可溶性糖測量方法

1、實驗12植物組織中可溶性糖含量的測定在作物的碳素營養(yǎng)中，作為營養(yǎng)物質(zhì)主要是指可溶性糖和淀粉。它們在營養(yǎng)中的作用主要有：合成纖維素組成細胞壁；轉(zhuǎn)化并組成其他有機物如核昔酸、核酸等；分解產(chǎn)物是其他許多有機物合成的原料，如糖在呼吸過程中形成的有機酸，可作為NH3的受體而轉(zhuǎn)化為氨基酸；糖類作為呼吸基質(zhì)，為作物的各種合成過程和各種生命活動提供了所需的能量。由于碳水化合物具有這些重要的作用，所以是營養(yǎng)中最基本的物質(zhì)，也是需要量最多的一類。I慈酮法測定可溶性糖一、原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與慈酮反應(yīng)生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量

2、成正比，故可用于糖的定量測定。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（因為反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)），所以用慈酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用慈酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與慈酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與慈酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之

3、，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。糖類與慈酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為620nm,故在此波長下進行比色。二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實驗材料任何植物鮮樣或干樣。（二）試劑1 .80%乙醇。2 .葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ag/mL）:準(zhǔn)確稱取100mg分析純無水葡萄糖，溶于蒸儲水并定容至100mL,使用時再稀釋10倍（100g/mL）。3 .慈酮試劑：稱取1.0g慈酮，溶于80%濃硫酸（將98%濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸播水中）1000mL中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶內(nèi)，冰箱保存，

4、可使用23周c（三）儀器設(shè)備分光光度計，分析天平，離心管，離心機，恒溫水浴，試管，三角瓶，移液管（5、1、0.5mL）,剪刀，瓷盤，玻棒，水浴鍋，電爐，漏斗，濾紙。三、實驗步驟1 .樣品中可溶性糖的提取稱取剪碎混勻的新鮮樣品0.51.0g（或干樣粉末5100mg）,放入大試管中，加入15mL蒸播水，在沸水浴中煮沸20min,取出冷卻，過濾入100mL容量瓶中，用蒸儲水沖洗殘渣數(shù)次，定容至刻度。2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支大試管，從05分別編號，按表24-1加入各試劑。表24-1慈酮法測可溶性糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量試劑管號012345100gg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0

5、蒸播水（mL）1.00.80.60.40.20患酮試劑（mL）5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量（rg）020406080100將各管快速搖動混勻后，在沸水浴中煮10min,取出冷卻，在620nm波長下，用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，含葡萄糖量（心g）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 .樣品測定取待測樣品提取液1.0mL加慈酮試劑5mL,同以上操作顯色測定光密度。重復(fù)3次。四、結(jié)果計算式中：C從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖量，ag。V T樣品提取液總體積，mLOV 1顯色時取樣品液量，mL。W樣品重（g）。n苯酚法測定可溶性糖一、原理植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯

6、酚法測定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上。二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實驗材料新鮮的植物葉片。（二）試劑1. 90%苯酚溶液：稱取90g苯酚（AR）,加蒸儲水溶解并定容至100mL,在室溫下可保存數(shù)月。2. 9%苯酚溶液：取3mL90%苯酚溶液，加蒸儲水至30mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。3. 濃硫酸（

7、比重1.84）。4. 1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：將分析純蔗糖在80C下烘至恒重，精確稱取1.000g,加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸儲水定容至刻度。5. 100ag/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液：精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液lmL加入100mL容量瓶中，加蒸播水定容。（三）儀器設(shè)備分光光度計，電爐，鋁鍋，20mL刻度試管，刻度吸管5mL1支、lmL2支，記號筆，吸水紙適量。三、實驗步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取20mL刻度試管11支，從010分別編號，按表24-2加入溶液和水，然后按順序向試管內(nèi)加入1mL9%苯酚溶液，搖勻，再從管液正面以520s時間加入5mL濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8mL,

8、在室溫下放置30min,顯色。然后以空白為參比，在485nm波長下比色測定，以糖含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)直線方程。表24-2苯酚法測可溶性糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量試劑管號01、23、45、67、89、10100ag/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.40.60.81.0蒸播水（mL）2.01.81.61.41.21.0蔗糖量（心g）0204060801002 .可溶性糖的提取取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10.3g,共3份，分別放入3支刻度試管中，加入510mL蒸播水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)

9、沖洗試管及殘渣，定容至刻度。3 .測定吸取0.5mL樣品液于試管中（重復(fù)2次），加蒸儲水1.5mL,同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色并測定光密度。由標(biāo)準(zhǔn)線性方程求出糖的量，計算測試樣品中糖含量。四、結(jié)果計算可溶性糖含量（）=式中：C標(biāo)準(zhǔn)方程求得糖量，flg。V T提取液體積，mL。V 1吸取樣品液體積，mL。W組織重量，g。5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖、原理3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖（各種單糖和麥芽糖）溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色物的顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系。在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的消光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線

