第四章二維電泳與細胞蛋白質的分離

1、第四章二維電泳與細胞蛋白質的分離第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 NH CH2=CHCONH2 + CH2=CHC CH2=CHC CH2CHCH2CHxCH2 CH2CHCH2CHxCH2CONH2 C=O CH2 NH NH O O CONH2C=ONHCH2NH 標準蛋白分子量標準蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，多肽在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量多肽鏈分子量 相對遷移率相對遷移率1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE分離局限性分離

2、局限性o分離度相當有限分離度相當有限n顯示含有單一蛋白質的條帶實際可能含有多種顯示含有單一蛋白質的條帶實際可能含有多種蛋白質分子蛋白質分子n一個純化的蛋白質可能含有多種蛋白質形式一個純化的蛋白質可能含有多種蛋白質形式n1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE分析看上去純凈的單一條帶，相分析看上去純凈的單一條帶，相同樣品的同樣品的2D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE可將相同分子質量條帶可將相同分子質量條帶分解成具有不同等電點的多點分解成具有不同等電點的多點o反應了蛋白質的翻譯后修飾，化學修飾幾乎不影響反應了蛋白質的翻譯后修飾，化學修飾幾乎不影響SDSSDS結結合或在合或在PAGEPA

3、GE上的遷移上的遷移二維電泳技術二維電泳技術oSmithiesSmithies和和PoulikPoulik（19561956年）最早引入二維電泳技術：年）最早引入二維電泳技術：將紙電泳和淀粉凝膠電泳結合分離血清蛋白質將紙電泳和淀粉凝膠電泳結合分離血清蛋白質oOFarrellOFarrell發(fā)明的二維電泳體系發(fā)明的二維電泳體系n根據(jù)蛋白質的兩個一級屬性：等電點和相對分子質量根據(jù)蛋白質的兩個一級屬性：等電點和相對分子質量的特異性將蛋白質混合物在第一個方向上按照等電點的特異性將蛋白質混合物在第一個方向上按照等電點高低進行分離（等電聚焦），在第二個方向上按照相高低進行分離（等電聚焦），在第二個方向上按

4、照相對分子質量大小進行分離（對分子質量大小進行分離（SDS-PAGESDS-PAGE）二維電泳技術二維電泳技術o二維電泳分離后的蛋白質經(jīng)顯色方法（考馬斯亮二維電泳分離后的蛋白質經(jīng)顯色方法（考馬斯亮藍染色、酸性銀染、堿性銀染、負性染色、熒光藍染色、酸性銀染、堿性銀染、負性染色、熒光染色、放射性標記）處理后，通過圖像掃描存檔，染色、放射性標記）處理后，通過圖像掃描存檔，最后呈現(xiàn)出來的是在二維方向排列的呈最后呈現(xiàn)出來的是在二維方向排列的呈“滿天星滿天星”狀排列的小圓的，其中每一個點代表一個蛋白質狀排列的小圓的，其中每一個點代表一個蛋白質第二節(jié)第二節(jié) 一維等電聚焦電泳一維等電聚焦電泳一、一、IEFIE

5、F凝膠制備凝膠制備o一維等電聚焦的基本原理：一維等電聚焦的基本原理： 把蛋白質加入到含有把蛋白質加入到含有pHpH梯度的載體時，如果蛋白質所在梯度的載體時，如果蛋白質所在的點的的點的pHpH值與其等電點不符，則該蛋白質會帶一定量的正電值與其等電點不符，則該蛋白質會帶一定量的正電荷或負電荷。在高于其等電點的位置，蛋白質帶負電，反之荷或負電荷。在高于其等電點的位置，蛋白質帶負電，反之帶正電。此時，如果加以強電場，蛋白分子會在電場作用下帶正電。此時，如果加以強電場，蛋白分子會在電場作用下分別向正極或負極漂移。當達到其等電點位置時，蛋白質不分別向正極或負極漂移。當達到其等電點位置時，蛋白質不帶電，就不

