普通光學(xué)顯微鏡的使用單染色和革蘭氏染色

1、 【實驗題目】普通光學(xué)顯微鏡的使用，單染色及革蘭氏染色【實驗?zāi)康摹?. 學(xué)習(xí)并掌握顯微鏡的結(jié)構(gòu)功能和使用。2.學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。3.學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色法。4.初步認(rèn)識細菌的顯微形態(tài)?！緦嶒炂鞑摹?、 菌種：金黃色葡萄球菌（G+）、大腸桿菌（G-）、枯草芽孢桿菌以及自選菌種兩種 2、溶液和試劑： a) 草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅復(fù)染液等各種染料以及碘液、95%乙醇、無菌水等 b) 香柏油、二甲苯 3、 儀器及其它用品： 普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、綢布、酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿等【實驗原理】A、普通顯微鏡的基本原理 1、基本原理 現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來昂達成像

2、，故又稱為復(fù)式顯微鏡。它們包括機械部分和光學(xué)部分兩部分。機械部分包括鏡座、鏡臂、鏡筒、載物臺、物鏡轉(zhuǎn)換器、粗調(diào)節(jié)螺旋、細調(diào)節(jié)螺旋、標(biāo)本夾等。光學(xué)部分包括接目鏡、接物鏡、反光鏡、光圈（虹采）、聚光鏡（集光器）等。顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時折射率為1，而香柏油的折射 率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52

3、）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。2、油鏡 微生物學(xué)使用的顯微鏡的物鏡通常有低倍鏡（10×）、高倍鏡（40×）和油鏡（100×），油鏡是三者中放大倍數(shù)最大的，油鏡的焦距和工作距離最短，油鏡與其他物鏡不同的是載玻片與物鏡之間隔的不是一層空氣（干燥系），而是一層油脂，稱為“油浸系”。由于香柏油與玻璃的折光率相似（香柏油為1.515，玻璃為1.52）。鏡檢時，滴加香柏油的作用是使光源盡可能多的進入物鏡中，避免光線通過折光率低的空氣（折光率為1.0）

4、而散失，因而能提高物鏡的分辨率，使物像明亮清晰（見下圖）圖2 介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時光線通過的比較B、簡單染色的原理細菌的涂片和染色是微生物學(xué)實驗中的一項基本技術(shù)。細菌的細胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對菌體進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)的方法叫做簡單染色。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用堿性染料進行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結(jié)合使細菌著色。經(jīng)

5、染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。當(dāng)細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。染色前必須固定細菌，其目的有二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形態(tài)。 C、革蘭氏染色的基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細菌分類和鑒定的重要性狀。革蘭氏染色法不僅能觀察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用

6、G- 表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細胞而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。 革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的

7、那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落，碘是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細胞進行脫色，不同類型的細胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95的酒精。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區(qū)分成G 和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。 經(jīng)此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。G+ G-1）G菌

8、：細胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細胞膜上。呈紫色。 2）G菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細胞壁，沙黃復(fù)染后呈紅色?！緦嶒炄菁安襟E】 A 顯微鏡的使用方法 1、安放右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡體保持直立。桌面要清潔、平穩(wěn)，要打開實驗臺上的燈光。2、低倍鏡觀察 先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動調(diào)光旋鈕（可變電壓調(diào)節(jié)旋鈕），調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細調(diào)對準(zhǔn)焦距進行觀察。 3、高倍鏡觀察 顯微鏡的設(shè)計一般是共焦點的。低

9、倍鏡對準(zhǔn)焦點后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對準(zhǔn)焦點，只要稍微轉(zhuǎn)動微調(diào)即可。4、油浸鏡觀察 油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點。沒有自動止降裝置的，對準(zhǔn)焦點的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點。 使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點，并放大聚光鏡下的

10、虹彩光圈，否則會降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。 B 簡單染色 1、 流程圖：、加熱、固定、干燥洗片、干燥涂片染色水洗干燥鏡檢2、 具體步驟：1)洗片、干燥取一塊載玻片，用水浸濕，用手使用去污粉洗凈玻片，豎立在一邊自然干燥。干燥后在玻片的一面用記號筆做好標(biāo)記。方便以后水洗染料，避免洗去細菌。2)涂片 取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無菌水，用接種環(huán)無菌操作將沾有菌的接種環(huán)置于載玻片上的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多，但是大腸桿菌較小，為短桿狀，可適當(dāng)多取）；3)干燥與固定 涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過