10、，便可求出樣品中還原糖的含量。二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實驗材料食用面粉。（二）試劑1. 1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80C烘干至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸儲水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸播水定容至刻度，搖勻，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?. 3,5-二硝基水楊酸試劑：3,5-二硝基水楊酸6.3g,2mol/L的NaOH溶液262mL,加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸儲水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。（三）儀器設(shè)備離心機，電子天平，分光光度計，大離心管或玻璃漏斗，1

11、00mL燒杯，100mL三角瓶，刻度試管，刻度吸管1、2、10mL,沸水浴，容量瓶。三、實驗步驟1 .制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支具有25mL刻度的刻度試管，編號，按表243所示的量，精確加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑。表24-3繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量試劑管號01234561mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.40.60.81.01.2蒸播水（mL）2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水楊酸試劑（mL）1.51.51.51.51.51.51.5相當(dāng)于葡萄糖量（mg）00.20.40.60.81.01.2將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min

12、,取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸播水定容至25mL刻度處，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻（如用大試管，則向每管加入21.5mL蒸播水，混勻）。在540nm波長下，用0號管調(diào)零，分別讀取16號管的消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程。2 .樣品中還原糖的測定（1）樣品中還原糖的提取準(zhǔn)確稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中，先以少量蒸儲水調(diào)成糊狀，然后加50mL蒸播水，攪勻，置于50C恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。離心或過濾，用20mL蒸儲水洗殘渣，再離心或過濾，將兩次離心的上清液或濾液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸儲水定容至

13、刻度，混勻，作為還原糖待測液。（2）顯色和比色取3支25mL刻度試管，編號，分別加入還原糖待測液2mL,3,5-二硝基水楊酸試劑1.5mL,其余操作均與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，測定各管的消光值。分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)還原糖毫克數(shù)，計算還原糖百分含量。四、結(jié)果計算式中：C標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的還原糖量，mgVT提取液的體積，mLoV1顯色時吸取樣品液體積,mLW樣品重，gIV斐林試劑比色法測定還原糖、原理和非還原糖(主要是蔗糖)兩類。Cu2+還原成Cu+,使藍590nm波長下比色測定吸光度,植物組織中的可溶性糖可分為還原糖(主要是葡萄糖和果糖)還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸，能把斐林試劑中的色的

14、斐林試劑脫色，脫色的程度與溶液中含糖量成正比，在查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算出所測樣品中還原糖的含量。本方法也可用于測定蔗糖及總糖含量二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備(一)實驗材料新鮮植物樣品或烘干粉碎過的植物樣品。(二)試劑1,斐林試劑A液：40gCuSO4-5H2O溶解于蒸播水定容至1000mL。2,斐林試劑B液：200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6-5H2O)與150gNaOH溶于蒸播水中，并定容至1000mL。A、B兩液分別貯存，使用前等體積混合。3. 0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：取80C下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸播水溶解，定容至100mL4. 0.1mol/LNaOH5. 甲基紅指示劑：

15、0.1g甲基紅溶于250mL60%乙醇中。6. 10%Pb(Ac)2。7,飽和Na2SO4。(三)儀器設(shè)備分光光度計，分析天平，離心機，水浴鍋，具塞刻度試管，刻度吸管，容量瓶，研缽。三、實驗步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支試管，按表244分別加入各溶液。表24-4還原性糖測定時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量試劑管號01234560.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)0123456蒸播水(mL)6543210每管含葡萄糖量(mg)0123456斐林試劑(mL)4444444將以上各管混合后加塞，于沸水浴中加熱15min。取出后自來水冷卻，1500r/min離心15min。取上清液，用分光光度計在590nm波長下比色，

16、以蒸播水作對照，讀取吸光度。用空白管的吸光度與不同濃度糖的各管的吸光度之差為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的糖含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品中還原糖的提取取新鮮的植物樣品洗凈、擦干、剪碎，稱取3.00g,放入研缽中研磨至糊狀，用水洗入大試管中。體積為1015mL時，加23滴甲基紅指示劑，如呈紅色，可用0.1mol/L的NaOH中和至微黃色。若用風(fēng)干樣品，可稱取干粉3.00g,先在燒杯中用少量水濕潤，然后用水洗入250mL容量瓶中，如顯酸性，可用上法中和。將大試管置于80C的恒溫水浴中保溫30min,其間搖動數(shù)次，以便將還原糖充分提取出來。對含蛋白質(zhì)較多的樣品，此間可加10%Pb(Ac)2,除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時，加飽和Na2SO4除去