六種細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的比較

1、    六種細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的比較        細(xì)胞凋亡已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著研究的日益深入,細(xì)胞凋亡的檢測(cè)技術(shù)日漸成熟和完善,如形態(tài)學(xué)檢查、DNA降解分析和流式細(xì)胞分析(FCA)等1。我以地塞米松(DEX)誘導(dǎo)淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡,利用6種不同方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,并比較其結(jié)果，對(duì)這些方法加以評(píng)價(jià)。一、材料與方法1.材料：（1）細(xì)胞系：Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株(Raji，澳大利亞墨爾本大學(xué)醫(yī)學(xué)院Austin醫(yī)院血液科提供),常規(guī)培養(yǎng)于10%熱滅活小牛血清的RP

2、MI 1640液中。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于指數(shù)生長(zhǎng)期。（2） 主要試劑：DNA未端定量(TdT)法和放射自顯影法的試劑分別由Pharmacia和Bresatec公司提供；FCA試劑購(gòu)置于Bender Med System公司，原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法試劑來自Boehring Mannheim公司；其它化學(xué)試劑由Sigma公司提供。2.方法：（1）細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)培養(yǎng)2：5 ml Raji細(xì)胞(1×107個(gè)/ml)與1.0 mol/L DEX培養(yǎng)2、4、8和16小時(shí)后,分別收集細(xì)胞,作細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。對(duì)照組不加DEX培養(yǎng)16小時(shí)。（2）DNA抽提和凝膠電泳3： Raji細(xì)胞的DNA抽提

3、按標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿-異戊醇抽提法進(jìn)行。通過測(cè)定DNA溶液在260 nm和280 nm的吸光度確定DNA的量與純度。凝膠電泳時(shí)取約1 g DNA樣品，在TBE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠上，5.0 V/cm電泳3小時(shí)，溴化乙錠(EB)染色,在紫外發(fā)光儀下觀察并照相。（3）透射電鏡（EM）觀察:培養(yǎng)細(xì)胞離心,以PBS液洗2次后，用2.5%的戊二醛于4 冰箱固定30分鐘，常規(guī)制作電鏡標(biāo)本,雙鉛染色后,置1200EX型透射電鏡(JEOL公司)觀察。（4）TdT法和放射自顯影法：采用已建立的TdT法4和利用同一標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行的放射自顯影法5分析DNA梯形帶。（5）TUNEL6：培養(yǎng)細(xì)胞離心以新鮮配制的4%多聚甲醛

4、PBS液(pH7.4)室溫下固定30分鐘,然后用Boebringer Mannbeim公司提供的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記產(chǎn)物在光鏡下顯棕色。（6）FCA7：培養(yǎng)細(xì)胞以0.1 mmol/L PBS液(pH7.4)洗2次，懸溶于190 l結(jié)合緩沖液中,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。加10 l異硫氰酸熒光素(FTIC)標(biāo)記的連接素(Annexin)和10 l的20 mg/L的普匹碘氨(PI),混勻,避光室溫孵育10分鐘。用結(jié)合緩沖液洗1次后用Coulter Elite 流式細(xì)胞儀 (Coulter公司)進(jìn)行分析。二、結(jié)果1.DEX誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡：透射電鏡與DNA梯形帶分析是目前鑒定

5、細(xì)胞凋亡最具特征性的指標(biāo)1，8。電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)DEX誘導(dǎo)8小時(shí)的Raji細(xì)胞有典型的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)。其特征是細(xì)胞核體積縮小,染色質(zhì)濃縮致密,并沿核膜分布形成新月體狀,細(xì)胞膜微絨毛消失,但細(xì)胞漿內(nèi)的各種細(xì)胞器基本正常(1)。未經(jīng)DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞8小時(shí)培養(yǎng)后仍未見典型的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)。瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯影分析結(jié)果（2）表明，經(jīng)DEX誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞DNA呈現(xiàn)典型的梯形帶,但放射自顯影較瓊脂糖凝膠電泳至少敏感50倍以上,因在同樣條件下檢測(cè)DNA梯形帶,前者僅需DNA 5 ng,而后者卻至少需250 ng。同時(shí),TUNEL結(jié)果顯示DEX誘導(dǎo)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞核內(nèi)有明顯的標(biāo)記產(chǎn)物出現(xiàn)。根

6、據(jù)電鏡與TUNEL的形態(tài)學(xué)識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)1，6，9，由2位有經(jīng)驗(yàn)的觀察者以雙盲法分別記數(shù)500個(gè)細(xì)胞,結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞數(shù)隨DEX誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加(2，表1)。 1DEX誘導(dǎo)組的Raji細(xì)胞，凋亡細(xì)胞()×2 000M：分子量標(biāo)志，1：DNA-50 ng，2：DNA-250 ng，3：DNA-1250 ng(左)，DNA-500 ng、DNA-50 ng、DNA-5 ng(右)；4：對(duì)照組DNA2DEX誘導(dǎo)組瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯影分析的結(jié)果2.FCA定量凋亡細(xì)胞：對(duì)15 00020 000細(xì)胞進(jìn)行FCA定量分析并區(qū)分活細(xì)胞(連接素V陰性/普匹碘氨陰性),凋亡細(xì)胞(連接素V陽性/普匹碘氨

