抗生素最低抑菌濃度

1、抗生素最低抑菌濃度（MIC）和半數(shù)抑菌濃度（MIC）測(cè)定方法幾種測(cè)定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）方法：1.1. 常量肉湯稀釋法1.1.1, 抗菌藥物貯存液制備抗菌藥物貯存液濃度不應(yīng)低于1000g/ml（如1280g/ml）或10倍于最高測(cè)定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。抗菌藥物直接購自廠商或相關(guān)機(jī)構(gòu)。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計(jì)算。例如：需配制100ml濃度為1280科g/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為750科g/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6mg。根據(jù)公式計(jì)算所需稀釋劑用量為：（182.6mgx750科g/ml）/1280g

2、/ml=107.0ml,然后將182.6mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。制備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60C以下環(huán)境，保存期不超過6個(gè)月。1.1.2, 藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍根據(jù)NCCL凱菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值，特殊情況例外。1.1.3, 培養(yǎng)基NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH肉湯，pH7.27.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在測(cè)試葡萄球菌對(duì)苯哇西林的敏感性時(shí)，應(yīng)在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按制造廠家的要求配制需要量的MH5湯。嗜血桿菌屬菌使用HT

3、M湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%5籀解馬血的MH肉湯。1.1.4, 接種物的制備有2種方法配制接種物，一是細(xì)菌生長(zhǎng)方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個(gè)，接種于4-5ml的水解酪蛋白（MH肉湯中，35c孵育2-6h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含12X108CFU/mL二是直接菌落懸液配制法，對(duì)某些苛養(yǎng)菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養(yǎng)1824h的菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。用MH5湯將上述菌懸液進(jìn)行1：100稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非

4、選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。1.1.5, 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種取無菌試管（13X100mm13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml,在第1管加入抗菌藥物原液（如1280gg/ml）0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。此時(shí)各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25科g/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml,使每管最終菌?濃度約為5X105CFU/mL第1管至第11

5、管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125科g/ml。1.1.6, 孵育將接種好的稀釋管塞好塞子，置35c普通空氣孵箱中孵育1620h;嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育2024h;對(duì)可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌應(yīng)持續(xù)孵育滿24ho1.1.7, 結(jié)果判斷與解釋在讀取和報(bào)告所測(cè)試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長(zhǎng)對(duì)照管的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好，同時(shí)還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的MIC甲氧芳胺喀咤或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點(diǎn)判斷，與陽性生長(zhǎng)對(duì)照管比較

6、抑制80%ffl菌生長(zhǎng)管藥物濃度為受試菌MIQ根據(jù)NCCL雕薦的分界點(diǎn)值標(biāo)準(zhǔn)，判斷耐藥（resistant,R）、敏感（susceptible,S）或中介（intermediate,I）。S表示被測(cè)菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌癥除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所達(dá)到的濃度所抑制，或?qū)儆诰哂刑囟退帣C(jī)理（如3-內(nèi)酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。還表示被測(cè)菌株可以通過提高劑量（如3-內(nèi)酰胺類藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作為“緩沖域”，以防止由微小的技術(shù)

7、因素失控，所導(dǎo)致較大的錯(cuò)誤解釋。1.2. 微量肉湯稀釋法1.2.1, 抗菌藥物和培養(yǎng)基制備同常量肉湯稀釋法。1.2.2, MIC板制備無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10“，第12孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照，冰凍干燥后密封，-20C以下保存?zhèn)溆谩?.2.3, 接種物制備將用生長(zhǎng)法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1：1000稀釋后，向每孔中加100dl,密封后置35c普通空氣孵箱中，孵育1620h判斷結(jié)果。當(dāng)試驗(yàn)嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時(shí)，孵育時(shí)間為2024h,試驗(yàn)葡萄球菌和腸球菌對(duì)苯哇西林和萬古霉

8、素的藥敏試驗(yàn)時(shí)孵育時(shí)間必須滿24h。此時(shí)，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125科g/ml。1.2.4, 結(jié)果判斷以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC當(dāng)陽性對(duì)照孔（即不含抗生素）內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報(bào)告結(jié)果，需重復(fù)試驗(yàn)。通常對(duì)革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測(cè)得的MIC與常量肉湯稀釋法測(cè)得的結(jié)果相同或低一個(gè)稀釋度（1孔或2倍）。.瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50c左右的定量MH瓊脂中，制成含不

9、同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIQ本法優(yōu)點(diǎn)是可在一個(gè)平板上同時(shí)作多株菌MIC測(cè)定，結(jié)果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點(diǎn)是制備含藥瓊脂平板費(fèi)時(shí)費(fèi)力。培養(yǎng)基制備使用MH瓊脂，按商品說明書進(jìn)行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎(chǔ)加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH脂（當(dāng)試驗(yàn)磺胺藥時(shí)，使用溶解的馬血）。含藥瓊脂平板制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在4550c水浴中平衡的MH®脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度34mm通常按1：9比例配制藥物瓊脂平板，

10、根據(jù)需要來選擇藥物濃度范圍。配制好的含藥瓊脂平板應(yīng)裝入密封塑料袋中，置28c冰箱可貯存5天。接種物制備與接種制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再1：10稀釋，以多點(diǎn)接種器吸取制備好菌液（約12"）接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌數(shù)約為104CFU形成直徑為58mm勺菌斑。接種好后置35c孵育1620h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬古霉素耐藥腸球菌孵育時(shí)間應(yīng)滿24h）,觀察結(jié)果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置5%：氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。結(jié)果判斷將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。在含甲氧芳胺喀咤或磺胺瓊脂平板上可見輕微細(xì)菌生長(zhǎng)，

11、與生長(zhǎng)對(duì)照比較抑制80%A上細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為終點(diǎn)濃度。如果出現(xiàn)有2個(gè)以上菌落生長(zhǎng)于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。.E試驗(yàn)（E-test）E試驗(yàn)是指濃度梯度瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，其原理基本同擴(kuò)散法，即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴(kuò)散，在試條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗(yàn)綜合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，同時(shí)還彌補(bǔ)了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測(cè)出抗菌藥物對(duì)受試菌的MIC培養(yǎng)基、菌液制備和接種同紙片擴(kuò)散法。貼E試驗(yàn)條同紙片擴(kuò)散法，E試驗(yàn)條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂后不得再移動(dòng)。直徑150mmB勺平皿內(nèi)可放置6根E試驗(yàn)試條，90mmt一般只能放置1根。3.3.孵育時(shí)間和溫度同紙片擴(kuò)散法。結(jié)果閱讀孵育后圍繞試條可形成一個(gè)橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數(shù)刻度即是測(cè)定抗菌藥物對(duì)受試菌的MIC閱讀時(shí)應(yīng)注意的問題見供應(yīng)商的產(chǎn)品說明書。主要有三種：稀釋法，紙片擴(kuò)散法.E-test法稀釋法就