消毒劑消毒效果驗證方案

1、1、 驗證方案的起草起草人部門日期2、 驗證方案的審批審核人部門日期3、 驗證方案的批準(zhǔn)批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期1前言2職責(zé)3驗證的方法及步驟4異常情況及偏差處理5.驗證結(jié)果評價及建議6、再驗證周期1 .前言消毒劑主要使用在潔凈控制區(qū)域，用于控制生產(chǎn)環(huán)境、設(shè)備表面等的微生物污染的一種化學(xué)劑。由于沒有一種消毒劑是完全理想的，因此有必要在實際工作中使用兩種以上的消毒劑。交替使用在理論上有利于防止形成相同環(huán)境的分離菌或抑制細(xì)菌的適應(yīng)性。本實驗方案針對75%醇、1%新潔爾滅、3/酚皂殺菌劑、3%勺過氧化氫溶液共4種消毒劑進(jìn)行抑制或者殺滅微生物的效果確認(rèn)。1.1 驗證的目的本驗證的目的在于制定方法及可接受標(biāo)準(zhǔn)，來

2、評價消毒劑對微生物的殺滅效果。3.2 驗證的范圍75%J1、1%f潔爾滅、3刈酚皂?容液、3%勺H2C23.3 驗證內(nèi)容：本驗證先在實驗室對所使用的消毒劑，用六種控制菌做生物指示劑挑戰(zhàn)性實驗；然后做現(xiàn)場消毒考察實驗，即現(xiàn)場消毒后用棉簽取樣法對消毒后的表面取樣，做表面殘留微生物限度檢查。通過對指示菌的殺滅對數(shù)值和現(xiàn)場消毒后潔凈區(qū)表面微生物的殘留限度來確認(rèn)消毒劑的消毒效果。4 .職責(zé)驗證小組成員：部門人員職責(zé)驗證進(jìn)度.驗證方法及步驟實驗材料菌株(1)細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(ATCC6538)銅綠假單胞菌(ATCC15442)大腸桿菌(ATCC25922)傷寒桿菌(ATCC6539)(2)細(xì)菌芽抱：枯

3、草桿菌芽抱(ATCC9372)(3)真菌：白色念珠菌(ATCC10231)培無菌大豆胰蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。稀釋7取:1就白陳-0.03mol/LPBS溶液中和劑：0.1%磷脂+1%£溫80溶液；0.5慚代硫酸鈉(3%t氧化氫)無菌試管無菌平皿(90mm)消毒劑：75%L酉!、1%ff潔爾滅、3刈酚皂?容液、3%勺H2O2移液器及配套無菌吸頭:0-100ul,100-1000ul中和劑效力確認(rèn)中和劑效力及毒性試驗?zāi)康脑诨瘜W(xué)消毒試驗中，達(dá)到規(guī)定消毒時間終點(diǎn)時，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。因為消毒體系中殘留的消

4、毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。殘留消毒劑的去除，可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗獲得正確結(jié)果。中和法是指在消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時間的終點(diǎn)時，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。本試驗中所使用的中和劑必須既能有效抑制消毒劑的殺菌性(中和劑的效力試驗)同時又不削弱微生物活力的恢復(fù)(中和劑的毒性試驗)。中和劑效力、毒性確認(rèn)用稀釋劑將試驗菌制成5X1055X106cfu/ml的的菌懸液備用。準(zhǔn)備無菌試管6支，按表一試驗操作步驟表分組進(jìn)行操作。各組試者充分震蕩放

5、置于振蕩器震蕩至少20秒或在手掌上振敲80次，然后移取Iml混合液到平皿中做平皿計數(shù)，輕輕轉(zhuǎn)動平皿以使菌落在培養(yǎng)基表面均勻分散開來，每組做兩皿平皿，并做好標(biāo)記平皿在層流臺下吹干，倒置于37c下培養(yǎng)48小時后計數(shù)。具體結(jié)果見附件一中和劑中和效力評估測試記錄表一中和劑效力、毒性確認(rèn)試驗操作步驟及結(jié)果判斷分組試驗操作試驗?zāi)康脑囼灲Y(jié)果判斷A4.5ml消場劑+0.5ml國懸液作用10min取0.5ml作用?僅4.5ml稀釋液試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數(shù)。觀察消毒劑對試驗菌有無殺火或抑制能力。應(yīng)無試驗菌生長或極少數(shù)菌落生長B4.5ml消毒齊1J+0.5ml國懸液作m10mi取0.5