6、再漂移，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。帶電，就不再漂移，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。一、一、IEFIEF凝膠的制備凝膠的制備o早期的等電聚焦以低濃度的聚丙烯酰胺凝膠為介質，在外加早期的等電聚焦以低濃度的聚丙烯酰胺凝膠為介質，在外加電場的該介質中，連續(xù)排列著從正極到負極電場的該介質中，連續(xù)排列著從正極到負極pIpI值逐漸增加的值逐漸增加的合成載體兩性電解質合成載體兩性電解質(sythetic(sythetic carriercarrier ampholyteampholyte，SCA)SCA)o當電壓加在當電壓加在SCASCA混合物間，最高混合物間，最高pIpI值的分子（帶最多值的分子（帶最多正電荷）移向負極，最

7、低正電荷）移向負極，最低pIpI值（帶最多負電荷）的分值（帶最多負電荷）的分子移向正極，其余分子將根據(jù)其子移向正極，其余分子將根據(jù)其pIpI值在兩個極值之間值在兩個極值之間分散，從而形成一個連續(xù)的分散，從而形成一個連續(xù)的pHpH梯度梯度等電聚焦電泳等電聚焦電泳o合成載體兩性電解質合成載體兩性電解質(1)(1)易溶于水，在易溶于水，在pIpI處應有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的處應有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pHpH梯度，不致被蛋白質或其它兩性電解質改變梯度，不致被蛋白質或其它兩性電解質改變pHpH梯度；梯度；(2)(2)在在pIpI處應有良好的電導及相同的電導系數(shù)，以保持均勻的處應有良好的電導及相

8、同的電導系數(shù)，以保持均勻的電場；電場；(3)(3)分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便于與生分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開；物大分子分開；(4)(4)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，也無變化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，也無變性作用，其化學組成不同于蛋白質。性作用，其化學組成不同于蛋白質。oSCASCA的缺陷：的缺陷：nSCASCA本身就是通過復雜的合成過程得到的，其重本身就是通過復雜的合成過程得到的，其重復性很難控制，這樣從一開始就限制了復性很難控制，這樣從一開始就限制了2-DE2-DE分分離的重復性；離的重復性；nSCASCA分子相對較小，難以在分子

9、相對較小，難以在IEFIEF膠內(nèi)固定，在膠內(nèi)固定，在IEFIEF過程中由水合正離子引起的電滲流將致使過程中由水合正離子引起的電滲流將致使SCASCA分分子向負極遷移（負極漂移），導致子向負極遷移（負極漂移），導致pHpH值不穩(wěn)定值不穩(wěn)定性增加。當利用管狀性增加。當利用管狀IEFIEF膠時，由于玻璃毛細管膠時，由于玻璃毛細管壁的硅羥基帶負電，與這些負電荷基團對應，壁的硅羥基帶負電，與這些負電荷基團對應，將在管膠表面聚集一層正電荷形成雙電層，這將在管膠表面聚集一層正電荷形成雙電層，這種作用加劇了負極漂移；種作用加劇了負極漂移；oSCASCA的缺陷：的缺陷：n負極漂移作用對堿性區(qū)蛋白質的影響尤其嚴重

10、，負極漂移作用對堿性區(qū)蛋白質的影響尤其嚴重，結果常導致堿性區(qū)蛋白質難以成功聚焦甚至導結果常導致堿性區(qū)蛋白質難以成功聚焦甚至導致區(qū)蛋白質的丟失致區(qū)蛋白質的丟失n每一次灌制每一次灌制SCASCA凝膠的重復性難以控制，凝膠的凝膠的重復性難以控制，凝膠的機械穩(wěn)定性差，易拉伸變形或斷裂，導致重復機械穩(wěn)定性差，易拉伸變形或斷裂，導致重復性的減低性的減低固相固相pHpH梯度（梯度（IPGIPG）技術）技術oIPGIPG通過通過immobilineimmobiline共價偶聯(lián)于共價偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pHpH梯度，梯度，克服了克服了IEFIEF的缺點，從而達到高的缺點，從而達到高度的重復

