)：加等體積氯仿-異戊醇混合液，充分震蕩10分鐘，8000r/min離心7分鐘，

4、取上層液量好體積，倒入燒杯中（離心管），加同體積的氯仿-異戊醇混合液，重復(fù)上次操作。直至界面不出現(xiàn)蛋白凝膠為止；沉淀：準(zhǔn)確量取上清液體積，加2倍體積95%冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現(xiàn)，約10-15分鐘，離心8000r/min離心7分鐘，得白色沉淀；溶解：將沉淀物用0.1mol/LNaOH約10毫升溶解得DNA溶液。溶液I一溶菌液：溶菌酶：它是糖甘水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的3-1,4糖背鍵，因而具有溶菌白作用。當(dāng)溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA:（1）螯合Mg2十、C

5、a2十等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）；（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。溶液IINaOHSDS液：NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH12或pHv3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能

6、與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-出十-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。溶液III-3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/LNaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為

7、中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。為什么用無水乙醇沉淀DNA?用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總體積

8、增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.10.25mol/L?在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而

9、聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？加進去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA,又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNaseo在溶液中，有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。7.為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實驗中，選

10、擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa=7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍（pH）,可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯

11、仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10%15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由

12、于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24:1之比。也可采用酚、氯仿與異戊酉!之比為25:24:1（不必先配制,可在臨用前把一份酚加一份24:1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。苯酚：氯仿：異戊醇為什么要25:

13、24:1?抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10%15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。為什么用酚與氯仿抽提DNA時，