6、ml作用液f5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數(shù)。觀察殘留消毒液被中和后受至消毒劑作用后的試驗菌是否能恢復(fù)生長。B組菌落數(shù)比C、DE組少，并符合卜列要求：A組平均菌落數(shù)B組平均菌落數(shù)0>5X(110)>X+5丫(>10)>Y+0.5YC4.5ml中和齊1J+0.5ml菌懸液作用10min取0.5ml作用液4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數(shù)。觀察中和劑是否抑菌。仁ME組有相似蔗落敢.武組同薄落敢出才率應(yīng)不超過1品.獻(xiàn)間曲落數(shù)誤差率-q+ent1D+CUEHD4.5ml中和產(chǎn)物液+0.5ml菌懸液作用10min取

7、0.5ml作用液4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數(shù)。觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。3xCDECOE我小三機(jī)阿曲落總平均數(shù)：C.卜:分別衣示各組畫落平均數(shù)E4.5ml稀釋液+0.5ml菌懸液作用10min取0.5ml作用液一4.5ml稀釋液試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數(shù)。作為菌數(shù)對照F分別吸取1ml中和劑和1ml滅菌0.9%氯化鈉溶液于平皿中做活菌計數(shù)。作陰性對照應(yīng)無菌落生長備注若菌落太多不能計數(shù)，則移取1ml上述混合物，到9ml滅菌注射的生理鹽水中（稀釋10倍），充分振蕩后再移取1ml做平皿計數(shù)。試

8、驗結(jié)果符合上述所有條件，所測中和劑才可判為合格。消毒劑殺菌效率確認(rèn)（定量懸浮試驗）原理將定量的細(xì)菌懸液加入消毒劑溶液中，作用一定時間。去除殘留的消毒劑影響后，以上液定量接種于營養(yǎng)瓊脂平板上。經(jīng)培養(yǎng)后計算其菌落數(shù)。與未經(jīng)消毒劑作用的對照菌液平板計數(shù)相比較，計算出殺菌效率。菌懸液的制備用第三代的菌懸液按1:10用9ml的稀釋劑稀釋5次，計數(shù)培養(yǎng)，大約70-80之間，以獲得10-4-10-6數(shù)量級的菌懸液。將最終稀釋的10，10-5、10-6三個數(shù)量級，即三個稀釋梯度的菌懸液，各取2份1ml均勻接種涂布在培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)。將涂布的6塊平板在37c進(jìn)行培養(yǎng)，7天后進(jìn)行讀數(shù)，以確認(rèn)稀釋濃度。試驗

9、方法：4.5ml消毒劑+0.5ml菌懸液，作用10min,取0.5ml作用液，加到4.5ml中和劑試管中混勻，吸取1ml最終作用液于平皿中，做活菌計數(shù)。白色念珠菌2328c培養(yǎng)72h后計數(shù)，其它菌液3035c培養(yǎng)48h后計數(shù)。記錄每個梯度1.0ml樣品的菌落數(shù)（a1,a2）,a和a1的平均值都應(yīng)處于30-300CFU之間。記錄結(jié)果見附件二陽性對照：用稀釋劑代替消毒劑，進(jìn)行平行試驗，作為陽性對照。計算每一種挑戰(zhàn)菌種的Log下降值，并記下消毒劑的濃度和各自的接觸時間。殺滅對數(shù)值計算殺滅對數(shù)值（KL）=對照組平均3S菌濃度對數(shù)值-試驗組活菌濃度對數(shù)值判定標(biāo)準(zhǔn)消毒劑對挑戰(zhàn)菌的殺滅對數(shù)值3判為合格。結(jié)論