11、性度的重復性 oIPGIPG膠條分為線性和非線性膠條分為線性和非線性n線性是指膠條的線性是指膠條的pHpH均勻分布均勻分布n非線性是指為了突出某一非線性是指為了突出某一pHpH范圍范圍的結果，該的結果，該pHpH值范圍的膠條長度值范圍的膠條長度有所增加有所增加商品化的商品化的IPGIPG膠條膠條oIPGIPG膠條的膠條的pHpH值范圍的選擇一般遵循以下原則值范圍的選擇一般遵循以下原則： pH 310pH 310線性梯度膠適于了解樣本中所有蛋白質的分線性梯度膠適于了解樣本中所有蛋白質的分布情況布情況 pH 310pH 310非線性梯度膠能提高非線性梯度膠能提高pH 57pH 57之間的樣本蛋白之

12、間的樣本蛋白質解析度質解析度 聯(lián)合使用聯(lián)合使用pH 47pH 47和和pH 611pH 611梯度膠可獲得相關梯度膠可獲得相關pHpH范圍的范圍的更清晰的蛋白質分布情況更清晰的蛋白質分布情況 小小pHpH范圍梯度膠范圍梯度膠(pH 3.54.5(pH 3.54.5，pH 4.55.5pH 4.55.5，pH 56pH 56等等) )可提供高分辨率的蛋白質分布圖譜可提供高分辨率的蛋白質分布圖譜 二、加樣二、加樣o在高質量的凝膠基礎上進行加樣，有兩種方案在高質量的凝膠基礎上進行加樣，有兩種方案：nIPGIPG膠重泡脹后，利用加樣杯，邊運行等電聚焦，膠重泡脹后，利用加樣杯，邊運行等電聚焦，邊上樣；邊

13、上樣；o利用加樣杯上樣的好處是在于加樣量可以提高很利用加樣杯上樣的好處是在于加樣量可以提高很多，由于加樣杯直接和膠面接觸，使得分子量大多，由于加樣杯直接和膠面接觸，使得分子量大于于100000Da100000Da的蛋白質可以有效地進入的蛋白質可以有效地進入IPGIPG膠條膠條o容易在上樣處形成蛋白質沉淀，蛋白質樣品易滲漏容易在上樣處形成蛋白質沉淀，蛋白質樣品易滲漏 二、加樣二、加樣n另一種方案是將樣品與重泡脹液混合，在另一種方案是將樣品與重泡脹液混合，在IPGIPG膠條膠條泡脹的同時樣品也滲入膠條，然后再加電壓，即泡脹的同時樣品也滲入膠條，然后再加電壓，即膠內(nèi)泡脹法膠內(nèi)泡脹法o其優(yōu)點是泡脹和等

14、電聚焦整合為一程序即可完成，其優(yōu)點是泡脹和等電聚焦整合為一程序即可完成，高效和高可重復性，是目前常用的加樣方法高效和高可重復性，是目前常用的加樣方法o因需要泡漲過夜，故蛋白質可能發(fā)生溶解或修飾因需要泡漲過夜，故蛋白質可能發(fā)生溶解或修飾加樣量過大加樣量過大三、運行三、運行o重泡脹完成后，可以加電壓開始重泡脹完成后，可以加電壓開始IEFIEFo由于膠條所能承受的電流有限，由于膠條所能承受的電流有限，IEFIEF過程中要避免電流過程中要避免電流過大，一般限流為過大，一般限流為50A50Ao最初樣品中離子強度高電壓應限制于最初樣品中離子強度高電壓應限制于200V200V、30min30min，逐步增壓

