培養(yǎng)基檢驗(yàn)方法-濾膜法

1、1、 方法概要本方法系以0.45孔徑之濾膜過濾水樣，檢測(cè)水中大腸桿菌（Escherichiacoli）。水樣過濾后置于mTEC培養(yǎng)基（modifiedmembrane-ThermotolerantEscherichiacoliAgar,縮寫為modifiedmTECAgar）上，于35±1C培養(yǎng)2小時(shí)，再以44.5+0.5C培養(yǎng)2224小時(shí)，大腸桿菌會(huì)形成紅色或紫紅色菌落。方法原理是培養(yǎng)基內(nèi)含之色原（5-溟-6-氯-3-口引噪-p-D-尿甘酸，5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-0-D-glucuronide）被大腸桿菌之尿甘酸化酶（p-D-glucuronidas

2、e）催化而產(chǎn)生紅色或紫紅色菌落。2、 適用范圍本方法適用于飲用水水質(zhì)、飲用水水源水質(zhì)、地面水體、地下水體、廢水、污水、及海水等水樣中大腸桿菌之檢驗(yàn)。但不適于高濁度及含有干擾物質(zhì)水樣之檢測(cè)。3、 干擾（1） 水樣中含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)之物質(zhì)時(shí)，會(huì)影響水樣之檢測(cè)結(jié)果。（2） 檢驗(yàn)使用的玻璃器皿及設(shè)備含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)之物質(zhì)時(shí)，會(huì)影響水樣之檢測(cè)結(jié)果。（3） 懸浮微粒過高或含有膠體的水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細(xì)菌菌落彌漫生長(zhǎng)（Spreading）而影響水樣檢驗(yàn)結(jié)果之判讀。4、 設(shè)備（1） 量筒：一般使用1001000mL之量筒。（2） 吸管：一般使用110mL之滅菌玻璃吸管或無菌塑料

3、吸管，應(yīng)有0.1mL之刻度。（3） 稀釋瓶：1001000mL能耐高壓滅菌之有蓋硼硅玻璃制品。（4） 三角錐瓶：2502000mL能耐高壓滅菌之硼硅玻璃制品。（5） 采樣容器：無菌之玻璃或塑料制有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。（6） 培養(yǎng)皿：硼硅玻璃或可拋棄式塑料制培養(yǎng)皿?？墒褂?0X15mm、50X12mm或其它適當(dāng)大小者。（7） 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌之玻璃、塑料、陶瓷或不銹鋼等材質(zhì)構(gòu)成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定于底座。（8） 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207kPa者。（9） 濾膜：使用直徑47mm、孔徑0.45從m且有格子記號(hào)的無菌濾膜，能使水中大腸桿

4、菌完全滯留者。（十）鐐子：前端圓滑內(nèi)側(cè)無波紋。（H一）水浴槽：溫度能維持在50c左右者。如用于44.5C培養(yǎng)，溫度必須能維持在44.5土0.5C。（十二）培養(yǎng)箱：溫度能維持在35+1C者。如用于44.5C培養(yǎng)，溫度必須能維持在44.5土0.5C。（十三）加熱板：附磁石攪拌功能者。（十四）天平：能精稱至0.01g者。（十五）高壓滅菌釜：能以中心溫度121（壓力約15lb/in2或1.1kg/cm2）滅菌15分鐘以上者。（十六）烘箱：用于玻璃器皿等用具之干熱滅菌，溫度能維持在160C達(dá)2小時(shí)或170c達(dá)1小時(shí)以上者。5、 試劑及材料本方法所使用的化學(xué)藥品均為試藥級(jí)，培養(yǎng)基為微生物級(jí)制品（1） 培養(yǎng)

5、基mTEC培養(yǎng)基（modifiedmTECAgar）成份：3號(hào)蛋白陳（ProteasePeptone33）5.0g酵母抽出物（YeastExtract）3.0g乳糖（Lactose）10.0g氯化鈉（SodiumChloride）7.5g磷酸氫二鉀（DipotassiumPhosphate）3.3g磷酸二氫鉀（MonopotassiumPhosphate）1.0g硫酸月卞酸鈉（SodiumLaurylSulfate）0.2g脫氧膽酸鈉（SodiumDesoxycholate）0.1g5-溟-6-氯-3-口引噪-P-D-尿甘酸（5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-&D-