10、根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行計算，如果計算結(jié)果符合接受標(biāo)準(zhǔn)，即在一定的接觸時間內(nèi)，消毒劑能夠使挑戰(zhàn)菌水平下降99.9%（下降3個對數(shù)單位），則表明消毒劑能夠進(jìn)行日常消毒使用消毒劑的消毒效果現(xiàn)場考察消毒劑對物體表面消毒模擬現(xiàn)場鑒定試驗采樣計劃匯總表試驗位置試驗采樣時間及頻率風(fēng)險分析分裝機(jī)臺面消毒前、后，同一平面/、同采樣點(diǎn)分別進(jìn)行3次為保證消毒劑的效果，消毒前試驗應(yīng)在潔凈室及設(shè)備運(yùn)行之后，人員活動頻繁，設(shè)備及潔凈室墻面等最臟的時候進(jìn)行消毒前的采樣。分裝向墻向分裝問地面3.4.2試驗操作程序(1)隨機(jī)取物體表而(設(shè)備表面、臺面、門等)，用規(guī)格板標(biāo)定2塊面積各為25cm的區(qū)塊，一供消毒前采樣，一供消毒后采樣。(

11、2)消毒前，將無菌棉拭于含5ml中和劑試管中沾濕，對一區(qū)塊涂抹采樣，橫豎往返各8次。采樣后，將棉拭采樣端剪入原中和劑試管內(nèi)，漩渦混合儀震蕩20s或振打80次，作為消毒前樣本。(3)將配置好的消毒劑噴霧或涂擦于物體表面，保持濕潤10分鐘進(jìn)行消毒。消毒后，將無菌棉簽拭于中和劑試管中沾濕，并于試管壁上擠干后，對消毒區(qū)塊涂抹采樣，橫豎往返各8次。采樣后，以無菌操作方式將棉簽拭采樣端剪入原中和劑試管內(nèi)，漩渦混合儀震蕩20s或振打80次，作為消毒組樣本。擦拭法取樣示意圖(4)試驗結(jié)束后，將用過的同批次中和劑各1.0ml接種培養(yǎng)基，作為陰性對照組樣本。每份吸取1.0ml,以瓊脂傾注法接種平皿，每個樣本接種2

12、個平皿，放37。叵溫箱中培養(yǎng)48h,觀察最終結(jié)果。(5)計算殺滅對數(shù)值。殺滅對數(shù)值N=lg消毒前平均菌落數(shù)-lg消毒后平均菌落數(shù)。(6)判定標(biāo)準(zhǔn)消毒劑殺滅對數(shù)值3判為合格。(7)結(jié)論根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行計算，如果計算結(jié)果符合接受標(biāo)準(zhǔn)，即在一定的接觸時間內(nèi)，消毒劑能夠使菌落數(shù)水平下降99.9%（下降3個對數(shù)單位），則表明消毒劑能夠進(jìn)行日常消毒使用4異常情況及偏差處理異常情況處理程序日常監(jiān)測過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作。偏差或變更說明驗證過程中的偏差和異常必須詳細(xì)記錄和說明，并經(jīng)過調(diào)查分析和處理。5.驗證結(jié)果評價及建議質(zhì)量保證部負(fù)責(zé)收集各項驗證、試驗結(jié)果記錄，根據(jù)驗證、試驗結(jié)果起草驗證報

13、告,報驗證領(lǐng)導(dǎo)小組核對。驗證領(lǐng)導(dǎo)小組對驗證結(jié)果進(jìn)行綜合評審，做出驗證結(jié)論，發(fā)放驗證證書，確認(rèn)該再驗證周期。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括：驗證試驗是否有遺漏。驗證實施過程中對驗證方案有無修改，修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)。驗證記錄是否完整。驗證試驗結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，偏差及對偏差的說明是否合理，是否需要進(jìn)一步補(bǔ)充試驗。6、再驗證周期質(zhì)量保證部根據(jù)驗證結(jié)果確定再驗證周期。當(dāng)環(huán)境監(jiān)控的結(jié)果出現(xiàn)偏差時，應(yīng)重新評估目前使用的消毒劑，必要時更換消毒劑的品種以及調(diào)整消毒劑的使用周期。新消毒劑使用前均需經(jīng)效果驗證后方可使用。附件一中和劑中和效力評估測試記錄序號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（CFU/ml）75叱醇溶液1麻