15、，最終電壓至逐步增壓，最終電壓至8000V8000V并恒定運行若干小時并恒定運行若干小時o運行時間決定于幾個不同因素：樣品類型、蛋白運行時間決定于幾個不同因素：樣品類型、蛋白上樣量、上樣量、IPGIPG膠條長度、所用膠條長度、所用pHpH梯度梯度三、運行三、運行o獲得最好圖譜質量和所需最佳時間是獲得最好圖譜質量和所需最佳時間是IEFIEF分離達分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間到穩(wěn)定態(tài)所需的時間o聚焦時間短，導致水平和垂直條紋聚焦時間短，導致水平和垂直條紋o過度聚焦：活性水轉運而導致過多水在過度聚焦：活性水轉運而導致過多水在IPGIPG膠表膠表面滲出（電滲），會造成蛋白圖譜變形面滲出（電滲），會造成蛋白

16、圖譜變形o在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白質丟失在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白質丟失o溫度低尿素會結晶，溫度低尿素會結晶，IEFIEF應當在應當在2020運行運行沒有完全聚焦或聚焦時間不夠四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡oIPG IPG 膠條平衡兩次，每次膠條平衡兩次，每次15 15 分鐘分鐘o第一步的平衡液第一步的平衡液n50mmol/L Tris50mmol/L Tris緩沖液（緩沖液（pH8.8pH8.8）, ,含含2%SDS2%SDS、20mmol/LDTT20mmol/LDTT、6mol/L6mol/L尿素、尿素、3030甘油甘油n使一向膠條上的蛋白質變性使一向膠條上的蛋白

17、質變性nSDSSDS：與蛋白定量結合：與蛋白定量結合o蛋白質蛋白質:SDS:SDS1 1：1.41.4四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡n尿素，甘油：尿素，甘油：o去除蛋白的高級結構以及亞基間的相互作用去除蛋白的高級結構以及亞基間的相互作用o減少電內(nèi)滲，有利于蛋白從第一向到第二向的減少電內(nèi)滲，有利于蛋白從第一向到第二向的轉移轉移nDTTDTTo使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡o第二步平衡液中加入碘乙酰胺以取代第二步平衡液中加入碘乙酰胺以取代DTTDTTn使蛋白質巰基烷基化，防止它們在電泳過程中使蛋白質巰基烷基化，

18、防止它們在電泳過程中重新氧化重新氧化n碘乙酰胺并且能使殘留的碘乙酰胺并且能使殘留的DTT DTT 烷基化烷基化( (銀染過程銀染過程中，中，DTT DTT 會導致點拖尾會導致點拖尾“point streaking”)point streaking”)o將將IPG IPG 膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡緩沖液，然膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡緩沖液，然后放入第二向后放入第二向SDS SDS 膠中膠中四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡o一步平衡法一步平衡法n平衡液中平衡液中5mmol/L TBP5mmol/L TBP取代取代DTTDTTnTBPTBP不帶電荷，在不帶電荷，在SDS-PAGES

19、DS-PAGE過程中不遷移過程中不遷移第三節(jié)第三節(jié) 二維二維SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳二維二維SDS-PAGESDS-PAGEo平衡后，平衡后，IPGIPG條可直接加在二向條可直接加在二向SDS-PAGESDS-PAGE膠膠的表面的表面o一向膠和二向膠的接觸是影響電泳重復性的一向膠和二向膠的接觸是影響電泳重復性的一個很重要因素一個很重要因素n避免兩者接觸面之間產(chǎn)生氣泡避免兩者接觸面之間產(chǎn)生氣泡n否則會產(chǎn)生阻力，使得膠條中蛋白無法順利遷否則會產(chǎn)生阻力，使得膠條中蛋白無法順利遷移至二向，從而產(chǎn)生點的扭曲現(xiàn)象移至二向，從而產(chǎn)生點的扭曲現(xiàn)象二維二維SDS-PAGEo同普通同普通SDS