11、程應(yīng)使載玻片通過火焰2-3次，注意溫度的控制，過熱的溫度會將細菌殺死，溫度以手背感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；4)染色 將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1-2min 5)水洗 傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無色為止；6)干燥 用吸水紙吸去多余水分后自然干燥； 7)鏡檢 將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌的形態(tài)。c） 革蘭氏染色1、流程圖：加熱、固定洗片、干燥涂片初染水洗媒染水洗脫色水洗復(fù)染干燥鏡檢2、 重要步驟： 1)洗片、干燥取一塊載玻片

12、，用水浸濕，用手使用去污粉洗凈玻片，豎立在一邊自然干燥。干燥后在玻片的一面用記號筆做好標(biāo)記。方便以后水洗染料，避免洗去細菌。2) 涂片 在標(biāo)記的載玻片一側(cè)分別滴加半滴無菌水。分別取6種活躍生長期菌種（金黃色葡萄球菌，大腸桿菌（1），大腸桿菌（2），枯草芽孢桿菌，自選菌（1），自選菌（2）按常規(guī)方法涂片（不宜過厚）。3)加熱、固定用酒精燈按照簡單染色中所述干燥和固定的方法對6種菌進行干燥和固定。 4) 初染 滴加草酸銨結(jié)晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗； 5) 媒染 先用碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗； 6) 脫色 先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫

13、色約30s，立即用水沖洗； 7) 復(fù)染 先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復(fù)染2min后水洗； 8) 鏡檢 將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對照，來判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結(jié)果?！窘Y(jié)果分析】 1、 實驗圖示 金色球葡萄球菌 大腸桿菌（1） 大腸桿菌（2）枯草桿菌 自選菌（1） 自選菌（2） 革蘭氏染色結(jié)果 金黃色葡萄球菌 大腸桿菌（1） 大腸桿菌（2） 枯草芽孢桿菌 自選菌（1） 自選菌（2）2、 實驗結(jié)果 革蘭氏染色結(jié)果菌種名稱菌體顏色細菌形態(tài)結(jié)果（

14、革蘭氏陰性/陽性）金黃色葡萄球菌藍色球狀陽性大腸桿菌（1）淡紅色短桿狀陰性大腸桿菌（2）紅色短桿狀陰性枯草芽孢桿菌藍色桿狀陽性自選菌（1）藍色球狀陽性自選菌（2）藍色球狀陽性3、 實驗結(jié)果分析 本次實驗通過對簡單染色及革蘭氏染色的學(xué)習(xí)使我們對革蘭氏染色的原理及操作步驟有了初步的認(rèn)識。而且實驗結(jié)果讓我們對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的外部形態(tài)以及革蘭氏陽性與陰性有了一個初步的了解。并且可以通過自己對未知菌進行革蘭氏染色來判斷其細胞壁的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌為一般聚集成團，大腸桿菌為橢圓狀短桿菌而枯草芽孢桿菌為雙桿菌，同時他們分別為革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性

15、菌。自選菌革蘭氏染色呈紫色，可初步斷定其為陽性菌，其細胞形態(tài)和金黃色葡萄球菌極為相似，可能為金黃色葡萄球菌?！舅伎寂c討論】 1、革蘭氏染色是否成功。有哪些問題需要注意？A、 滴在載物板上的水滴滴加時應(yīng)用點滴法，避免水滴過大占用空間，難以干燥并且可能造成不同編號之間造成交叉污染。B、 加熱干燥時，應(yīng)用手背試溫，避免因為溫度過高燒干細菌，導(dǎo)致細菌細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，影響觀察。C、 在進行染色是應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制時間，酒精脫色時間不宜過長，否則易造成假陰性。D、 在沖洗結(jié)晶紫，碘液，95%乙醇、番紅的時候，應(yīng)采用緩慢的水流沖洗載玻片背部，是水流分支沖洗正面即可，不可用水流直接沖洗載玻片正面。E、 沖洗染料的程度為：沿載玻片邊緣流下的水滴呈無色即可。F、 在加入碘液媒染、酒精脫色時，應(yīng)當(dāng)先用相應(yīng)試劑沖洗載玻片正面，防止玻片上的水將試劑稀釋，再用試劑覆蓋細菌，開始計時。2、 現(xiàn)有一株未知桿菌，個體明顯大于大腸桿菌，如何鑒定它是革蘭氏陽性還是陰性，