14、潔爾火溶液3%P酚皂溶液3%勺過氧化氫溶液中和劑：1啞口磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1哪磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1聊磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液）+稀釋液2（消毒齊I+工作菌液）+中和劑3中和劑+工作菌液4（消毒齊IJ+中和劑）+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標(biāo)準(zhǔn)第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長；第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%陰性對照組應(yīng)尢菌生長。結(jié)論符合規(guī)定序號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（CFU/ml）75叱醇溶液1麻

15、潔爾火溶液3%P酚皂溶液3%勺過氧化氫溶液中和劑：1啞口磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1哪磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1聊磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液）+稀釋液2（消毒齊I+工作菌液）+中和劑3中和劑+工作菌液4（消毒齊IJ+中和劑）+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標(biāo)準(zhǔn)第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長；第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；第3、4、5組后相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%陰性對照組應(yīng)尢菌生長。結(jié)論符合規(guī)定序號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（CFU/ml）75叱醇溶液1麻

16、潔爾火溶液3%P酚皂溶液3%勺過氧化氫溶液中和劑：1啞口磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1哪磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1聊磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液）+稀釋液2（消毒齊I+工作菌液）+中和劑3中和劑+工作菌液4（消毒齊IJ+中和劑）+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標(biāo)準(zhǔn)第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長；第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%陰性對照組應(yīng)尢菌生長。結(jié)論符合規(guī)定序號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（CFU/ml）75叱醇溶液1麻

17、潔爾火溶液3%P酚皂溶液3%勺過氧化氫溶液中和劑：1啞口磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1哪磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1聊磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液）+稀釋液2（消毒齊I+工作菌液）+中和劑3中和劑+工作菌液4（消毒齊IJ+中和劑）+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標(biāo)準(zhǔn)第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長；第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%陰性對照組應(yīng)尢菌生長。結(jié)論符合規(guī)定序號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（CFU/ml）75叱醇溶液1麻

18、潔爾火溶液3%P酚皂溶液3%勺過氧化氫溶液中和劑：1啞口磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1哪磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1琳磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒布+工作菌液）+稀釋液2（消毒齊I+工作菌液）+中和劑3中和劑+工作菌液4（消毒劑+中和劑）+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標(biāo)準(zhǔn)第1組無菌生長，或僅用少數(shù)試驗菌菌落生長；第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；第3、4、5組后相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%陰性對照組應(yīng)無菌生長。結(jié)論符合規(guī)定序號項目類型菌落計數(shù)結(jié)果（CFU/ml）75叱醇溶液1麻潔爾

19、火溶液3%P酚皂溶液3%勺過氧化氫溶液中和劑：1啞口磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1哪磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：1聊磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑：0.5%硫代硫酸鈉1（消毒劑+工作菌液）+稀釋液2（消毒齊I+工作菌液）+中和劑3中和劑+工作菌液4（消毒齊IJ+中和劑）+工作菌液5陽性對照組6第3、4、5組間誤差率可接受標(biāo)準(zhǔn)第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長；第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少；第3、4、5組后相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)是誤差率不超過15%陰性對照組應(yīng)尢菌生長。結(jié)論符合規(guī)定附件二消毒劑效力評估測試記錄2.1消毒劑殺菌對數(shù)值菌落數(shù)記錄

20、挑戰(zhàn)細(xì)菌名稱：金黃色葡萄球菌實驗組A次試驗第二次試驗第三次試驗消毒齊IJ平皿1平皿2平皿1平皿2平皿1平皿275叱醇平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值1麻潔爾火平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值3劭酚皂平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值3%±氧化氫平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值陽性的對照平均菌落數(shù)挑戰(zhàn)細(xì)菌名稱：大腸桿菌實驗組A次試驗第二次試驗第三次試驗消毒齊IJ平皿1平皿2平皿1平皿2平皿1平皿275叱醇平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值1麻潔爾火平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值3劭酚皂平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值3%±氧化氫平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值陽性的對照平均菌落數(shù)挑戰(zhàn)細(xì)菌名稱：銅綠假單胞菌實驗組A次試驗第二次試驗第三次試驗消毒齊IJ平皿1平皿2平皿1平皿2平皿1平皿275叱醇平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值1麻潔爾火平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值3劭酚皂平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值3%±氧化氫平均菌落數(shù)殺菌對數(shù)值陽性的對照平均菌落數(shù)挑戰(zhàn)細(xì)菌名稱：傷寒桿菌實驗