20、-PAGESDS-PAGE類似類似o分水平和垂直兩種分水平和垂直兩種o水平水平SDS-PAGESDS-PAGEn必須有必須有6 6的濃縮膠，均一或梯度的分離膠的濃縮膠，均一或梯度的分離膠n凝膠附著在塑料支持膜上，在染色過程中可以凝膠附著在塑料支持膜上，在染色過程中可以防止凝膠大小發(fā)生變化防止凝膠大小發(fā)生變化n水平膠厚度較?。ㄒ话阍谒侥z厚度較小（一般在o.5mm,o.5mm,垂直膠為垂直膠為1mm1mm或或1.5mm1.5mm），可施加高電壓，減短運行時間，減少蛋白），可施加高電壓，減短運行時間，減少蛋白質擴散，使得水平膠分離蛋白質點的邊緣要比垂直質擴散，使得水平膠分離蛋白質點的邊緣要比垂直膠

21、清晰膠清晰n凝膠聚合均勻，邊緣效應小，蛋白質點的分布變形凝膠聚合均勻，邊緣效應小，蛋白質點的分布變形程度小程度小o垂直垂直SDS-PAGESDS-PAGEn避免二向電泳時膠條在電極液中移位，需用避免二向電泳時膠條在電極液中移位，需用0.50.5的瓊脂糖電極緩沖液封膠的瓊脂糖電極緩沖液封膠n封膠應注意瓊脂糖溶液的溫度不能太高封膠應注意瓊脂糖溶液的溫度不能太高o會造成會造成IPGIPG膠上蛋白質變性或蛋白質修飾膠上蛋白質變性或蛋白質修飾n避免在封膠時引入氣泡避免在封膠時引入氣泡n無需濃縮膠無需濃縮膠oIPGIPG膠條中蛋白質區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性膠條中蛋白質區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制

22、性IEFIEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當了濃縮膠n可成批二向可成批二向SDS-PAGESDS-PAGE同時運行以獲得最好的圖譜同時運行以獲得最好的圖譜重復性重復性n操作簡單、上樣量大、重復性好操作簡單、上樣量大、重復性好膠在聚合過程中未被水覆蓋或水太少膠在聚合過程中未被水覆蓋或水太少至少加至少加1ml水至膠的表面水至膠的表面不是所有蛋白特別是高分子量蛋白都與不是所有蛋白特別是高分子量蛋白都與SDS結合結合制備制備SDS-PAGE膠時用膠時用0.15%SDS替代替代0.1%SDS非正常聚合非正常聚合聚合過程中產(chǎn)生氣泡或膠盒有雜質聚合過程中產(chǎn)生氣泡或膠盒有雜質第四

23、節(jié)第四節(jié) 膠上蛋白的檢測膠上蛋白的檢測o考馬斯亮藍（考馬斯亮藍（Commassie blue)Commassie blue)染色染色o銀染銀染o負染負染o熒光染色熒光染色一、考馬斯亮藍染色一、考馬斯亮藍染色o原理：利用考馬斯亮藍分子上的芳香苯環(huán)，與蛋白原理：利用考馬斯亮藍分子上的芳香苯環(huán)，與蛋白質的疏水區(qū)結合；同時其亞硫酸基團（質的疏水區(qū)結合；同時其亞硫酸基團（-SO-SO3 32-2-）與）與蛋白質的正電荷結合，可使蛋白質染出蘭色條帶蛋白質的正電荷結合，可使蛋白質染出蘭色條帶o考馬斯亮藍在一定濃度乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色?？捡R斯亮藍在一定濃度乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色。此條件下，考馬斯亮藍可以