7、陰性),繼發(fā)性壞死細(xì)胞(連接素V陽性/普匹碘氨陽性),機(jī)械性損傷細(xì)胞(連接素V陰性/普匹碘氨陽性)。FCA結(jié)果顯示,凋亡細(xì)胞數(shù)與DEX孵育時(shí)間呈顯著的正相關(guān)(r>0.95)(3，表1)。3三種凋亡細(xì)胞方法檢測(cè)結(jié)果的比較表1四種檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法結(jié)果比較(%)時(shí)間組（h）電鏡凋亡細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞FCA 連接素-V陽性細(xì)胞TdT次/(min.g)DNA)0(0.5)(0.8)(2.0)3 9402(0.6)(2.3)(4.3)180 9004(2.3)(4.5)(6.5)266 8008(7.5)(11.2)(9.8)469 05016(16.7)(18.9)(13.2)701 2363

8、.TdT法定量DNA降解末端：TdT法分析DEX誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明, DNA末端標(biāo)記量與DEX濃度大小和作用時(shí)間長(zhǎng)短呈顯著正相關(guān)(r>0.98，4);經(jīng)1.0 mol/L DEX作用不同時(shí)間(2、4、8、16小時(shí))的Raji細(xì)胞產(chǎn)生的DNA末端標(biāo)記量較對(duì)照組高約45、68、119和178倍,與其他方法相比,顯示TdT法具有高檢測(cè)靈敏度(表1)。 4TdT法定量DNA末端標(biāo)記量結(jié)果4.4種細(xì)胞凋亡方法的比較：以線性回歸對(duì)4種細(xì)胞凋亡方法（電鏡、TUNEL、FCA和TdT法）的結(jié)果分析表明，DEX誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)或DNA降解末端標(biāo)記量與DEX作用時(shí)間具有顯著的相關(guān)性(r

9、>0.98)。用電鏡作為檢測(cè)凋亡細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)1，10，與其他3種方法(TUNEL、FCA、TdT)比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著相關(guān)性(r0.98)。把TdT法與FCA的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),二者仍有良好的相關(guān)性(r=0.99)。三、討論通過對(duì)6種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),既簡(jiǎn)單又特異的方法仍是經(jīng)典的透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察和凝膠電泳檢測(cè)DNA梯形帶,但其缺乏檢測(cè)的靈敏度,而且難以定量；應(yīng)用末端標(biāo)記結(jié)合放射自顯影可使DNA梯形帶的分析較凝膠電泳檢測(cè)的靈敏度提高至少50倍;4種定量細(xì)胞凋亡的方法（透射電鏡、TUNEL、FCA、TdT法）的檢測(cè)結(jié)果之間有較好的相關(guān)性。同時(shí), FCA快速、準(zhǔn)確，適用于單

10、個(gè)或培養(yǎng)細(xì)胞(如血液,骨髓)的檢測(cè),而TdT法的檢測(cè)靈敏度很高,如與檢測(cè)特異性強(qiáng)的方法結(jié)合,可使分析效果更佳。值得提出的是,依賴形態(tài)學(xué)的透射電鏡或TUNEL法定量凋亡細(xì)胞費(fèi)時(shí)效率較低,重復(fù)性較差8，9。本文6種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法的檢測(cè)特點(diǎn)和原理不盡相同。有4種方法是分析凋亡細(xì)胞核酸內(nèi)切酶的激活引起的DNA降解,它們分別是檢測(cè)DNA梯形帶的凝膠電脈和放射自顯影,標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)降解DNA產(chǎn)生的3-OH末端(TUNEL),定量DNA末端的標(biāo)記量(TdT法),但后兩種方法的特異性不強(qiáng)是因其他形式的死亡細(xì)胞,如壞死細(xì)胞也可以引起TUNEL和TdT法的陽性結(jié)果11。本文的FCA陽性結(jié)果是基于凋亡細(xì)胞膜上磷脂對(duì)

11、稱性的改變,而使磷脂酰絲氨酸外露,進(jìn)而與連接素V特異結(jié)合,同時(shí)用PI分析細(xì)胞膜的完整性以定量檢測(cè)早期的凋亡細(xì)胞和晚期的壞死細(xì)胞數(shù),結(jié)果客觀、快速、重復(fù)性好。通過對(duì)6種檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法的比較研究發(fā)現(xiàn),目前尚無完美的檢測(cè)手段,眾多研究方法各具特點(diǎn),也有其局限性,故在研究細(xì)胞凋亡時(shí),需結(jié)合既特異、靈敏,又能定量的多種檢測(cè)手段,檢測(cè)細(xì)胞在凋亡發(fā)生過程中的不同事件,提供更加準(zhǔn)確、客觀、全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。志謝:本課題在澳大利亞墨爾本大學(xué)醫(yī)學(xué)院Austin醫(yī)院血液科、病理科完成。本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)39870296)作者單位：610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，檢驗(yàn)科參考文

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