6、glucuronide）0.5g瓊脂（Agar）15.0g使用市售商品化培養(yǎng)基45.6g，加入1公升的蒸儲(chǔ)水，煮沸溶解后以121c高溫高壓滅菌15分鐘，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.3±0.2。取出后置于4550C之水浴槽待溫度下降至恒溫，培養(yǎng)基混搖均勻后分裝于培養(yǎng)皿中，厚度約35mm。凝固后避光保存于冰箱中備用，分裝后之培養(yǎng)基保存期限為14天?？梢罊z測(cè)需要量按比例適量配制。（2） 無菌稀釋液無菌稀釋液一：非海水水樣檢測(cè)稀釋用。配制方法如下：磷酸二氫鉀儲(chǔ)備溶液取3.4g磷酸二氫鉀（KH2P。4）溶于50mL的蒸儲(chǔ)水中，待完全溶解后，以1.0MNaOH溶液調(diào)整其pH值為7.20±0

7、.05,然后加蒸儲(chǔ)水至全量為100mL，滅菌（過濾滅菌或121c高溫高壓滅菌15分鐘）后，儲(chǔ)存于冰箱中作為儲(chǔ)存液備用。氯化鎂儲(chǔ)備溶液取8.1g氯化鎂（MgCl2?6H2。）先溶于少量蒸儲(chǔ)水，待完全溶解后，再加蒸儲(chǔ)水至全量為100mL,滅菌（過濾滅菌或121c高溫高壓滅菌15分鐘）后，保存于冰箱中作為儲(chǔ)存液備用。無菌稀釋液分別取10mL氯化鎂儲(chǔ)備溶液和2.5mL磷酸二氫鉀溶液，加入蒸儲(chǔ)水至全量為2000mL,混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經(jīng)121c高溫高壓滅菌15分鐘，作為無菌稀釋液備用。無菌稀釋液二：海水或含鹽水樣稀釋用。磷酸二氫鈉（NaH2P。4）0.58g磷酸氫二鈉（Na2HPO4）2.50

8、g氯化鈉（NaCl）8.50g將上述成分溶解于1公升的蒸儲(chǔ)水中，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經(jīng)121c滅菌15分鐘，其滅菌后之pH值為7.4+0.2o6、 采樣與保存（1） 采取微生物檢測(cè)之水樣時(shí)，應(yīng)使用清潔并經(jīng)滅菌之玻璃或塑料容器或市售無菌采樣袋。且于采樣時(shí)應(yīng)避免受到污染。水樣若含有余氯時(shí)，無菌容器中應(yīng)加入適量無菌之硫代硫酸鈉（120mL的水樣中加入0.1mL、10%的硫代硫酸鈉可還原15mg/L的余氯）。（2） 水樣運(yùn)送及保存之溫度應(yīng)維持在05C并于采樣24小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。（3） 水樣量以能做完所需檢測(cè)為度，但不得少于200mLo7、 步驟（1） 水樣在進(jìn)行檢測(cè)或稀釋之前必須劇烈搖晃25次

9、以上，以使樣品充分混合均勻。（2） 水樣稀釋：飲用水水樣不需稀釋。其它樣品則視水樣中大腸桿菌可能濃度范圍進(jìn)行水樣稀釋。使用無菌吸管吸取10mL之水至90mL之無菌稀釋液中，形成10倍稀釋度之水樣，混搖均勻。而后自10倍稀釋度水樣以相同操作方式進(jìn)行一系列之100、1000倍等稀釋水樣，并混搖均勻。進(jìn)行上述稀釋步驟時(shí)，均需更換無菌吸管。（3） 以無菌鐐子夾起無菌濾膜，放在無菌過濾裝置之有孔平板上，小心將漏斗固定。將過濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無菌稀釋液，以測(cè)定過濾設(shè)備是否裝置妥當(dāng)。（4） 檢驗(yàn)飲用水水樣時(shí)，直接過濾100mL的水樣。其它水樣視大腸桿菌可能濃度范圍，以無菌吸管吸取10mL的原液及（