24、與蛋白質結合，顏色從此條件下，考馬斯亮藍可以與蛋白質結合，顏色從紅色變?yōu)樗{色，最大吸收峰從紅色變?yōu)樗{色，最大吸收峰從465nm465nm移至移至595nm595nm。o考染程序考染程序n固定：固定：50%50%乙醇乙醇/10%/10%冰醋酸冰醋酸n染色：染色：45%45%甲醇甲醇/10%/10%冰醋酸冰醋酸/0.25/0.25考馬斯亮藍考馬斯亮藍G250G250n脫色：脫色：25%25%乙醇乙醇/8%/8%冰醋酸冰醋酸n保存保存o考染優(yōu)點考染優(yōu)點n染色過程簡單、所需配置的試劑少，操作簡單，染色過程簡單、所需配置的試劑少，操作簡單，無毒性，染色背景及對比度好，與下游的蛋白無毒性，染色背景及對比度

25、好，與下游的蛋白質鑒定方法兼容質鑒定方法兼容o缺陷缺陷n靈敏度遠低于銀染或熒光染料靈敏度遠低于銀染或熒光染料n檢測蛋白質的極限是檢測蛋白質的極限是810ng810ngn用含三氯醋酸和乙醇的考馬斯亮藍染色的蛋白用含三氯醋酸和乙醇的考馬斯亮藍染色的蛋白質易導致谷氨酸羧基側鏈的不可逆酸催化酯基質易導致谷氨酸羧基側鏈的不可逆酸催化酯基化，使肽譜數(shù)據(jù)復雜化化，使肽譜數(shù)據(jù)復雜化n所需時間長，所需時間長，2448h2448h二、銀染二、銀染二、銀染二、銀染o銀染是非放射性染色中靈敏度最高的，其靈敏度可達銀染是非放射性染色中靈敏度最高的，其靈敏度可達200pg200pgo但銀染過程中醛類的特異反應，使得對凝膠

26、酶切肽譜但銀染過程中醛類的特異反應，使得對凝膠酶切肽譜提取存在困難提取存在困難n采用銀染凝膠進行圖譜分析，然后加大上樣量，采用銀染凝膠進行圖譜分析，然后加大上樣量，進行考染并將凝膠切下用于下游鑒定進行考染并將凝膠切下用于下游鑒定o銀染和考染的特異性不同，使得兩種不同方法所銀染和考染的特異性不同，使得兩種不同方法所得到二維電泳圖譜可比性不好得到二維電泳圖譜可比性不好o經(jīng)典銀染法經(jīng)典銀染法n二維凝膠在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液二維凝膠在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后在中增敏，然后在AgNOAgNO3 3溶液中浸泡，蛋白質與溶液中浸泡，蛋白質與AgAg+ +結合，凝膠空白背景中的

27、結合，凝膠空白背景中的AgAg+ +由于結合不牢，大部由于結合不牢，大部分被洗去，而含蛋白質的區(qū)域由于自由氨基與分被洗去，而含蛋白質的區(qū)域由于自由氨基與AgAg+ +的相互作用，使這些位置的的相互作用，使這些位置的AgAg+ +沒能被洗去，隨后沒能被洗去，隨后在堿性環(huán)境中，甲醛溶液將結合在蛋白帶上的在堿性環(huán)境中，甲醛溶液將結合在蛋白帶上的AgAg+ +還原為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白點上，沉淀的還原為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白點上，沉淀的銀顆粒又產(chǎn)生自催化反應，提高銀染反應靈敏度，銀顆粒又產(chǎn)生自催化反應，提高銀染反應靈敏度，使蛋白點顯示棕黃色或棕黑色使蛋白點顯示棕黃色或棕黑色三、負染三、負染o能專

28、門提高能專門提高PAGEPAGE膠上蛋白質的回收率，但不能用于膜膠上蛋白質的回收率，但不能用于膜上染色上染色o速度快（速度快（515min515min），蛋白質的生物活性能保持：一），蛋白質的生物活性能保持：一旦用絡合劑如旦用絡合劑如EDTAEDTA或或Tris/Tris/甘氨酸轉移緩沖液來絡合甘氨酸轉移緩沖液來絡合金屬離子就可進行提取來轉移蛋白質金屬離子就可進行提取來轉移蛋白質o它主要適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被動提它主要適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被動提取以及質譜分析取以及質譜分析o負染的原理負染的原理n有選擇的將金屬離子沉淀在膠上，蛋白質條帶有選擇的將金屬離子沉淀在膠上，蛋

29、白質條帶不能被染色，因此，它們所處的位置是透明的不能被染色，因此，它們所處的位置是透明的o重復性依賴于許多物理化學因素（染色液的重復性依賴于許多物理化學因素（染色液的pHpH，膠中，膠中陰離子的濃度、溫度等），它不能作為一種通常運用陰離子的濃度、溫度等），它不能作為一種通常運用的方法的方法o允許蛋白質保持完整并有效回收以做進一步的結構允許蛋白質保持完整并有效回收以做進一步的結構和生物學分析和生物學分析n特別是在運用咪唑鋅進行負染時，凝膠中鋅介導的蛋白質特別是在運用咪唑鋅進行負染時，凝膠中鋅介導的蛋白質固定是完全可以逆轉的，洗脫后的蛋白質沒有受到化學修固定是完全可以逆轉的，洗脫后的蛋白質沒有受到

30、化學修飾，也沒有受到有機物的污染，咪唑鋅或者改進后的咪唑飾，也沒有受到有機物的污染，咪唑鋅或者改進后的咪唑- -SDS-SDS-鋅染色法靈敏度接近于銀染（鋅染色法靈敏度接近于銀染（1 1l0ngl0ng），重復性優(yōu)于），重復性優(yōu)于用銅或者鋅進行的負染用銅或者鋅進行的負染 四、熒光染色四、熒光染色o熒光試劑對蛋白質無固定作用，與質譜兼容性好，靈熒光試劑對蛋白質無固定作用，與質譜兼容性好，靈敏度高，線性范圍高，適合于大規(guī)模蛋白質組研究敏度高，線性范圍高，適合于大規(guī)模蛋白質組研究o原理：原理：n利用丙基利用丙基Cy3Cy3和甲基和甲基Cy5Cy5兩種染料分別對兩種蛋兩種染料分別對兩種蛋白質樣品進行熒

31、光標記，并在一塊白質樣品進行熒光標記，并在一塊2-DE2-DE膠上同膠上同步運行，由于兩種修飾后染料的激發(fā)波長不同，步運行，由于兩種修飾后染料的激發(fā)波長不同，可以在一塊膠上用兩個波長范圍進行掃描，同可以在一塊膠上用兩個波長范圍進行掃描，同時得到兩個圖像，經(jīng)相應軟件匹配，可方便地時得到兩個圖像，經(jīng)相應軟件匹配，可方便地找到兩個樣品間的差異，即完全避免了實驗因找到兩個樣品間的差異，即完全避免了實驗因素對重復性的影響素對重復性的影響o缺點缺點n標記過程中的共價修飾和熒光探針淬滅作用可能標記過程中的共價修飾和熒光探針淬滅作用可能改變樣品中蛋白的某些性質改變樣品中蛋白的某些性質( (如移動性能、溶解性如移動性能、溶解性能能) )，標記蛋白與未標記蛋白質間的輕微相對分子，標記蛋白與未標記蛋白質間的輕微相對分子質量的差異，可能會導致分離后蛋白質的后續(xù)分質量的差異，可能會導致分離后蛋白質的后續(xù)分析出現(xiàn)偏差析出現(xiàn)偏差熒光染料和銀染比較熒光染料和銀染比較雙向熒光差異凝膠電泳雙向熒光差異凝膠電泳金屬螯合染料金屬螯合染料o這是一類與現(xiàn)代蛋白質組學研究相兼容的、相對較新這是一類與現(xiàn)代蛋白質組學研究相兼容的、相對較新的蛋白質顯色試劑，其設計專