10、或）各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。過濾后，再以20至30mL之無菌稀釋液沖洗漏斗。每個(gè)稀釋度水樣均需進(jìn)行兩重復(fù)。（5） 沖洗過濾后，解開真空裝置，將漏斗移開，盡速以無菌鐐子取出過濾后之濾膜置于培養(yǎng)基上。濾膜應(yīng)與培基完全貼合，避免產(chǎn)生氣泡。培養(yǎng)皿倒置于35+1C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，然后再于44.5±0.5C的培養(yǎng)箱或水浴槽中培養(yǎng)2224小時(shí)。如放置于水浴槽中培養(yǎng)，應(yīng)將培養(yǎng)皿倒置密封于防滲水塑料袋內(nèi)（如采樣袋），塑料袋須完全浸入水中。如使用松蓋培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，應(yīng)將培養(yǎng)皿放置于密閉容器中，且容器內(nèi)側(cè)底部應(yīng)放置濕紙巾或濕布，以避免培養(yǎng)基之水份喪失而影響細(xì)菌生長(zhǎng)。（6） 過濾

11、不同稀釋度水樣時(shí)，應(yīng)更換無菌過濾器（漏斗）。亦可將過濾器（漏斗）以火烤后約降至室溫重復(fù)使用。（7） 計(jì)算并記錄各稀釋度培養(yǎng)皿中所產(chǎn)生的紅色或紫紅色菌落。若菌落過多造成判讀困難，則以大腸桿菌菌落太多無法計(jì)數(shù)（E.coliToonumeroustocount;TNTC）表示。8、 結(jié)果處理（1） 選取大腸桿菌菌落數(shù)介于20至80間之同一稀釋度的兩個(gè)培養(yǎng)皿，計(jì)算其每100mL水樣之大腸桿菌菌落數(shù)，單位為CFU/100mL。計(jì)算公式如下：大腸桿菌菌落數(shù)=所選取培養(yǎng)皿之紅色或紫紅色菌落數(shù)x100（CFU/100mL）所選取培養(yǎng)皿之實(shí)際水樣體積總合（2） 培養(yǎng)皿之大腸桿菌菌落數(shù)不在20至80個(gè)菌落之間時(shí)，

12、則以下列方式處理：若原液及各稀釋度水樣中僅有一個(gè)稀釋度的一個(gè)培養(yǎng)皿菌落數(shù)在20至80個(gè)之間，則選取該稀釋度的兩個(gè)培養(yǎng)皿以上述公式計(jì)算之。若僅原液有大腸桿菌菌落產(chǎn)生，且少于20個(gè)，應(yīng)循上述公式計(jì)數(shù)菌落數(shù)；若過濾100mL原液，培養(yǎng)皿中均無菌落生長(zhǎng)，則結(jié)果以<1CFU/100mL表示；若過濾10mL原液，培養(yǎng)皿中均無菌落生長(zhǎng)，則結(jié)果以<10CFU/100mL表示。若各培養(yǎng)皿之大腸桿菌菌落數(shù)均不在20至80個(gè)之間，則選取大腸桿菌菌落數(shù)最接近80之同一稀釋度的兩個(gè)培養(yǎng)皿以上述公式計(jì)算。但不可選用菌落總數(shù)大于200之培養(yǎng)皿。（3） 數(shù)據(jù)表示：菌落數(shù)小于100時(shí)，以整數(shù)表示（小數(shù)字四舍五入），菌落數(shù)大于100以上時(shí)，取兩位有效數(shù)字，并以科學(xué)記號(hào)表示，例如菌落數(shù)為112時(shí)以1.1X102表示之，菌落數(shù)為117時(shí)以1.2X102表示之，菌落數(shù)為65000時(shí)以6.5X104表示。（4） 檢測(cè)紀(jì)錄必須注明采樣時(shí)間、開始培養(yǎng)時(shí)間、結(jié)束培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基名稱及各稀釋度的原始數(shù)據(jù)。9、 質(zhì)量管理（1） 微生物采樣及檢測(cè)人員應(yīng)具備微生物基本訓(xùn)練及知識(shí)。（2） 進(jìn)行微生物檢測(cè)時(shí)，所用的盛裝器具均應(yīng)經(jīng)滅菌處理。（3） 每次采樣時(shí)，應(yīng)進(jìn)行一組運(yùn)送空白及野外空白。（4） 每批次或每10個(gè)水樣須進(jìn)行一次試劑空白。（5）